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        lncRNA HULC對(duì)肝癌細(xì)胞miRNA差異表達(dá)譜及ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的影響

        2022-06-17 10:25:02關(guān)璐璐韓松峰李世朋王夢(mèng)姣邵曉亞喬兵兵席守民
        關(guān)鍵詞:定量測(cè)序熒光

        關(guān)璐璐, 韓松峰, 李世朋, 王夢(mèng)姣, 邵曉亞, 喬兵兵, 席守民

        肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是全球發(fā)病率排名第六,病死率排名第二的惡性腫瘤[1]。HCC細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是影響HCC治療療效的重要因素[2]。因此,挑選鑒定HCC侵襲和轉(zhuǎn)移新靶點(diǎn)對(duì)于前期診斷、選擇治療方式及評(píng)估預(yù)后極為重要[3]。高通量RNA測(cè)序技術(shù)以高通量、低成本、高精確度[4]、信息量豐富等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于白血病、乳腺癌[5]等疾病的臨床研究,在追蹤細(xì)胞譜系、揭露腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性、探究腫瘤演變復(fù)雜機(jī)制的研究中發(fā)揮著重要作用[6]。肝癌高表達(dá)轉(zhuǎn)錄本(highly up-regulated in liver cancer,HULC)作為長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding ribonucleic acids,lncRNAs)的一員[7],可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[8]和血管的生成[9]。因此,異常表達(dá)的lncRNA HULC與HCC細(xì)胞的分化、增殖和侵襲功能相關(guān)[10]。關(guān)于lncRNA HULC對(duì)HCC細(xì)胞微小RNA(micro ribonucleic acid,miRNA)差異表達(dá)譜及競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)源性RNA(competitive endogenous RNA,ceRNA)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的影響研究較少。鑒此,本研究通過分析敲低lncRNA HULC,研究HCC的差異表達(dá)miRNA和ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò),探索其在HCC發(fā)生、發(fā)展過程中的作用和意義?,F(xiàn)報(bào)道如下。

        1 材料與方法

        1.1材料

        1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 選擇人HCC細(xì)胞株BEL-7402作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,購(gòu)自豐暉生物科技有限公司。

        1.1.2 主要試劑 LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。高糖培養(yǎng)基DMEM購(gòu)于CORNING公司。引物合成于上海生工有限公司??俁NA提取試劑盒購(gòu)于上海Promega公司。cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Novoprotein公司。miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa生物公司。

        1.2方法

        1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 使用含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基作為完全培養(yǎng)基對(duì)BEL-7402細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)箱條件設(shè)置為37 ℃、5% CO2。根據(jù)LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書,將siRNA[si-NC(對(duì)照組)和si-HULC(模型組)]轉(zhuǎn)染至BEL-7402細(xì)胞。將非靶向siRNA(si-NC)作陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染至BEL-7402細(xì)胞。培養(yǎng)箱中孵育6 h,轉(zhuǎn)染后更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞備檢。

        1.2.2 miRNA高通量測(cè)序 對(duì)BEL-7402細(xì)胞進(jìn)行前期處理,提取RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,PCR擴(kuò)增,經(jīng)文庫(kù)質(zhì)檢后上機(jī)測(cè)序。并對(duì)測(cè)序的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估,以得到高質(zhì)量數(shù)據(jù)。上機(jī)測(cè)序由上海生工公司進(jìn)行。通過DESeq2網(wǎng)站對(duì)有差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行基因集合(Gene Ontology,GO)分析,通過miRDeep2軟件對(duì)新miRNA進(jìn)行預(yù)測(cè)。

        1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 提取BEL-7402細(xì)胞的總RNA,應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將所得總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)lncRNA HULC及目的miRNA的表達(dá),引物序列見表1。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μl,其中cDNA按照1∶4稀釋后取5 μl,2×SYBR預(yù)混合物10 μl,無RNA酶水5 μl,正、反向引物各0.4 μl。擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)條件:95 ℃ 5 min,95 ℃ 20 s,60 ℃ 40 s,擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。以GAPDH和U6為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法計(jì)算lncRNA HULC及miRNA的相對(duì)表達(dá)量。

        表1 引物序列

        2 結(jié)果

        2.1細(xì)胞模型構(gòu)建結(jié)果 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示,經(jīng)轉(zhuǎn)染si-HULC后,模型組lncRNA HULC的表達(dá)水平較對(duì)照組顯著降低,提示細(xì)胞模型構(gòu)建成功。見圖1。

        圖1 兩組HULC表達(dá)水平圖

        2.2差異表達(dá)miRNA的篩選及新miRNA預(yù)測(cè)結(jié)果 以P<0.05且|log2fold change|≥2為標(biāo)準(zhǔn),挑選到具有顯著表達(dá)差異的miRNA 9個(gè)。其中,表達(dá)水平顯著升高的miRNA有4個(gè),表達(dá)水平顯著降低的miRNA有5個(gè)。見表2,圖2。

        表2 9個(gè)表達(dá)差異顯著的miRNA

        橫向坐標(biāo)為遺傳因子在不同組樣本間的差異性表達(dá)倍數(shù)fold change[log(B/A)]值,縱向坐標(biāo)代表遺傳因子表達(dá)量變化的統(tǒng)計(jì)顯著性程度,P value越小,-log(P value)越大,差異越明顯。圖中的每個(gè)點(diǎn)分別代表一個(gè)遺傳因子,其中紅色表示遺傳因子上調(diào),綠色表示遺傳因子下調(diào),黑色表示非差異遺傳因子

        2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證差異miRNA表達(dá)結(jié)果 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示,所篩選得的差異miRNAs:hsa-let-7i-3p、hsa-miR-122-5p、hsa-miR-143-3p、hsa-miR-214-3p、hsa-miR-3200-5p、hsa-miR-34c-5p、hsa-miR-548q在兩組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

        圖3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證差異miRNA表達(dá)圖

        2.4新miRNA預(yù)測(cè)結(jié)果 基于參考基因組,使用miRDeep2軟件進(jìn)行新miRNA預(yù)測(cè),miRDeep2打分,分值越高結(jié)果越好。得分前15的新miRNA預(yù)測(cè)結(jié)果見表3。

        2.5差異miRNA靶基因功能富集分析結(jié)果 結(jié)果顯示,表達(dá)下調(diào)的miRNA的靶基因的分子功能與絲氨酸t(yī)RNA連接酶活性、蛋白激酶活性、陽離子通道活性、14-3-3蛋白結(jié)合、鈣轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶活性等有關(guān);表達(dá)上調(diào)的miRNA的靶基因與硒代半胱氨酸裂解酶活性、維生素B6結(jié)合、過氧化物酶體機(jī)制靶向信號(hào)1結(jié)合、鎳陽離子結(jié)合、過氧化物酶體靶向序列結(jié)合、蛋白質(zhì)N-末端結(jié)合、腫瘤壞死因子受體超家族結(jié)合等有關(guān)。見圖4,5。

        2.6miRNA-靶基因互作網(wǎng)絡(luò)圖 互作網(wǎng)絡(luò)圖結(jié)果顯示,hsa-let-7i-3p分別與基因ENSG00000140368、ENSG00000132507、ENSG00000182606等7個(gè)基因之間存在互作關(guān)系。hsa-miR-122-5p分別與ENSG00000088876、ENSG00000137944、ENSG00000131899等7個(gè)基因之間存在互作關(guān)系。hsa-miR-143-3p與基因ENSG00000090863和ENSG00000115159之間存在互作關(guān)系。hsa-miR-214-3p分別與ENSG00000090863、ENSG00000115159、ENSG00000075340等34個(gè)基因之間存在互作關(guān)系。見圖6。

        2.7差異表達(dá)miRNA的靶基因功能富集關(guān)聯(lián)分析結(jié)果 靶基因功能富集關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示,GO:0021759功能富集程度高與差異miRNA的靶基因ENSG00000080815、ENSG00000139197、ENSG00000096093等關(guān)聯(lián)性強(qiáng)。GO:0070588功能富集程度高與差異miRNA的靶基因ENSG00000196296、ENSG00000074370、ENSG00000155886等關(guān)聯(lián)性強(qiáng)。見圖7。

        表3 新miRNA預(yù)測(cè)統(tǒng)計(jì)表

        ?表達(dá)下調(diào)miRNA;?表達(dá)上調(diào)miRNA。橫向坐標(biāo)為功能分類,縱向坐標(biāo)為該分類內(nèi)遺傳因子數(shù)量(右)及其占被注釋上遺傳因子總數(shù)量的百分比(左)。不同功能分別采用顏色差異區(qū)分(藍(lán)色:分子功能。綠色:細(xì)胞成分。紅色:生物過程)。

        ?表達(dá)下調(diào)的miRNA;?表達(dá)上調(diào)的miRNA。功能注釋信息用縱向坐標(biāo)表示,功能相對(duì)應(yīng)的rich factor(注釋到該功能的差異的遺傳因子數(shù)目比注釋到該功能的遺傳因子數(shù)目)用橫向坐標(biāo)表示,用點(diǎn)的顏色來表示Q value的大小,顏色越接近紅色表明Q value越小,用點(diǎn)的大小對(duì)每個(gè)功能所涵蓋的差異的遺傳因子的多少進(jìn)行表示。

        圖中靶基因用方形節(jié)點(diǎn)表示,miRNA用圓形節(jié)點(diǎn)表示,靶基因與miRNA的關(guān)聯(lián)性以邊表示。節(jié)點(diǎn)的大小與該節(jié)點(diǎn)的度值(degree)呈正比,即節(jié)點(diǎn)越大,與此節(jié)點(diǎn)相連的邊越多。

        圖中圓形節(jié)點(diǎn)為功能信息,邊代表功能間的關(guān)聯(lián)性。節(jié)點(diǎn)的顏色代表功能的富集程度即P value值,富集程度越高,P value值越低,相應(yīng)顏色越深。

        3 討論

        近年來研究顯示,lncRNA已經(jīng)成為研究生物標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)的關(guān)鍵點(diǎn)[11]。有研究表明,在lncRNA、mRNA、miRNA組成的ceRNA網(wǎng)絡(luò)中,lncRNA可充當(dāng)ceRNAs網(wǎng)絡(luò)的分子海綿[12]與miRNA互相通信,協(xié)同調(diào)節(jié)mRNA與其靶基因的表達(dá)[13]。lncRNA不僅在HCC中表達(dá)上調(diào)[14],在其他癌癥如骨肉瘤[15]、鼻咽癌[16]、乳腺癌[17]和卵巢癌[18]等中也呈高表達(dá)。miRNA是內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA[19],其與靶基因mRNA的3′端結(jié)合,導(dǎo)致其降解或抑制其翻譯,完成對(duì)遺傳因子轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控[20]。本實(shí)驗(yàn)通過高通量測(cè)序?qū)θ薍CC細(xì)胞系BEL-7402敲低lncRNA HULC后差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行分析,并預(yù)測(cè)新miRNA,對(duì)其靶基因富集進(jìn)行GO分析。miRNA作為疾病生物標(biāo)志物與疾病的發(fā)生具有高度關(guān)聯(lián)性,hsa-let-7i-3p與結(jié)直腸癌的血清外泌體環(huán)橋粒相關(guān)蛋白(pinin,PNN)的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)[21]。因此,提示hsa-let-7i-3p可能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。在肝細(xì)胞中,hsa-miR-122-5p可以下調(diào)三?;视?triacylglycerol,TAG)通路基因CTDNEP1[22]。并且,hsa-miR-122-5p/lncRNA X染色體特異性轉(zhuǎn)錄子(X-inactive specific transcript,XIST)路徑可調(diào)節(jié)腎移植急性腎損傷中反沉默作用蛋白1A(anti-silencing function 1A,ASF1A)的表達(dá)。另外,有研究表明,hsa-miR-122-5p作為lncRNA XIST的分子海綿調(diào)節(jié)腎移植、急性腎損傷中組織ASF1A的表達(dá)[23]。有研究表明,環(huán)狀RNA circCSNK1G3/hsa-miR-143-3p/同源椎基因A10(homeobox A10,HOXA10)路徑可介導(dǎo)肺腺癌的發(fā)生發(fā)展[24]。lncRNA XIST結(jié)合hsa-miR-214-3p對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞產(chǎn)生抗癌作用[25]。lncRNA HCP5在HCC中高表達(dá),并通過miR-214-3p/肝癌衍生生長(zhǎng)因子(hepatoma-derived growth factor,HDGF)路徑參與吉西他濱耐藥及細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移過程[26]。因此,hsa-miR-214-3p在癌細(xì)胞的生物學(xué)功能方面發(fā)揮著重要作用。另外,miR-3200-5p在肺癌患者中高表達(dá)[27]。miR-3200-5p/乳腺癌轉(zhuǎn)移抑制因子1(breast cancer metastasis suppressor 1,BRMS1)路徑,在骨肉瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移方面具有重要意義[28]。hsa-miR-34a及hsa-miR-34b/c位點(diǎn)可被p53激活[29],在腫瘤中實(shí)現(xiàn)細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡。前期這些研究進(jìn)一步證實(shí)了本研究篩選的差異表達(dá)miRNA可影響腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。但這些miRNA在HCC中的調(diào)控機(jī)制仍不明確,需要進(jìn)一步研究。

        綜上所述,hsa-let-7i-3p、hsa-miR-122-5p、hsa-miR-143-3p、hsa-miR-214-3p、has-miR-3200-5p等對(duì)HCC的發(fā)生、增殖及轉(zhuǎn)移可能具有調(diào)節(jié)作用,值得進(jìn)一步深入探究。新預(yù)測(cè)的miRNA在今后的研究過程中更有提示意義。但由于本實(shí)驗(yàn)研究細(xì)胞種類有限,需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

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