喻 娜，黃勇盛，黃 旭

（廣安職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川廣安 638000）

旱半夏（Pinellia ternata）也稱為半夏、三步跳、麻芋等，天南星科半夏屬多年生草本植物[1]。旱半夏是一種重要的中藥材，塊莖入藥，塊莖的成分75%左右為淀粉，除此之外還含有β-谷甾醇-D-葡萄糖甙、半夏蛋白、鞣質(zhì)、生物堿、多種氨基酸、原兒茶醛及18 種微量元素等藥用成分[2-5]。旱半夏具有鎮(zhèn)咳、祛痰、降壓、健脾胃、止嘔吐、降脂、抗心律失常、抗壞血栓、抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗癲癇、減輕動(dòng)脈粥樣硬化等藥理作用，在我國(guó)中醫(yī)藥史上有著廣闊的前景[6-9]。

已有研究表明，在植物組織培養(yǎng)過(guò)程中，體細(xì)胞無(wú)性系在分子水平或染色體水平的變異是普遍存在的一種現(xiàn)象[10]。近年來(lái)，簡(jiǎn)單重復(fù)序列間區(qū)（inter simple sequence repeat，ISSR）標(biāo)記技術(shù)常常應(yīng)用于動(dòng)植物的親緣關(guān)系和遺傳多樣性進(jìn)行分析，并在遺傳學(xué)研究中發(fā)揮著重要的作用。ISSR技術(shù)已成為DNA分子標(biāo)記技術(shù)中的一個(gè)熱點(diǎn)，由Zietkeiwitcz 等[11]于1994年提出，它是在簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR）基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的1 種新型分子標(biāo)記技術(shù)。該技術(shù)結(jié)合了SSR 和RAPD 技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，具有操作簡(jiǎn)單、試驗(yàn)穩(wěn)定性好、多態(tài)性豐富、重復(fù)性強(qiáng)、DNA 模板用量少和實(shí)驗(yàn)成本低等優(yōu)點(diǎn)[12-15]，已廣泛應(yīng)用于種群間或種群內(nèi)的遺傳多樣性、遺傳差異性、遺傳穩(wěn)定性分析，對(duì)了解種群遺傳變異的大小、時(shí)空分布及其與環(huán)境變化和人類活動(dòng)的關(guān)系，了解藥用植物種群起源、進(jìn)化歷程和現(xiàn)今分布格局，以及開展藥用植物種質(zhì)資源育種和采取科學(xué)有效的保護(hù)措施均具有指導(dǎo)意義[16-18]。

此前，已有將分子標(biāo)記法應(yīng)用到天南星科植物領(lǐng)域的遺傳學(xué)分析中的研究，如鄧瑞寧利用SRAP 技術(shù)對(duì)10種不同葉形荊半夏的遺傳多樣性及親緣關(guān)系進(jìn)行了分析[19]，成玉等應(yīng)用AFLP 技術(shù)探討半夏屬五個(gè)種的親緣關(guān)系[20]，但對(duì)旱半夏組培苗遺傳穩(wěn)定性的研究還未見報(bào)道，本項(xiàng)目采用ISSR分子標(biāo)記法對(duì)旱半夏組培苗繼代五代苗、八代苗、十一代苗、五十代混合組培苗、六十代混合組培苗進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性分析，以期進(jìn)一步為旱半夏組培苗推廣種植提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)材料采自四川省武勝縣萬(wàn)民村（經(jīng)緯度：106.431 56，30.375 21）野生旱半夏，將野生旱半夏移栽至花盆，帶回實(shí)驗(yàn)室，以野生旱半夏葉片為外植體，經(jīng)組培室誘導(dǎo)愈傷再生并繼代培養(yǎng)，將野生植株、繼代五代、繼代八代、繼代十一代、繼代五十代，繼代六十代組培苗作為供試材料。

1.2 DNA的提取和檢測(cè)

取旱半夏嫩葉和莖，利用《BioFastSpin 植物基因組DNA提取試劑盒》分別提取總DNA，電泳結(jié)果分析表明，電泳條帶整齊、明亮清晰、無(wú)拖尾現(xiàn)象，無(wú)蛋白污染，提取的旱半夏基因組DNA 質(zhì)量較好，樣本適用于ISSR-PCR 檢測(cè)（見圖1）。將樣品放置在-20 ℃冰箱保存。

圖1 提取的旱半夏總DNA電泳檢測(cè)

1.3 PCR擴(kuò)增

實(shí)驗(yàn)用Biospin 全能型植物基因組DNA 提取試劑盒購(gòu)買自杭州博日科技有限公司，其他普通化學(xué)試劑則購(gòu)自南寧國(guó)拓生物科技有限公司，采用DL2000 Marker 作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。引物是從加拿大哥倫比亞大學(xué)公布的100 條UBC-ISSR 引物中篩選出的6 條（見表1），篩選出來(lái)的引物由上海生工（San-gon）合成。在（Easy Cycler）梯度PCR 儀（德國(guó)，AnalytikJena）上進(jìn)行PCR 反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)使用20 μL 體系，10 μL Mix，1 μL 引物，1 μL DNA 模板，8 μL ddH2O，94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s；56 ℃復(fù)性45 s；72 ℃延伸90 s；40 個(gè)循環(huán)：72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。通過(guò)PAGE 電泳及銀染。在5200 Multi（上海天能）全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光/熒光圖像分析系統(tǒng)中記錄擴(kuò)增結(jié)果。

表1 UBC引物系列

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析

通過(guò)人工識(shí)別的方式統(tǒng)計(jì)旱半夏不同代數(shù)的凝膠電泳圖譜條帶數(shù)目。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖2 是利用篩選出來(lái)的6 條引物對(duì)旱半夏野生苗和組培第五代、第八代、第十一代組培苗進(jìn)行ISSRPCR 擴(kuò)增的圖譜，野生型紙質(zhì)同組培苗的帶型和亮度基本一致，第46條引物擴(kuò)增出來(lái)的條帶中，組培苗出現(xiàn)了一條多態(tài)性條帶，組培苗第五代、第八代和第十一代的帶型和亮度完全一致，組培苗之間保持了一致（圖2-A、圖2-B）。ISSR 分子標(biāo)記的分析結(jié)果表明，繼代到第十一代的旱半夏組培苗與野生型旱半夏苗基本沒有差異。

圖2 引物18、25、26、46、55、62在野生植株、第五代、第八代、第十一代組培苗ISSR-PCR擴(kuò)增的條帶

圖3 是利用篩選出來(lái)的6 條引物對(duì)旱半夏野生苗和組培第五十代、第六十代組培苗ISSR-PCR 擴(kuò)增的電泳圖譜。從圖譜中看，在旱半夏繼代的過(guò)程中，6條引物擴(kuò)增出來(lái)的電泳圖譜基本和野生苗的帶型保持一致，沒有發(fā)生明顯變化。其中25 號(hào)引物和46 號(hào)引物擴(kuò)增的第五十代和第六十代組培苗分別出現(xiàn)了一條特異性條帶，第五十代和第六十代組培苗之間完全保持一致（見圖3），因此可以認(rèn)為旱半夏在六十代的繼代過(guò)程中具有較高的遺傳穩(wěn)定性。

圖3 引物18、25、26、46、55、62在野生植株、第五十代、第六十代組培苗ISSR-PCR擴(kuò)增的條帶

2.2 旱半夏野生植株與不同組培苗之間的遺傳差異性分析

篩選的6 條引物對(duì)旱半夏野生苗和組培第五代、第八代、第十一代的組培苗進(jìn)行ISSR-PCR 擴(kuò)增，總共擴(kuò)增出110 條條帶，組培苗在擴(kuò)增的幾代過(guò)程中電泳條帶帶型基本一致，其中46號(hào)引物擴(kuò)增的條帶中發(fā)現(xiàn)，從組培苗第五代出現(xiàn)了一條多態(tài)性條帶，多態(tài)性比例僅僅只有0.88%（見表2）。

篩選的6條引物對(duì)旱半夏野生苗和組培第五十代、第六十代的組培苗ISSR-PCR擴(kuò)增，總共擴(kuò)增出116條多態(tài)性條帶，其中25 號(hào)引物和46 號(hào)引物擴(kuò)增的第五十代和第六十代組培苗分別出現(xiàn)了一條特異性條帶，多態(tài)性比例為1.42%（見表3）。

表3 野生植株與第五十代、第六十代組培苗遺傳差異性

3 討論

對(duì)于藥用價(jià)值極高的旱半夏，采用組培技術(shù)進(jìn)行快繁和生產(chǎn)，關(guān)鍵是保持其性狀。旱半夏組培苗一般通過(guò)外植體葉片或者莖誘導(dǎo)愈傷組織，然后再?gòu)挠鷤M織分化出再生植株，整個(gè)培養(yǎng)和繼代的過(guò)程長(zhǎng)期使用植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，使生長(zhǎng)點(diǎn)分生組織長(zhǎng)期處于活躍的狀態(tài)，可能引起變異。

對(duì)品種遺傳變異檢測(cè)傳統(tǒng)的方法主要是通過(guò)植物形態(tài)學(xué)進(jìn)行鑒定和分析，但由于植株的很多基因水平的變異不一定表現(xiàn)出性狀，因此僅僅依靠形態(tài)學(xué)觀察很難準(zhǔn)確的檢測(cè)。而采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)快速、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)單，可以從基因組DNA 的多態(tài)性信息分析，并直接從DNA 水平反映堿基序列片段的變化，因此，可以從分子水平上闡明組培苗遺傳穩(wěn)定性的分子機(jī)理。

本研究應(yīng)用ISSR 分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)旱半夏組培苗第五代、第八代、第十一代進(jìn)行DNA 檢測(cè)，以及對(duì)在實(shí)驗(yàn)室繼代了3 年的第五十代、第六十代苗分別混合批量進(jìn)行ISSR 分析，得到的DNA 片段帶型基本一致，擴(kuò)繁到六十代多態(tài)性僅僅在1.42%，證明組培苗在DNA 水平上基本保持了遺傳穩(wěn)定性。這與前人關(guān)于草莓[21]、桉樹[17]、葉藝春蘭[22]等植物組培苗遺傳穩(wěn)定性的研究報(bào)道一致。由此可見，將組培技術(shù)用于中藥材植物旱半夏的快速繁殖是可行的。