周麗珍，黃 成，丁煒煒

(廣東省韶關(guān)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心站， 廣東 韶關(guān) 512000)

隨著社會和工業(yè)的發(fā)展，越來越多的有機污染物排入水體中。五日生化需氧量(Five-day biochemical oxygen demand簡稱BOD5)是指水樣充滿在密閉水封的溶解氧瓶中，在(20±1)℃恒溫下暗處培養(yǎng)5 d，然后分別測量第一天和第五天水樣中溶解氧濃度差，即為BOD5值[1-2]。BOD5作為綜合反映有機污染物污染情況的一項重要指標，能相對表示微生物可氧化有機污染物的含量。因此BOD5是環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域必測指標，也是污水治理領(lǐng)域重要的污染控制指標[3-4]。目前，分析測試BOD5的方法主要包括：稀釋接種法、無汞差壓法、微生物傳感器法、活性污泥曝氣降解法和重鉻酸鉀紫外光度法等[5]。在所有的分析方法中，稀釋接種法，即《水質(zhì) 五日生化需氧量(BOD5)的測定稀釋與接種法》(HJ505-2009)是BOD5監(jiān)測的經(jīng)典方法，也是環(huán)境監(jiān)測系統(tǒng)內(nèi)仲裁分析、能力驗證、比對考核、采測分離等工作采用的方法[1,6]。因此本文采用稀釋接種法進行BOD5分析測試工作。稀釋接種法實驗過程，實際上就是微生物氧化分解有機物并消耗氧氣的過程。對于不含微生物或微生物含量較小的樣品，如高溫廢水、滅菌出口水或者標準樣品等，均需要接種外界微生物，來對有機物進行分解。因此接種液是分析BOD5的技術(shù)關(guān)鍵[7-8]。許雪瑩[9]、王興力[10]研究了土壤浸出溶液、洗米水、生活污水、廢水和經(jīng)過馴化微生物的廢水，分別作為接種液，對BOD5標準溶液進行測試，發(fā)現(xiàn)，導致BOD5測試結(jié)果不穩(wěn)定的因素之一就是接種液中微生物的種類和數(shù)量不確定性。Fitzmauric G. D[11]、Itsusei Fujita[12]采用已知微生物種類和數(shù)量的標準化混合菌株對BOD5標準溶液進行測試，結(jié)果均合格，而且數(shù)據(jù)結(jié)果的精密度和穩(wěn)定性均比江河湖水等非標準菌株接種液有顯著提升。為此，本實驗室對5種不同接種液(自行培養(yǎng)的污泥菌種、污水廠未滅菌出口水、某研究所BOD5專用接種液、EM 菌種和哈希菌種)進行實驗分析，以期找到一種穩(wěn)定、高效且具有一定推廣性的接種液，從而大大提高BOD5實驗效率和成功率。

1 接種液來源與前處理

本實驗室使用的5種接種液如下：

1)本實驗室自行培養(yǎng)的污泥菌種：具體配置方法和前處理見文獻[13] ；2)污水廠未滅菌出口水：取韶關(guān)市某污水廠沉淀池之后出水口之前環(huán)節(jié)，即進入滅菌工序之前的污水，可直接作為接種液使用。使用時，按照1 L稀釋水中加入20 mL污水廠未滅菌出口水的比例進行接種。3)某研究所BOD5專用接種液(以下簡稱某研究所BOD5接種液)：取土壤 100 g，加入1 L純水，混合攪拌，靜置 10 min；取上清液10 mL，用純水稀釋至1 L。使用時按照1 L稀釋水中加入 4 mL 接種液的比例進行接種；4) EM菌種：主要成分為枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和酵母菌等多種益生菌、酶制劑及微量元素，可直接在市場購買作為接種液使用。使用時，按照1 L稀釋水中加入0.5 mL EM菌種的比例進行接種。5) 哈希菌種(POLYSEED)：該菌種為一種廣譜細菌的混合物，產(chǎn)自美國，可直接在市場購買。

哈希菌種前處理方法：一顆膠囊打開，倒入1 L燒杯中，再倒入500 mL已恒溫到20℃純水，之后邊攪拌邊按照1 mL/L比例分別加入稀釋接種法中硫酸鎂、氯化鈣、氯化鐵和磷酸鹽緩沖溶液[1]。加入攪棒子，放于磁力攪拌器上，1 L燒杯和磁力攪拌器均放入恒溫培養(yǎng)箱中，然后進行曝氣1 h。曝氣后靜置 0.5 h ,然后倒出上清液于棕色廣口瓶，并放置于4℃冰箱保存。使用時，按照1 L稀釋水中加入20 mL接種液的比例進行接種。

2 實驗器材和步驟

2.1 實驗器材

溶解氧分析儀：產(chǎn)自德國，型號YSI 4010-1W；恒溫培養(yǎng)箱：國產(chǎn)，型號DWRH-500P，使用溫度(20±1)℃；溶解氧瓶：帶水封裝置，容積 250～300 mL；稀釋容器：1000 mL 的容量瓶；稀釋水配置容器：10 L白色塑料罐，自帶水龍頭和出水口橡膠管；曝氣裝置：多通道氧氣泵。

2.2 實驗步驟

1)純水恒溫：用白色塑料桶接一定量的純水，放置在恒溫培養(yǎng)箱恒溫到20℃；

2)配置稀釋水：使用前控制初始溶解氧質(zhì)量分數(shù)大于8 mg/L。若初始溶解氧質(zhì)量分數(shù)低于8 mg/L時，可以通過曝氣幾分鐘來提高溶解氧含量；若初始溶解氧過飽和時，可以使用熱得快加熱幾分鐘趕出過飽和溶解氧即可。之后，邊攪拌邊按照1 mL/L比例分別加入稀釋接種法中硫酸鎂、氯化鈣、氯化鐵和磷酸鹽緩沖溶液四種營養(yǎng)液。

3)稀釋接種標準樣品：測CODcr值，結(jié)合稀釋接種法中推薦的比例，確定稀釋倍數(shù)。在1 L容量瓶中稀釋接種后，分裝到帶水封裝置的溶解氧瓶中。

4)測量培養(yǎng)前和培養(yǎng)后的溶解氧含量：預熱并校準溶解氧儀，探頭插入溶解氧瓶中，測量數(shù)據(jù)，計算BOD5值。

3 結(jié)果與討論

3.1 篩選接種液

為避免水樣中不確定因素的干擾，本實驗采用5種不同接種液均對相對低、中、高濃度的標準樣品(環(huán)保部的)進行接種測試。相對低、中、高濃度的標樣分別為編號200249(30.7±4.7 mg/L)、編號200253(82.3±5.9 mg/L)和編號200260(114±8 mg/L)。同時，每種接種液類型均分析了兩個接種比例。結(jié)果見表1～表3

表1 環(huán)保部BOD5標準樣品200249 (30.7±4.7 mg/L) 測試結(jié)果

由表1～表3可知，某研究所BOD5接種液分別測試質(zhì)量濃度為30.7±4.7 mg/L、82.3±5.9 mg/L和114±8 mg/L的環(huán)保部的標準樣品均不合格，測試結(jié)果均偏低，且隨著標準樣品濃度越高，偏離合格范圍越遠；EM 菌種對三種濃度標樣測試結(jié)果也是偏低，且也是隨著標準樣品濃度越高，偏離合格范圍越遠；自行培養(yǎng)的污泥菌種、污水廠未滅菌出口水和哈希菌種對三種標準樣品測試結(jié)果均在合格范圍內(nèi)，且相對標準偏差在0.9%～2.5%范圍內(nèi)。稀釋接種法中，對于缺少微生物的試樣中，接種液的質(zhì)量是影響B(tài)OD5準確度的重要因素[14]，而接種液的質(zhì)量主要包括接種液中微生物的種類、活性和量。本實驗中，5種接種液均采用了兩個梯度的接種量，每種接種液的兩個梯度接種量測試BOD5結(jié)果均接近，因此推測在本次實驗中接種液的接種量不是影響接種效果的主要因素，接種液中微生物的種類和活性是才是接種效果的決定因素。當接種液中微生物種類結(jié)構(gòu)對營養(yǎng)物質(zhì)缺乏分解能力或者微生物活性不夠時，則無法分解營養(yǎng)物質(zhì)消耗溶解氧，導致結(jié)果偏低。尤其是，使用的標準樣品的濃度越高，對微生物活性需求就越高，測試結(jié)果就可能出現(xiàn)偏低程度越大的情況。例如，某研究所BOD5專用接種液和EM菌的數(shù)據(jù)。因此，本次接種液篩選出的有效菌種為自行培養(yǎng)的污泥菌種、污水廠未滅菌出口水和哈希菌種，無效菌種為某研究所BOD5專用接種液和EM 菌種。

表2 環(huán)保部BOD5標準樣品200253 (82.3±5.9mg/L) 測試結(jié)果

表3 環(huán)保部BOD5標準樣品200260(114±8mg/L) 測試結(jié)果

3.2 篩選出的有效接種液接種廢水效果

采用以上篩選出的三種有效菌種(自行培養(yǎng)的污泥菌種、污水廠未滅菌出口水和哈希菌種)對韶關(guān)市某生活污水處理廠的進口廢水進行接種，初步探索各菌種接種后對污水廠進口廢水BOD5分析測試效果。結(jié)果見表4。

表4顯示，3種接種液的實驗室空白均小于1.5 mg/L，符合方法要求;BOD5測試質(zhì)量濃度范圍在69.4～73.0 mg/L,總平均值為71.5 mg/L，總相對標準偏差為1.8%，說明3種不同接種液接種后，污水廠進口廢水的BOD5值相差不大。哈希菌種接種后廢水的BOD5測試相對偏差為0.8%，低于自行培養(yǎng)的污泥菌種和污水廠未滅菌出口水接種后的相對偏差，說明哈希菌種接種后韶關(guān)市某污水處理廠進口廢水BOD5測試數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性和精密度均要高于自行培養(yǎng)的污泥菌種和污水廠未滅菌出口水接種液。

表4 韶關(guān)市某污水處理廠進口廢水BOD5測試結(jié)果

3.3 有效接種液優(yōu)缺點對比

自行培養(yǎng)的污泥菌種是本實驗室對活性污泥持續(xù)進行培養(yǎng)得到的,優(yōu)點在于培養(yǎng)地點在實驗室環(huán)境內(nèi)，可以隨用隨取，使用方便，而且菌種濃度和種類在一段時間內(nèi)相對穩(wěn)定，因此接種量相對固定。然而在有限的空間和營養(yǎng)物質(zhì)的條件下，自行培養(yǎng)的污泥菌種雖然能自行繁殖，不斷更新?lián)Q代，但是存在壽命限制，通常只能培養(yǎng)并使用一段時間就需要更換污泥。其次，培養(yǎng)污泥菌種需持續(xù)曝氣并每天供應營養(yǎng)瓊脂，在一定程度上，也增加實驗人員的工作量。

污水廠未滅菌出口水是直接從污水廠沉淀池的出口接取的水。該水取回即可進行接種，直接測試BOD5，無需再進行前處理，使用方便，但是每次實驗前均需外出污水廠取水，需要較大的人力物力，且隨著污水廠進口水質(zhì)的濃度不同以及下雨等不可控因素，每次污水廠未滅菌出口水的菌種濃度有所變化，因此在一定程度上會影響菌種接種量，從而影響B(tài)OD5的成功率。

哈希菌種實際上是菌種制成的凍干粉，保存時間可以長達2年。每次使用前只需將凍干菌種按照以上操作步驟進行活化，活化后即可直接進行接種。該菌種的濃度和種類都是固定的，因此接種量不受菌種本身影響。相比于自行培養(yǎng)的污泥菌種和污水廠未滅菌出口水，哈希菌種保存時間長，菌種穩(wěn)定性好，濃度和種類均不受時間和外界因素影響，可以隨用隨取，操作簡單，不用增加額外的人力物力，同時，方便攜帶，具有一定的推廣性和復制性，在一定程度上可作為同行實驗人員測試BOD5優(yōu)先考慮的接種液對象。

4 結(jié)論

本實驗室使用5種不同接種液(自行培養(yǎng)的污泥菌種、污水廠未滅菌出口水、某研究所BOD5專用接種液、EM 菌種和哈希菌種)測試BOD5，得到有效接種液有三種，分別為自行培養(yǎng)的污泥菌種、污水廠未滅菌出口水和哈希菌種，無效菌種為某研究所BOD5專用接種液和EM 菌種。使用篩選出的三種有效接種液對相對低、中、高濃度的環(huán)保部的標準樣品和某污水處理廠進口廢水進行接種并測試BOD5，結(jié)果顯示，在所有接種液中，哈希菌種是相對更高效、穩(wěn)定和便捷性的接種液，且具有一定的推廣性，建議作為同行實驗人員測試BOD5可優(yōu)先考慮的接種液。