王建文，常 樂(lè)，谷 濤，李東初，王珍珍，陳桂生

肝豆?fàn)詈俗冃?HLD)，又名威爾遜病(WD),1912年，英國(guó)神經(jīng)學(xué)家威爾遜首次報(bào)道，ATP7B基因突變是直接原因，該基因的突變導(dǎo)致循環(huán)中銅量的增加[1]，使其沉積在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肝臟及角膜[2]，引起肝功能、神經(jīng)功能缺損及角膜K-F環(huán)。其發(fā)病年齡存在顯著差異，在3歲及80歲均有病例報(bào)道[3]，由于臨床癥狀的多樣性以及基因的不完全外顯性，往往導(dǎo)致誤診甚至漏診，據(jù)報(bào)道平均延遲診斷4年[4]。目前對(duì)于癥狀前患者，ATP7B基因測(cè)序可能是唯一診斷的工具。近年來(lái)，隨著第二代DNA測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的錯(cuò)義和同義突變被相繼報(bào)道，正確識(shí)別同義突變對(duì)疾病的早期診斷、治療及預(yù)防具有重要意義。最近,Wang等人[5]研究表明,同義突變c.4014T>A和錯(cuò)義突變R919G，可導(dǎo)致ATP7B基因轉(zhuǎn)錄本中外顯子跳躍，形成截?cái)嗟牡鞍踪|(zhì)，進(jìn)一步提高了對(duì)WD發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)。本研究分析了一例臨床診斷肝豆?fàn)詈俗冃曰颊?，?duì)先癥者及其家系內(nèi)成員ATP7B基因進(jìn)行了測(cè)序，探討突變位點(diǎn)的臨床意義，分析了致病基因在該家系的遺傳規(guī)律。

1 資料與方法

1.1 一般資料:選取2020年4月就診于寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科門診的1例以“頭部不自主抖動(dòng)”為首發(fā)癥狀的青年女性患者，評(píng)估臨床癥狀，完善銅生化檢測(cè)及顱腦磁共振，根據(jù)萊比錫評(píng)分[6]臨床診斷WD，對(duì)先證者及其家系內(nèi)成員(母親、同胞及其先證者子女，本研究中對(duì)先證者妹妹，根據(jù)年齡大小，分別為大妹及小妹)進(jìn)行ATP7B基因測(cè)序。因患者父親去世，未完成基因測(cè)序，其父親死亡原因?yàn)榧毙孕募」Ｋ?，生前無(wú)WD相關(guān)臨床癥狀。本研究根據(jù)是否出現(xiàn)臨床癥狀，繪制系譜圖。

1.2 研究方法:根據(jù)赫爾辛基宣言，征得患者及其家屬同意后，簽署知情同意書(shū)，并經(jīng)寧夏醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后，采用第二代DNA測(cè)序方法，對(duì)先證者、母親及小妹行ATP7B基因直接測(cè)序，對(duì)患者大妹、弟弟及患者子女行候選突變位點(diǎn)驗(yàn)證。

1.2.1 ATP7B基因測(cè)序:充分告知患者及家屬后，給予EDTA抗凝采血管采集研究對(duì)象外周靜脈血5 mL，-20 ℃保存，送至寧夏金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所，通過(guò)nexSeq 500及PCR儀ABI9700完成測(cè)序。本方法僅能檢測(cè)到外顯子編碼區(qū)及內(nèi)含子-外顯子交界處突變，可能漏檢約2%的突變。PCR產(chǎn)物采用Ampure磁珠進(jìn)行純化，并進(jìn)行Qubit定量，取捕獲后的DNA樣本進(jìn)行Illumina NovaSeq高通量測(cè)序。測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)Illunina Sequence Control Software(SCS)評(píng)估合格后，進(jìn)行數(shù)據(jù)讀取和生物信息學(xué)分析。

1.2.2 候選位點(diǎn)Sanger測(cè)序:對(duì)候基因行Sanger測(cè)序，見(jiàn)表1，驗(yàn)證其準(zhǔn)確性。

表1 ATP7B基因候選突變位點(diǎn)外顯子引物序列

1.2.3 預(yù)測(cè)候選突變位點(diǎn)蛋白質(zhì)功能:根據(jù)生物信息學(xué)分析，錯(cuò)義突變使用PolyPhen-2、SIFT完成突變位點(diǎn)蛋白質(zhì)功能預(yù)測(cè)；同義突變可能影響剪接位點(diǎn)，使用dbscSNV軟件完成突變位點(diǎn)預(yù)測(cè)。

1.2.4 根據(jù)ATP7B基因測(cè)序校正家系系譜圖:根據(jù)ATP7B基因測(cè)序結(jié)果，明確研究對(duì)象是否存在基因突變。

2 結(jié)果

2.1 ATP7B基因測(cè)序:先證者ATP7B基因Exon8 c.2333G>T p.(Arg778Leu) 錯(cuò)義雜合突變，導(dǎo)致778位鳥(niǎo)嘌呤(G)改變?yōu)樾叵汆奏?T),致精氨酸(Arg)改變?yōu)榱涟彼?Leu)；Exon14 c.3243G>A p.(Glu1081=) 同義雜合突變，導(dǎo)致3243位鳥(niǎo)嘌呤(G)改變?yōu)橄汆堰?A),編碼的谷氨酸未發(fā)生變化(參考序列NM_000053.3)，其小妹存在相同突變；其母親存在Exon8 c.2333G>T p.(Arg778Leu) 錯(cuò)義雜合突變，導(dǎo)致778位鳥(niǎo)嘌呤(G)改變?yōu)樾叵汆奏?T),致精氨酸(Arg)改變?yōu)榱涟彼?Leu)(參考序列NM_000053.4)，其弟弟存在相同突變；其女兒存在Exon14 c.3243G>A p.(Glu1081=) 雜合突變，導(dǎo)致3243位鳥(niǎo)嘌呤(G)改變?yōu)橄汆堰?A),編碼的谷氨酸未發(fā)生變化(參考序列NM_000053.3)，其兒子及大妹具有相同突變。家系內(nèi)具體突變位點(diǎn)見(jiàn)表2。

表2 研究對(duì)象ATP7B基因檢測(cè)結(jié)果

2.2 Sanger驗(yàn)證結(jié)果:根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)突變位點(diǎn)進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證，與測(cè)序結(jié)果一致，具體見(jiàn)圖1-圖4(封二)。

2.3 候選突變位點(diǎn)蛋白質(zhì)功能預(yù)測(cè):針對(duì)候選突變位點(diǎn)，使用PolyPhen-2及SIFT，預(yù)測(cè)錯(cuò)義突變c.2333G>T p.(Arg778Leu)的致病性，PoPolyPhen-2預(yù)測(cè)其突變可能帶來(lái)的損害得分為1.000，敏感度為0，特異性為1；SIFT提示該變體得分為-5.644分，該系統(tǒng)默認(rèn)閾值為-2.5分，分?jǐn)?shù)等于或低于-2.5分，有損害；使用dbscSNV對(duì)c.3243G>A P.(Glu1081=)預(yù)測(cè)致病性，該軟件兩種算法分別得分為0.992及0.956，該預(yù)測(cè)軟件結(jié)果分析大于0.6提示影響mRNA剪接，結(jié)果越趨近于1，可能性越大。

2.4 校正家系遺傳系譜:本研究先證者及其小妹均出現(xiàn)WD臨床表現(xiàn)，先證者母親、大妹、弟弟、兒子及其女兒均無(wú)相關(guān)臨床表現(xiàn)，但通過(guò)ATP7B基因測(cè)序，先證者及其小妹均存在兩個(gè)突變，確診為WD患者；其余研究對(duì)象均存在一個(gè)突變位點(diǎn)，為攜帶者，無(wú)相關(guān)臨床表現(xiàn)。

3 討論

肝豆?fàn)詈俗冃?WD)是一種由ATP7B基因突變引起的常染色體隱性疾病[4]，由于ATP7B在肝臟中表達(dá)豐富，是銅積累的主要部位[7]。目前WD的診斷主要根據(jù)臨床癥狀、相關(guān)輔助檢查及ATP7B基因綜合確診,但對(duì)于有家族史患者，突變位點(diǎn)分析是無(wú)癥狀及癥狀前階段診斷的唯一方法。結(jié)合本研究中的家系特點(diǎn)，患者二妹19歲以雙下肢不自主抖動(dòng)起病，未完善基因檢測(cè)。10余年后其姐，也就是本研究中先證者因頭部不自主抖動(dòng)就診，通過(guò)家系內(nèi)ATP7B基因測(cè)序，發(fā)現(xiàn)其母親存在1個(gè)突變位點(diǎn)，呈雜合型，為致病基因的攜帶者，無(wú)臨床表型；先證者及其小妹均存在2個(gè)突變位點(diǎn)，呈隱形純合體，均確診為患者。但在該家系內(nèi)其大妹、子女均檢出一處雜合同義突變，表現(xiàn)為無(wú)臨床表型攜帶者。在本研究中，未能進(jìn)行患者父親基因測(cè)序，但根據(jù)家系內(nèi)成員測(cè)序結(jié)果，我們認(rèn)為c.3243G>A突變來(lái)源于父親，回顧家系內(nèi)測(cè)序結(jié)果符合常染色體隱性遺傳規(guī)律。

目前，ATP7B基因是唯一明確的WD致病基因，大多數(shù)患者是ATP7B致病突變?yōu)榧兒献踊驈?fù)合雜合子，致病突變主要包括錯(cuò)義、無(wú)義、小缺失、小插入和剪接變異體[8]。隨著第二代DNA基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多臨床意義不確定的變異被檢測(cè)出來(lái)[9]，其中同義突變占有相當(dāng)大的比重，人們逐漸認(rèn)識(shí)到，剪接序列以外的剪接錯(cuò)誤是一類重要的致病機(jī)制，尤其是在隱性遺傳性疾病中。本研究中，先證者具有c.2333G>T p.(Arg778Leu) 雜合錯(cuò)義突變和Exon14 c.3243G>A p.(Glu1081=) 雜合同義突變。p.(Arg778Leu)是亞洲人最常見(jiàn)的突變位點(diǎn)，我們使用生物分析工具預(yù)測(cè)其存在致病性。針對(duì)同義突變，該位點(diǎn)于2019年在中國(guó)北方漢族人口中首次報(bào)道[10]，本研究中，我們首次在回族家系內(nèi)檢測(cè)到相同突變，為進(jìn)一步明確該位點(diǎn)臨床意義，我們使用dbscSNV分析工具，其兩種算法預(yù)測(cè)分?jǐn)?shù)均大于0.6，表示此突變位點(diǎn)影響mRNA剪接的可能性大，擬進(jìn)一步行體外驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，但在最近的研究中，Zhou等人[9]研究表明，c.3243G>A)突變位點(diǎn)導(dǎo)致Exon14完全跳躍，阻礙正常的mRNA剪接，進(jìn)一步提供了可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

同義突變通常被認(rèn)為是沉默突變，因不引起編碼氨基酸的變化，往往被人們所忽視。但近年來(lái)的研究表明，脊髓肌萎縮癥[5]等多種疾病可能是通過(guò)外顯子跳躍而致病。本研究中，c.3243G>A位于外顯子14的最后一個(gè)堿基[9]，通過(guò)破壞剪接調(diào)節(jié)元件(SREs)而導(dǎo)致mRNA的異常剪接，引起外顯子跳躍，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究，所以外顯子的跳躍可能是該家系致病的另一種機(jī)制。

對(duì)于常染色體隱性遺傳，受孕個(gè)體50%的概率為無(wú)癥狀的攜帶者，WD患者其后代罹患該病存在0.5%的風(fēng)險(xiǎn)[11]。本研究中，家系內(nèi)成員均檢測(cè)到突變位點(diǎn)，其子女為無(wú)癥狀攜帶者，在未來(lái)的遺傳中，應(yīng)再次避免攜帶者，降低家系內(nèi)患病人數(shù)。我們?cè)谂R床診療過(guò)程中發(fā)現(xiàn)ATP7B突變位點(diǎn)，須對(duì)其親屬進(jìn)行基因篩查，并進(jìn)行產(chǎn)前檢測(cè)和孕前基因檢測(cè)，以減少威爾遜病傳播的風(fēng)險(xiǎn)。