傅世利，蘭費香，符娜妮，楊志燕，李 勛，薛 珺

(贛南師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，江西 贛州 341000)

硒是一種人體必需的微量元素，在自然界的存在方式為無機硒和植物活性硒.研究發(fā)現(xiàn)，硒對人體作用效果、毒性等與攝入硒的化學(xué)形態(tài)密切相關(guān)，有機硒不僅比無機硒毒性小，而且具有更高的生物利用而更易被人體吸收[1].有機硒主要存在形式有硒代氨基酸、硒多肽和硒蛋白等，植物可通過自身代謝作用將無機硒有效地轉(zhuǎn)化為不同形態(tài)的有機硒[2-3].然而，許多地區(qū)地殼中硒分布不均勻的地理性質(zhì)導(dǎo)致天然食物中缺乏硒元素，因此，富硒食品成為人們補硒的重要來源.贛南臍橙是江西農(nóng)產(chǎn)品特色品牌與地理標(biāo)志產(chǎn)品，通過富硒種植贛南臍橙可作為人們補硒食品的一種大眾選擇.同時提升贛南臍橙產(chǎn)業(yè)競爭力，助力我國富硒功能農(nóng)業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展.

目前，食品中硒代氨基酸的檢測方法有HPLC-ICP-MS、SE-HPLC、HPLC-AFS、IR-RP-HPLC、HPLC-ESI-MS/MS等聯(lián)用技術(shù)[4].其中，HPLC-ICP-MS因其靈敏度高、檢出限低等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用.然而，UPLC-MS 技術(shù)在植物中硒形態(tài)分析并不多見，同時應(yīng)用UPLC-Q-TOF-MS進行硒代氨基酸的分析研究尚未報道.因此，本研究建立了臍橙中3種硒代氨基酸的UPLC-Q-TOF-MS檢測方法，該方法分析速度快，準(zhǔn)確可靠，特異性強，可用于富硒臍橙中3種硒代氨基酸的分析檢測.但大分子量及大量的基質(zhì)對于該方法存在較大干擾.

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

9030型LC-MS(日本Shimadzu公司)；KQ5200DE型臺式數(shù)控超聲波清洗器(東莞市科橋超聲波設(shè)備有限公司)；ZWYR-240恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智誠分析儀器制造有限公司)；H1850型臺式高速離心機(湖南赫西儀器裝備有限公司)；RGF-7700型原子熒光光度計(北京博暉創(chuàng)新科技有限公司)；MAP001C38超濾離心管(1000 Da，美國頗爾公司)；FreeZone-2.5L真空冷凍干燥機(美國LABCONCO公司).

甲基-硒代半胱氨酸(MeSeCys)溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(以Se計：(34.8±1.0) μg/g，GBW10088，中國計量科學(xué)研究院)；硒代蛋氨酸(SeMet)溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(以Se計：(39.4 ± 1.0)μg/g，GBW10034，中國計量科學(xué)研究院)；硒代胱氨酸(SeCys2)溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(以Se計：(44.2±1.0)μg/g，GBW10087，中國計量科學(xué)研究院);乙腈(質(zhì)譜純，美國霍尼韋爾公司)；甲醇(質(zhì)譜純，美國霍尼韋爾公司)；胰蛋白酶(源自牛胰腺，上海生物生工工程公司).所用水為屈臣氏飲用水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司).普通臍橙購自贛州市本地市場，富硒臍橙采自贛南師范大學(xué)臍橙學(xué)院實驗基地.

1.2 實驗方法

1.2.1 硒代氨基酸工作液的配制

準(zhǔn)確稱取各適量硒代氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，用屈臣氏飲用水配成1 μg/mL的單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置于4 ℃冰箱儲存?zhèn)溆?取1.0 mL各單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于10 mL容量瓶中，用屈臣氏飲用水定容，配成濃度為100 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液.

1.2.2 樣品制備

將臍橙用純凈水洗凈，吸水紙將外表水吸干，剝?nèi)ス?，取果肉，冷凍干燥后粉碎，儲于干凈的封口袋中備用，同時檢測其凍干去除水分含量.普通臍橙凍干去除水分含量為87.4%，富硒臍橙凍干去除水分含量為87.9%.按照食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)《食品中硒的測定》(GB5009.93-2017)濕法消解，氫化物原子熒光光譜法測定，普通臍橙樣品總硒未檢出，富硒臍橙樣品總硒為30.56 μg/kg.

1.2.3 提取方法

超聲水提取法：精確稱取約0.1 g(±0.000 1 g)制備好的試樣至10 mL離心管中，并加入5 mL屈臣氏飲用水，渦旋混勻后，在常溫條件下超聲60 min，離心(10 000 rpm，30 min)，取上清液，殘渣部分濕法消解.

蛋白酶酶解法：精確稱取約0.1 g(±0.000 1 g)制備好的試樣至10 mL離心管中，加入5 mL屈臣氏水，渦旋混勻后，超聲30 min.隨后，加入5 mg胰蛋白酶，恒溫振蕩(37 ℃，100 rpm)12 h.酶解結(jié)束后，離心(10 000 rpm，30 min)，取上清液，殘渣部分濕法消解.

上述提取液上機前用超濾離心管(1 000 Da)去除大分子，再用0.22 μm微孔濾膜過濾；殘渣按食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中硒的測定之氫化物原子熒光光譜法(GB5009.93—2017)檢測硒含量.

1.3 儀器分析條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：AccQ·TagTM氨基酸色譜柱(3.9 mm×150 mm)；流動相：水-甲醇(體積比90∶10)；柱溫：35 ℃；進樣量：10.0 μL；流速：0.4 mL/min.

1.3.2 質(zhì)譜條件

ESI離子源，正離子模式，MRM模式，掃描范圍為質(zhì)荷比(m/z)100-500;離子源溫度300 ℃；霧化氣(氮氣)3 L/min；干燥氣(氮氣)10 L/min；碰撞氣(氬氣)230 kPa；去溶劑溫度250 ℃；加熱塊溫度400 ℃；接口溫度150 ℃，接口電壓3.00 kV.3種硒代氨基酸的質(zhì)譜分析參數(shù)見表1.

表1 3種硒代氨基酸的質(zhì)譜分析參數(shù)

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜柱的選用

參考相關(guān)文獻，以水-甲醇為流動相，選用C18柱和AccQ·TagTM氨基酸色譜柱對3種硒代氨基酸的分離情況進行了對比測試.試驗結(jié)果顯示，3種硒代氨基酸在C18柱上保留時間很短，分離效果差，而使用AccQ·TagTM氨基酸柱在適當(dāng)?shù)牧鲃酉鄺l件下，3種硒代氨基酸在7 min內(nèi)達到完全分離并且峰型較好.本試驗選用AccQ·TagTM氨基酸色譜柱作為實驗的色譜柱.

3.2 流動相的優(yōu)化

在已優(yōu)化質(zhì)譜條件下，用濃度為100 ng/mL的硒代氨基酸標(biāo)準(zhǔn)混合溶液對色譜條件進行優(yōu)化，考慮高分辨Q-TOF質(zhì)譜對溶劑的要求，本實驗分別選用了水-乙腈、水-甲醇作為流動相進行優(yōu)化實驗.

選用水-乙腈體系為流動相，改變水與乙腈的比例，3種硒代氨基酸均不能得到很好的分離；選用水-甲醇體系為流動相，當(dāng)甲醇比例較高時，SeCys2和MeSeCys難以分離，當(dāng)甲醇比例降至10%時，3種硒代氨基酸達到完全分離，且峰型較好.在優(yōu)化色譜條件下，MeSeCys、SeCys2和SeMet3種硒代氨基酸提取色譜圖見圖1.

圖1 3種硒代氨基酸提取色譜圖(A：SeCys2；B：MeSeCys；C：SeMet)

3.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化

分別在正離子和負離子模式下對3種硒代氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液進行SCAN掃描，掃描范圍為質(zhì)荷比(m/z)100-500，在正離子模式下3種硒代氨基酸母離子響應(yīng)信號強度遠高于在負離子模式時信號強度，所以選擇ESI正離子模式進行分析.

在ESI正離子模式下分別對濃度為100 ng/mL的3種硒代氨基酸進行掃描，優(yōu)化去溶劑溫度、離子源溫度，獲得各化合物穩(wěn)定的母離子峰.然后在SIM模式下優(yōu)化接口電壓得到最佳值為3.00 kV.再于MRM模式下，優(yōu)化CE值，得到SeCys2、MeSeCys和SeMet的最佳CE值分別為15.0 V、10.0 V和25.0 V.硒元素有6種同位素，其中Se80豐度最高，本實驗得到分子離子峰主要是[M80+H]+.3種硒代氨基酸MRM質(zhì)量色譜圖見圖2.

圖2 3種硒代氨基酸的MRM質(zhì)量色譜圖(A：SeCys2；B：MeSeCys；C：SeMet)

3.4 提取方法的選擇

目前從試樣中提取有機硒形態(tài)的前處理方法主要有：水提法、酸提法、堿提法、酶解法[5-6].在酸性和堿性條件下，容易使其它硒化合物降解，破壞原有的硒形態(tài)，較高的溫度也會導(dǎo)致SeMet形態(tài)的轉(zhuǎn)變，因此，本實驗選擇條件比較溫和的水提取和酶提取法進行試驗.取富硒臍橙樣品0.1 g，分別采用超聲水提法、蛋白酶酶解法對樣品進行提取，通過總硒和殘渣部分硒含量的差值計算出不同提取方法的提取率(以濕基計)，結(jié)果見表2.

表2 不同提取方法的提取效率

結(jié)果表明，超聲水提法與蛋白酶酶解法提取率相近.硒代氨基酸在植物中存在形式主要為游離態(tài)或與多肽、蛋白結(jié)合的結(jié)合態(tài)，水提取法提取的是游離的無機硒和小分子的可溶態(tài)硒化合物，蛋白酶能酶解與多肽和蛋白質(zhì)結(jié)合的有機硒，但臍橙的主要成分為纖維素、果膠、糖和檸檬酸等，蛋白含量非常少，所以水提法和蛋白酶酶解法提取率相似.對于臍橙中硒代氨基酸的檢測，蛋白酶酶解法提取過程耗時，水提取法提取速度快且提取液基質(zhì)相對更少，可以盡可能降低后期檢測基質(zhì)的干擾.本實驗選擇超聲水提取法提取臍橙中硒代氨基酸.

3.5 方法的線性范圍、檢出限、定量限

取SeCys2、MeSeCys和SeMet混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，逐級稀釋配制成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液并按優(yōu)化條件分析，選擇SeCys2(336.920 0>247.872 3)、MeSeCys(183.987 1>166.960 6)、SeMet(198.002 8>108.955 1)作為定量離子對，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，根據(jù)對應(yīng)離子對相應(yīng)強度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.以信噪比S/N=3計算方法檢出限(LOD)和S/N=10計算方法定量限(LOQ).SeCys2、MeSeCys和SeMet的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、方法檢出限和定量限見表3.3種硒代氨基酸在5 ng/mL～100 ng/mL線性范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2≥0.997，SeCys2、MeSeCys、SeMet的檢出限分別為6 ng/mL、10 ng/mL、1 ng/mL，定量限分別為18 ng/mL、35 ng/mL、3 ng/mL.

表3 3種硒代氨基酸的線性關(guān)系、檢出限與定量限

3.6 加標(biāo)回收實驗

取普通臍橙試樣,按1.2.3超聲水提取法提取,提取液超濾后作為基質(zhì)，進行加標(biāo)回收實驗.根據(jù)3種硒代蛋氨酸檢出限水平不同，為了準(zhǔn)確測定，分別設(shè)置不同的加標(biāo)水平，每個添加水平進行6次平行實驗，計算3種硒代氨基酸的回收率和精密度，結(jié)果見表4.結(jié)果表明，3種硒代氨基酸的加標(biāo)回收率在78.8%～92.2%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.1%～7.5%之間，說明方法可以滿足臍橙樣品中的SeCys2、MeSeCys和SeMet的定性、定量檢測，但基質(zhì)對3種硒代氨基酸分析均有干擾，干擾程度依次為MeSeCys>SeCys2>SeMet.

表4 臍橙皮中3種硒代氨基酸形態(tài)的加標(biāo)回收率和精密度(n=6)

4 結(jié)論

本文建立了UPLC-Q-TOF-MS測定臍橙中硒代氨基酸的分析方法.通過比較超聲水提法、蛋白酶酶解法提取率，發(fā)現(xiàn)對于蛋白含量極少的臍橙，其硒代氨基酸主要以游離態(tài)存在.實驗選擇更加快捷的超聲水提法進行樣品提取，經(jīng)過超濾離心管去除大分子干擾后再分析，通過方法學(xué)驗證，方法可用于臍橙中SeCys2、MeSeCys和SeMet的檢測，但基質(zhì)對3種硒代氨基酸分析均有一定干擾.在儀器最優(yōu)條件下對贛南富硒臍橙中3種硒代氨基酸進行檢測，試驗結(jié)果表明所采集的贛南富硒臍橙中3種硒代氨基酸含量均低于方法檢出限.