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        TNF-α對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞sncRNAs表達(dá)的調(diào)控研究

        2022-06-17 10:25:00陸艷青彭建平王傳東張曉玲
        關(guān)鍵詞:分析研究

        周 興, 陸艷青, 彭建平, 王傳東, 張曉玲

        在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和強(qiáng)直性脊柱炎等慢性炎癥性疾病中,骨破壞和骨丟失嚴(yán)重。近年來(lái),不少研究表明免疫系統(tǒng)與骨代謝之間具有關(guān)聯(lián)性[1],M2巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞等可通過(guò)增強(qiáng)成骨分化或抑制破骨細(xì)胞分化成熟等方式來(lái)加強(qiáng)成骨[2-3]。相反,活化的T細(xì)胞可通過(guò)分泌一系列促炎性細(xì)胞因子,如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、白細(xì)胞介素6(interleukin-6,IL-6)等激活經(jīng)典的破骨細(xì)胞活化通路,包括核因子-κB配體的受體激活劑(receptor activator for nuclear factor-κB ligand,RANKL)、Wnt/β-catenin等。促炎性細(xì)胞因子在炎癥和骨質(zhì)疏松之間起到中間介質(zhì)作用,目前已經(jīng)有很多研究以促炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-6作為靶點(diǎn)開發(fā)治療骨代謝疾病的藥物[2,4-6]。非編碼RNA(non-coding RNAs,ncRNAs)可根據(jù)其長(zhǎng)度分為長(zhǎng)非編碼RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)和非編碼小RNA(small non-coding RNAs,sncRNAs)。lncRNAs的長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸,可包含數(shù)千個(gè)核苷酸。sncRNAs的長(zhǎng)度<200個(gè)核苷酸,包括小干擾RNA(small interfering RNAs,siRNAs)、PIWI相互作用RNA(PIWI-interacting RNAs,piRNAs)、微小RNA(microRNA,miRNAs)、核仁小RNA(small nucleolar RNAs,snoRNAs)和核小RNA(small nuclear RNA,snRNAs)等[7]。目前,sncRNAs尤其是miRNAs在許多人類疾病中的作用已經(jīng)得到了廣泛驗(yàn)證。然而,目前尚未有研究報(bào)道TNF-α對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSCs)中sncRNAs的調(diào)控作用。本研究通過(guò)TNF-α刺激hBMSCs,利用高通量測(cè)序以及實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)分析TNF-α對(duì)hBMSCs中sncRNAs表達(dá)的影響?,F(xiàn)報(bào)道如下。

        1 材料與方法

        1.1實(shí)驗(yàn)材料 DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司(#SH30081.01);胎牛血清(fetal bovine serum,F(xiàn)BS)購(gòu)自BIOEXPLORER公司(#BN1630-149);人血小板裂解液購(gòu)自以色列BI公司(# PLTGOLD050R);胰蛋白酶購(gòu)自Gibco公司(#25200072);TNF-α細(xì)胞因子購(gòu)自PeproTech公司(#315-01A);miRNAs加尾法試劑購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司(# B532451-0020);實(shí)時(shí)熒光定量PCR相關(guān)試劑[TB Green? Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)、PrimeScriptTMRT Master Mix]購(gòu)自日本Takara公司(# RR420A、#RR036A)。

        1.2hBMSCs分離和培養(yǎng) 選擇2021年8月至2021年10月于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院骨科接受手術(shù)治療的先天性髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良患者5例,均經(jīng)骨盆正位片確診。通過(guò)全骨髓血貼壁法分離、培養(yǎng)hBMSCs。從髂骨穿刺抽取骨髓血5~10 ml,立即加入肝素鈉上下顛倒5次防止凝血,轉(zhuǎn)移至10 cm培養(yǎng)皿中,加入完全培養(yǎng)基(含8% FBS、2%人血小板裂解物的高糖DMEM),細(xì)胞放置在培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)中進(jìn)行培養(yǎng),每3 d更換一次培養(yǎng)基。培養(yǎng)10 d左右即可獲得原代hBMSCs。本項(xiàng)研究獲得了醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(批號(hào):XHEC-C-2021-125-1),所取樣本獲得了捐贈(zèng)者的知情同意。

        1.3small RNAs測(cè)序 選擇P2代hBMSCs,以2×105cells/孔接種于6孔板中,待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%融合后棄除舊的培養(yǎng)基。對(duì)照組繼續(xù)加入完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),TNF-α組加入含有10 ng/ml TNF-α的完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),每組3個(gè)復(fù)孔。經(jīng)干預(yù)24 h后棄去6孔板中的培養(yǎng)基,磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)洗滌2遍,每個(gè)孔加入1 ml TRIzol試劑裂解細(xì)胞,樣品置于干冰保存,重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。所得樣品送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行總RNA提取、建庫(kù)和small RNAs測(cè)序。

        1.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR 應(yīng)用TRIzol法提取hBMSCs總RNA,將RNA稀釋至500 ng/μl。取2 μl RNA使用miRNAs加尾法試劑盒進(jìn)行miRNAs和piRNAs逆轉(zhuǎn)錄。使用PrimeScriptTMRT Master Mix進(jìn)行snoRNAs和snRNAs逆轉(zhuǎn)錄。使用TB Green? Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)試劑在羅氏LightCycler 480儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè),miRNAs和piRNAs使用試劑盒中的U6作為內(nèi)參,Universal R引物作為通用R引物;snoRNAs和snRNAs使用GAPDH作為內(nèi)參。本實(shí)驗(yàn)選用的引物序列見表1。所有引物均在生工生物工程(上海)股份有限公司合成。進(jìn)行3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn),采用2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

        表1 PCR所用引物序列

        1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。使用Graphpad Prism 8.2.1軟件作圖。兩組間計(jì)量資料比較采用成組t檢驗(yàn)。在R軟件(3.3.0)中,熱圖使用gplots函數(shù)繪制,MA圖(M-versus-A plot)、Scatter圖(Scatter plot)、火山圖(Volcano plot)使用ggplot2函數(shù)繪制,主成分分析(principal component analysis,PCA)使用vegan函數(shù)繪制。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1TNF-α調(diào)控hBMSCs炎癥狀態(tài)下miRNAs的表達(dá) small RNAs測(cè)序分析結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,TNF-α組中miRNAs表達(dá)存在顯著變化(見圖1?)。MA圖、Scatter圖和火山圖分析結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,TNF-α組中有38個(gè)miRNAs表達(dá)顯著上調(diào),11個(gè)miRNAs表達(dá)顯著下調(diào)(見圖1?~?)。PCA結(jié)果顯示,miRNAs的表達(dá)可以區(qū)分對(duì)照組和TNF-α組hBMSCs(見圖1?)。選取測(cè)序結(jié)果有顯著性差異的miRNAs進(jìn)行PCR檢測(cè),結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,在TNF-α組中hsa-miR-141-3p、hsa-miR-3065-5p、hsa-novel-155-mature、hsa-miR-27a-5p表達(dá)顯著下降(P<0.05),而hsa-novel-170-mature、hsa-miR-155-5p、hsa-miR-1260a、hsa-novel-202-mature、hsa-novel-116-mature表達(dá)顯著上升(P<0.05)(見圖1?)。

        2.2TNF-α調(diào)控hBMSCs炎癥狀態(tài)下piRNAs的表達(dá) small RNAs測(cè)序分析結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,TNF-α組中piRNAs表達(dá)存在顯著變化(見圖2?)。MA圖、Scatter圖和火山圖分析結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,TNF-α組中有25個(gè)piRNAs表達(dá)顯著上調(diào),有24個(gè)piRNAs表達(dá)顯著下調(diào)(見圖2?~?)。PCA結(jié)果顯示,piRNAs的表達(dá)可以區(qū)分對(duì)照組和TNF-α組hBMSCs(見圖2?)。選取有顯著性差異的piRNAs進(jìn)行PCR驗(yàn)證,結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,TNF-α組DQ592932、DQ570992、DQ593325、DQ582827表達(dá)顯著上升(見圖2?)。

        2.3TNF-α調(diào)控hBMSCs炎癥狀態(tài)下snoRNAs的表達(dá) small RNAs測(cè)序分析結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,TNF-α組中snoRNAs表達(dá)存在顯著變化(見圖3?)。MA圖、Scatter圖和火山圖分析結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,TNF-α組中有40個(gè)snoRNAs表達(dá)顯著上調(diào),有24個(gè)snoRNAs表達(dá)顯著下調(diào)(見圖3?~?)。PCA結(jié)果顯示,snoRNAs的表達(dá)可以區(qū)分對(duì)照組和TNF-α組hBMSCs(見圖3?)。選取有顯著性差異的snoRNAs進(jìn)行PCR驗(yàn)證,結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,TNF-α組中SNORD14D、SNORD116-3、SNORA21、SNORD60、SNORD81、SNORD32A、SNORD117、SNORD2、SNORD1C、SNORD36B、SNORD4B、SNORA58、SNORA64表達(dá)顯著下降(見圖3?)。

        2.4TNF-α調(diào)控hBMSCs炎癥狀態(tài)下snRNAs的表達(dá) small RNAs測(cè)序分析結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,TNF-α組中snRNAs表達(dá)存在顯著變化(見圖4?)。MA圖、Scatter圖和火山圖分析結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,TNF-α組中有5個(gè)snRNAs表達(dá)顯著上調(diào),有8個(gè)snRNAs表達(dá)顯著下調(diào)(見圖4?~?)。PCA結(jié)果顯示,snRNAs的表達(dá)可以區(qū)分對(duì)照組和TNF-α組hBMSCs(見圖4?)。選取有顯著性差異的snRNAs進(jìn)行PCR驗(yàn)證,結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,TNF-α組NR_003137.2表達(dá)顯著下降(見圖4?)。

        ?熱圖分析結(jié)果;?MA圖分析結(jié)果;?Scatter圖分析結(jié)果;?火山圖分析結(jié)果;?PCA結(jié)果;?實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果,*P<0.05,***P<0.001。CPM:每百萬(wàn)計(jì)數(shù)(count-per-millon)

        ?熱圖分析結(jié)果;?MA圖分析結(jié)果;?Scatter圖分析結(jié)果;?火山圖分析結(jié)果;?PCA結(jié)果;?實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

        ?熱圖分析結(jié)果;?MA圖分析結(jié)果;?Scatter圖分析結(jié)果;?火山圖分析結(jié)果;?PCA結(jié)果;?實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果,*P<0.05,**P<0.01

        ?熱圖分析結(jié)果;?MA圖分析結(jié)果;?Scatter圖分析結(jié)果;?火山圖分析結(jié)果;?PCA結(jié)果;?實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果,**P<0.01

        2.5TNF-α調(diào)控hBMSCs炎癥狀態(tài)下repeat RNAs的表達(dá) 根據(jù)small RNAs測(cè)序分析結(jié)果,MA圖、Scatter圖和火山圖分析結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,TNF-α組中有1個(gè)repeat RNA表達(dá)顯著下調(diào)(見圖5?~?)。PCA結(jié)果顯示repeat RNAs的表達(dá)可以區(qū)分對(duì)照組和TNF-α組hBMSCs(見圖5?)。

        ?MA圖分析結(jié)果;?Scatter圖分析結(jié)果;?火山圖分析結(jié)果;?PCA結(jié)果

        3 討論

        3.1在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥等多種骨關(guān)節(jié)退行性疾病中,局部微環(huán)境中的炎癥因子通過(guò)抑制成骨分化、促進(jìn)破骨形成等多種途徑加劇骨侵蝕破壞,進(jìn)一步加重關(guān)節(jié)損傷程度[1,8]。炎癥與骨重塑相關(guān)細(xì)胞如間充質(zhì)干細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞等之間的相互作用和調(diào)控關(guān)系對(duì)于退行性骨病治療策略的開發(fā)意義重大[9-10]。本研究主要關(guān)注了炎癥刺激對(duì)于間充質(zhì)干細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)改變,尤其是sncRNAs表達(dá)水平的變化。間充質(zhì)干細(xì)胞具有多項(xiàng)分化潛能并且是成骨的主要來(lái)源[11]。

        3.2本研究應(yīng)用高通量small RNAs測(cè)序技術(shù)分析4類sncRNAs表達(dá)水平的改變情況,并應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行了驗(yàn)證。miRNAs是一類長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸片段的sncRNAs,主要通過(guò)和靶基因mRNA 3′-UTR區(qū)結(jié)合[12-13],導(dǎo)致mRNA降解或抑制mRNA轉(zhuǎn)錄后翻譯,進(jìn)而影響靶基因的蛋白表達(dá)水平。本研究結(jié)果顯示,TNF-α可以抑制hsa-miR-27a-5p的表達(dá),既往研究報(bào)道也顯示骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)分泌的外泌體中富含hsa-miR-27a-5p,其可通過(guò)靶向自噬相關(guān)蛋白4同源物B(autophagy-related protein 4 homolog B,Atg4B)介導(dǎo)BMSCs自噬,促進(jìn)BMSCs的成骨分化[14]。因此,認(rèn)為TNF-α可能通過(guò)抑制BMSCs中hsa-miR-27a-5p的表達(dá)而抑制其成骨分化。miR-155-5p可通過(guò)抑制E26轉(zhuǎn)錄因子-1(E26 transformation specific-1,ETS-1)表達(dá)而降低牙周韌帶干細(xì)胞的成骨分化[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)TNF-α可以促進(jìn)miR-155-5p的表達(dá),因此miR-155-5p可能參與了TNF-α對(duì)BMSCs成骨分化的調(diào)控。本研究也發(fā)現(xiàn)了TNF-α可以調(diào)控多個(gè)miRNAs的表達(dá),并且測(cè)序結(jié)果預(yù)測(cè)了4個(gè)新的miRNAs:hsa-novel-170-mature、hsa-novel-155-mature、hsa-novel-202-mature、hsa-novel-116-mature。對(duì)于這些新的miRNAs目前尚未有研究報(bào)道其生物學(xué)功能,炎癥刺激如何調(diào)控這些miRNAs而影響hBMSCs成骨分化需要通過(guò)后續(xù)的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

        3.3piRNAs最早是從哺乳動(dòng)物精子細(xì)胞中分離出來(lái)的一類長(zhǎng)度為26~32個(gè)核苷酸片段的ncRNAs[17],可以與PIWI家族蛋白相互作用。隨后的研究表明,piRNAs不只存在于生殖細(xì)胞中,在體細(xì)胞中也有廣泛的表達(dá)[18-19]。然而,對(duì)于piRNAs的起源和功能目前還沒有完全闡明,隨著對(duì)piRNAs研究的深入,目前已有多個(gè)可用的數(shù)據(jù)庫(kù)[20]。本研究結(jié)果顯示TNF-α可以調(diào)控DQ592932、DQ570992、DQ593325、DQ582827的表達(dá),其中DQ582827的表達(dá)顯著性升高。由于目前還沒有可靠的piRNAs功能預(yù)測(cè)軟件,難以預(yù)測(cè)這些piRNAs的靶基因,對(duì)于炎癥刺激后piRNAs的改變是否會(huì)影響hBMSCs成骨分化,以及其具體的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

        3.4snoRNAs是一類主要分布在核仁的長(zhǎng)度為60~300個(gè)核苷酸片段的sncRNAs,其主要的功能是調(diào)控核糖體RNA的修飾[21]。目前尚未有研究報(bào)道snoRNAs對(duì)hBMSCs成骨分化有直接調(diào)控作用。有研究報(bào)道snoRNAs宿主基因如SNHG16可通過(guò)調(diào)控骨形成蛋白7(bone morphogenetic protein 7,BMP7)的表達(dá)介導(dǎo)hBMSCs成骨分化[22],SNHG14通過(guò)調(diào)控miR-185-5p/WISP2信號(hào)通路促進(jìn)hBMSCs成骨分化[23]。本研究結(jié)果顯示,TNF-α刺激后hBMSCs中SNORD14D、SNORD116-3、SNORA21、SNORD60、SNORD81、SNORD32A、SNORD117、SNORD2、SNORD1C、SNORD36B、SNORD4B、SNORA58、SNORA64的表達(dá)顯著下降,然而這些snoRNAs對(duì)BMSCs的表觀遺傳學(xué)修飾作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。此外,本研究還發(fā)現(xiàn)TNF-α參與調(diào)控多個(gè)snRNAs和repeat RNAs。但局限于目前piRNAs、snoRNAs、snRNAs、repeat RNAs等ncRNAs功能預(yù)測(cè)工具較少、數(shù)據(jù)庫(kù)分類不統(tǒng)一,以及相應(yīng)的生物學(xué)方法如過(guò)表達(dá)或敲低等還不成熟,其作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步驗(yàn)證,該領(lǐng)域的研究進(jìn)展值得我們繼續(xù)關(guān)注。

        綜上所述,本研究通過(guò)高通量small RNAs轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序揭示了炎癥因子TNF-α影響hBMSCs表觀遺傳學(xué)修飾中sncRNAs的表達(dá)。對(duì)于這些sncRNAs的研究將有助于更加深入地理解炎癥因子動(dòng)態(tài)調(diào)控hBMSCs分化的機(jī)制,為開發(fā)疾病治療的新方法提供參考。

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