洪 偉，孫浩浩，薛正蓮

(1.蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241003；2.安徽工程大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241000)

靈菌紅素(prodigiosin，PG)是一類天然色素的總稱，分子式C20H25N3O，是一類具有三吡咯環(huán)骨架結(jié)構(gòu)的生物堿物質(zhì)，可由沙雷氏菌屬、鏈霉菌屬以及假單胞菌屬等部分菌株代謝合成，是一類次級代謝產(chǎn)物.1929年首次由Amak等人在研究Serratia生長時發(fā)現(xiàn)，1960年Harashima K等首次分離得到靈菌紅素[1-3].眾多研究表明靈菌紅素具有廣泛的抗菌效果、免疫抑制活性以及對腫瘤細(xì)胞具有凋亡作用[4-6]，因此受到廣泛的關(guān)注.

目前，國內(nèi)外眾多學(xué)者對靈菌紅素的發(fā)酵參數(shù)進(jìn)行了大量的研究.布佐日古麗·喀迪爾[7]等通過發(fā)酵條件優(yōu)化試驗(yàn)，菌株XJU-PA-6產(chǎn)靈菌紅素的能力達(dá)到 290.92 mg/L，比原來提高3.896倍.張丹峰[8]等通過單因素和正交設(shè)計，優(yōu)化粘質(zhì)沙雷氏菌發(fā)酵培養(yǎng)基組分和發(fā)酵條件，靈菌紅素的產(chǎn)量最大為2.98 g/L.陳艷等[9]以粘質(zhì)沙雷氏菌ZSG為受試菌株，對靈菌紅素分批發(fā)酵過程的溶氧和補(bǔ)料方式進(jìn)行調(diào)控, 過流加補(bǔ)料，使靈菌紅素產(chǎn)量從補(bǔ)料前的79.01 mg/L提高到115.98 mg/L，提高了46.8%.研究發(fā)現(xiàn)根據(jù)靈菌紅素菌的分離源不同，發(fā)酵條件和培養(yǎng)基組成差異較大，代謝產(chǎn)物也不盡相同[10].實(shí)驗(yàn)室在前期實(shí)驗(yàn)中通過分離篩選得到一株靈菌紅素產(chǎn)生菌經(jīng)鑒定為粘質(zhì)沙雷氏菌，通過ARTP誘變得到遺傳穩(wěn)定的突變株YW-3-10，靈菌紅素產(chǎn)量達(dá)到128.7 mg/L[11].本研究通過單因素對YW-3-10發(fā)酵條件的各方面進(jìn)行全面考察，在此基礎(chǔ)上通過響應(yīng)面優(yōu)化法對菌株YW-3-10的靈菌紅素發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以期得到粘質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)靈菌紅素穩(wěn)定可靠的發(fā)酵條件數(shù)據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

由蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室篩選保藏，編號為YW-3-10.

1.1.2 主要試劑

葡萄糖，酵母膏，麥芽糖，胰蛋白胨，淀粉，甘氨酸，甘油，乙醇，鹽酸，瓊脂，豆餅粉、尿素、玉米漿、NaCl、MgSO4等.

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：酵母膏5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，pH 7.0-7.2.

1.2 方法

1.2.1 菌體生物量測定

采用比濁法測定生物量.取發(fā)酵一定時間后的發(fā)酵液進(jìn)行稀釋測定細(xì)胞懸浮液的OD600nm值，以未接種的培養(yǎng)基作為對照.

1.2.2 初始發(fā)酵條件

按10%的接種量接種于LB培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱靜置發(fā)酵48 h.

1.2.3 靈菌紅素含量的測定

取0.5 ml發(fā)酵液，加入4.5 ml酸性乙醇(pH 3.0)，28 ℃、180 r/min搖床振蕩提取60 min，10 000 r/min離心10 min，收集上清液，535 nm紫外可見分光光度計測定靈菌紅素的含量.

1.2.4 培養(yǎng)基成分對靈菌紅素產(chǎn)量的影響

根據(jù)文獻(xiàn)報道可能對靈菌紅素的生產(chǎn)產(chǎn)生影響的培養(yǎng)基因素分別考察了碳源、氮源、甘氨酸添加量、NaCl加量、無機(jī)鹽離子對靈菌紅素產(chǎn)量的影響，具體條件如下：

C源：乙醇、甘油、淀粉、芝麻油、蔗糖、葡萄糖；

N源：豆餅粉、尿素、玉米漿、硫酸銨；

甘氨酸添加量：0 g/L、1.5 g/L、3 g/L、4.5 g/L、6 g/L；

NaCl加量：0 g/L、1.5 g/L、3 g/L、4.5 g/L、6 g/L；

無機(jī)鹽離子：Fe2+、Mn2+、K+、Cu2+、NH4+、Fe3+、Zn2+.

1.2.5 培養(yǎng)條件對菌株生長及靈菌紅素產(chǎn)量的影響

參照前人的研究分別對發(fā)酵溫度、搖床轉(zhuǎn)速、搖瓶裝液量、接種量進(jìn)行了單因素實(shí)驗(yàn)，具體條件梯度如下：

發(fā)酵溫度：20 ℃、24 ℃、28 ℃、32 ℃、37 ℃；

搖床轉(zhuǎn)速：160 r/min、180 r/min、200 r/min、220 r/min、240 r/min；

搖瓶裝液量：30 mL、50 mL、70 mL、90 mL(250 mL搖瓶)；

接種量：2%、4%、6%、8%、10%.

1.2.6 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計

由以上一系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出影響靈菌紅素產(chǎn)量的關(guān)鍵因子及條件，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計的中心組合試驗(yàn)設(shè)計原理，實(shí)驗(yàn)設(shè)計為3因素3水平共計17組試驗(yàn)，每組設(shè)3個重復(fù)，響應(yīng)值為靈菌紅素的產(chǎn)量Y(g/L)，并用Design Expert 8.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 YW-3-10產(chǎn)靈菌紅素發(fā)酵條件單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 碳源對YW-3-10產(chǎn)靈菌紅素的影響

碳源是作為微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)或代謝產(chǎn)物中碳架來源的營養(yǎng)物質(zhì).不同種類的微生物生長代謝的所需要的碳源類型或種類有所不同，合適的碳源有利于微生物生長與代謝，能促進(jìn)目的產(chǎn)物的生成.碳源對靈菌紅素的影響可以從3個方面進(jìn)行考量，分別是菌體生長、靈菌紅素產(chǎn)量，由于發(fā)酵液pH值呈堿性時靈菌紅素不穩(wěn)定，因此還要考察碳源代謝后對發(fā)酵液pH值的影響，從圖1中可以看出，菌體生長方面，以芝麻油為碳源時，OD600值為4.74；以蔗糖為碳源時，OD600值為3.81；以甘油為碳源時，OD600值為3.06；這表明以芝麻油為碳源時菌體生長最好，蔗糖次之，其次是甘油.在靈菌紅素產(chǎn)量方面，芝麻油為碳源時其產(chǎn)量為1.12 g/L；以蔗糖為碳源時其靈菌紅素產(chǎn)量為1.35 g/L；以甘油為碳源時其靈菌紅素產(chǎn)量為1.88 g/L.這表明以甘油為碳源時，發(fā)酵液中靈菌紅素的產(chǎn)量最高.而以乙醇、淀粉、芝麻油為碳源時，發(fā)酵pH呈堿性，此時靈菌紅素的性質(zhì)不穩(wěn)定，故不能作為碳源進(jìn)行使用.以蔗糖和甘油為碳源時發(fā)酵pH為弱酸性，靈菌紅素在酸性環(huán)境下較穩(wěn)定，此外由于甘油為碳源時發(fā)酵液中靈菌紅素的產(chǎn)量最高，因此綜合考慮選擇甘油作為菌株YW-3-10發(fā)酵產(chǎn)靈菌紅素的唯一碳源.

甘油添加量對菌株發(fā)酵產(chǎn)靈菌紅素菌株YW-3-10產(chǎn)靈菌紅素產(chǎn)量的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，甘油添加量梯度為10 mL/L、15 mL/L、20 mL/L、25 mL/L、30 mL/L、35 mL/L、40 mL/L和45 mL/L，菌體的生長、發(fā)酵液pH和靈菌紅素的產(chǎn)量均受甘油濃度的影響.靈菌紅素的產(chǎn)量隨著甘油濃度的增加而逐漸升高，當(dāng)甘油濃度為30 mL/L時，最有利于菌株YW-3-10產(chǎn)靈菌紅素(2.24 g/L).

圖1 不同碳源對菌株產(chǎn)靈菌紅素的影響 圖2 甘油含量對菌株產(chǎn)靈菌紅素的影響

2.1.2 氮源對YW-3-10產(chǎn)靈菌紅素的影響

氮是構(gòu)成重要生命物質(zhì)蛋白質(zhì)和核酸等的主要元素，也是微生物的主要營養(yǎng)物.不同種類的微生物生長代謝的所需要的氮源類型或種類有所不同，合適的氮源有利于微生物生長與代謝，促進(jìn)目的產(chǎn)物的生成.由圖3可以看出，不同氮源對靈菌紅素產(chǎn)量和菌體生物量具有顯著的影響.以胰蛋白胨、玉米漿和豆餅粉為氮源時，菌株YW-3-10都能很好的生長，以尿素和硫酸銨做氮源會抑制菌株的生長；不同氮源對靈菌紅素產(chǎn)量影響差別較大，以胰蛋白胨為氮源時，靈菌紅素的產(chǎn)量最高，其他幾種氮源靈菌紅素的產(chǎn)量都很低，甚至幾乎不產(chǎn).

圖3 不同氮源對菌株產(chǎn)靈菌紅素的影響 圖4 胰蛋白胨含量對靈菌紅素產(chǎn)量的影響

在選定了胰蛋白胨作為最優(yōu)氮源后，還需要確定胰蛋白胨含量對菌株YW-3-10發(fā)酵生產(chǎn)靈菌紅素的影響.如圖4所示胰蛋白胨添加量分別為7 g/L、13 g/L、19 g/L、25 g/L、31 g/L和37 g/L時，隨著胰蛋白胨添加量的增加，發(fā)酵液的pH有一個明顯的下降趨勢，這有利于靈菌紅素的穩(wěn)定，而當(dāng)胰蛋白胨添加量為13 g/L時，靈菌紅素產(chǎn)量最高.

2.1.3 添加甘氨酸、NaCl及無機(jī)鹽離子對YW-3-10產(chǎn)靈菌紅素的影響

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示甘氨酸、NaCl的添加量的變化對靈菌紅素產(chǎn)量及菌體生長影響不大，分別確定最優(yōu)的條件為甘氨酸的添加量為1.5 g/L，NaCl的添加量為5 g/L，而添加Mg2+、Fe3+、Cu2+和NH4+可以增加菌體濃度，添加Zn2+會顯著抑制菌體的生長，其他無機(jī)鹽對菌體生長影響不明顯；添加Fe2+和Fe3+對發(fā)酵液的pH的影響顯著.但是不添加任何無機(jī)鹽離子時，靈菌紅素的產(chǎn)量卻是最高的，而且菌體生長較好.因此，綜合考慮，后續(xù)試驗(yàn)均不添加無機(jī)鹽離子.

2.1.4 轉(zhuǎn)速、裝液量對YW-3-10產(chǎn)靈菌紅素的影響

氧對微生物的生命活動有著極其重要的影響.在搖瓶發(fā)酵過程中，主要通過控制搖床的轉(zhuǎn)速和三角瓶的裝液來對溶氧進(jìn)行調(diào)控.在對YW-3-10菌株產(chǎn)靈菌紅素的研究中發(fā)現(xiàn)，氧對靈菌紅素的產(chǎn)量起著關(guān)鍵作用，靈菌紅素的產(chǎn)量隨著搖床轉(zhuǎn)速的增加呈現(xiàn)出現(xiàn)增加后下降的趨勢，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速高于200 r/min時，靈菌紅素的產(chǎn)量最高，之后呈現(xiàn)下降趨勢，這一結(jié)果與李子武等[12]的研究不一致，說明不同菌株發(fā)酵生產(chǎn)靈菌紅素對氧的需求是不同的，菌株YW-3-10是一株兼性厭氧菌，但在發(fā)酵生產(chǎn)靈菌紅素的過程中是耗氧的.而當(dāng)裝液量為30 mL時，靈菌紅素的產(chǎn)量達(dá)到最大.結(jié)果顯示較高溶氧有利于YW-3-10菌體的生長繁殖以及靈菌紅素的合成.因此確定搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min，裝液量為30 mL.

2.1.5 接種量對YW-3-10產(chǎn)靈菌紅素的影響

微生物的生長及代謝也受接種量的影響，合適的接種量對菌體的快速生長和發(fā)酵產(chǎn)物的合成都有積極的作用.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，搖瓶發(fā)酵的接種量對靈菌紅素的產(chǎn)量影響不明顯，接種量為4%發(fā)酵24 h后靈菌紅素的產(chǎn)量達(dá)到最大，但是當(dāng)接種量過大時，靈菌紅素的產(chǎn)量還是會有所下降，可能是因?yàn)榻臃N量大，導(dǎo)致菌體濃度快速增長，提前進(jìn)入穩(wěn)定期，同時發(fā)酵液中的溶氧低，抑制了靈菌紅素的合成.隨著接種量的增加，菌體濃度也在不斷增加，當(dāng)接種量為6%時，菌體濃度達(dá)到最大；繼續(xù)增加接種量菌體濃度開始下降，這可能是由于較高接種量開始時發(fā)酵液中菌體濃度過高，培養(yǎng)基營養(yǎng)成分消耗過快所導(dǎo)致的.發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液的pH都在6.0-6.5之間，與接種量沒有顯著的相關(guān)性.綜上，搖瓶發(fā)酵靈菌紅素的最適接種量為4%.

2.2 發(fā)酵條件的響應(yīng)面優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面分析結(jié)果

依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，維持其他條件在各自最優(yōu)條件下，選擇發(fā)酵培養(yǎng)基甘油添加量(A)、胰蛋白胨添加量(B)和搖床轉(zhuǎn)速(C)3個因素(表1)，以搖瓶發(fā)酵的靈菌紅素產(chǎn)量(Y)為響應(yīng)值，設(shè)計三因素三水平的Box-Behnken實(shí)驗(yàn).實(shí)驗(yàn)方案和實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2.以Y(靈菌紅素產(chǎn)量)為響應(yīng)值，對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，經(jīng)二次多項(xiàng)回歸擬合后，得到二次多項(xiàng)回歸方程為：

Y=3.01+00.13*A+0.66*B+0.21*C-0.14*A*B+0.098*A*C+0.39*B*C-0.17A2-0.58B2-0.72C2

表1 Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表

表2 Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果

回歸模型方差分析(表3)可以看出：模型Pr<0.0001，該模型回歸極顯著，其失擬項(xiàng)Pr =0.0737，失擬項(xiàng)不顯著，模型較準(zhǔn)確.相關(guān)系數(shù)R2=99.27%，表明擬合程度良好，具有較好的相關(guān)性.同時，A、B、C、 A2、B2和C2均對Y值影響極顯著，BC的交互影響極顯著，AB交互影響顯著，說明因素間有明顯的交互作用.

表3 Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計分析

采用Design Expert軟件做出的響應(yīng)面分析圖和等高線圖，如圖5所示.由圖5可以看出發(fā)酵培養(yǎng)基甘油添加量、胰蛋白胨添加量和搖床轉(zhuǎn)速對靈菌紅素產(chǎn)量的影響.

圖5 各因素交互作用的響應(yīng)面圖

對響應(yīng)面分析所得回歸方程求解，得到甘油添加量為32.15 mL/L，胰蛋白胨添加量為16.91 g/L，搖床轉(zhuǎn)速為213.45 r/min，在此條件下預(yù)測菌株YW-3-10發(fā)酵產(chǎn)靈菌紅素的最高產(chǎn)量為3.271 g/L.

2.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果驗(yàn)證

結(jié)合實(shí)驗(yàn)的實(shí)際操作對響應(yīng)面分析得出的發(fā)酵條件進(jìn)行修正：發(fā)酵培養(yǎng)基中甘油添加量為32 mL/L，胰蛋白胨添加量為17 g/L，搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min.分別以初始條件、單因素優(yōu)化得到的條件以及響應(yīng)面優(yōu)化后修正的條件發(fā)酵培養(yǎng)菌株YW-3-10，測定靈菌紅素的產(chǎn)量.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，響應(yīng)面法優(yōu)化的靈菌紅素的產(chǎn)量為3.285 g/L±0.0257 g/L，與理論值相對誤差約為0.426%.由此可見，采用該響應(yīng)面模型得到的響應(yīng)面分析的優(yōu)化結(jié)果準(zhǔn)確可靠，具有一定實(shí)用價值.較初始條件靈菌紅素產(chǎn)量128.7 mg/L提高了24倍.

3 討論與展望

微生物發(fā)酵是一個復(fù)雜的過程，在不同的培養(yǎng)條件下代謝物的產(chǎn)量也有很大的差別.據(jù)報道，粘質(zhì)沙雷細(xì)菌生產(chǎn)靈菌紅素能力受到許多生物及非生物因素的影響[13].近年來，有很多關(guān)于靈菌紅素發(fā)酵條件優(yōu)化的報道.李子武等[12]的研究發(fā)現(xiàn)在蔗糖2 g/dL，牛肉膏1.5 g/dL，CaCl21 g/dL，脯氨酸0.75 g/dL，MgSO4·7H2O 0.02 g/dL，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.006 g/dL的培養(yǎng)基中發(fā)酵72 h后，靈菌紅素產(chǎn)量可達(dá)4.139 g/L.Cang等[14]利用乙醇作為SerratiamarcescensS389的碳源，靈菌紅素產(chǎn)量達(dá)2.95 g/L.黃小龍等[15]在花生粉培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加適量的花生油、L-脯氨酸、MgSO4，將靈菌紅素的產(chǎn)量從22.37 mg L提高到67.92 mg/L.

本研究對實(shí)驗(yàn)室保藏菌株YW-3-10產(chǎn)靈菌紅素的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化.首先進(jìn)行了單因素優(yōu)化，然后采用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)和響應(yīng)面分析，得到一個能較好預(yù)測菌株YW-3-10發(fā)酵產(chǎn)靈菌紅素的模型回歸方程，確定最佳發(fā)酵條件：甘油32 mL/L，胰蛋白胨17 g/L，甘氨酸1.5 g/L，NaCl 5 g/L，轉(zhuǎn)速200 r/min，裝液量30 mL，接種量4%，在最佳條件下，靈菌紅素的產(chǎn)量為3.285±0.0257 g/L.該菌株優(yōu)化后的培養(yǎng)條件與已報道的粘質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)色素最優(yōu)條件以及靈菌紅素產(chǎn)量存在一定的差異，其原因可能與菌種自身特性相關(guān).靈菌紅素作為一種次級代謝產(chǎn)物，其生物合成受到多個基因的調(diào)控，同種粘質(zhì)沙雷氏菌不同菌株之間在合成能力上也存在差異，這可能是造成目前產(chǎn)量報道不一的主要原因之一[16].在實(shí)驗(yàn)過程中我們發(fā)現(xiàn)溶氧對于靈菌紅素的產(chǎn)量的影響最為巨大，靜置培養(yǎng)和搖床培養(yǎng)的靈菌紅素產(chǎn)量相差10倍，在搖瓶實(shí)驗(yàn)中只能通過控制搖床轉(zhuǎn)速和裝液量來研究，在后期的發(fā)酵罐小試中需要重點(diǎn)關(guān)注溶氧量對靈菌紅素產(chǎn)量的影響.另外，在實(shí)驗(yàn)過程中還發(fā)現(xiàn)溫度對靈菌紅素生產(chǎn)的影響很獨(dú)特，當(dāng)溫度高于28 ℃時，靈菌紅素的產(chǎn)量會迅速下降到幾乎為零，這個現(xiàn)象的機(jī)制值得進(jìn)一步的研究探討.