蔡 婕 許金娜 倪穗琴

廣州市第一人民醫(yī)院臨床藥學(xué)科 (廣州 510180)

亞胺培南(imipenem, IMP)是重癥感染患者常用的碳青霉烯類抗菌藥物，適用于多種病原體所致和需氧/厭氧菌引起的混合感染[1]。重癥感染患者病情復(fù)雜，同時(shí)常合并多臟器功能衰竭、低蛋白血癥以及臟器替代支持治療(如連續(xù)腎替代治療或體外膜肺氧合等)，從而導(dǎo)致患者出現(xiàn)水鈉潴留、血流再分布等現(xiàn)象，藥動(dòng)學(xué)行為難以預(yù)測(cè)[2]，此時(shí)依舊按照經(jīng)驗(yàn)用藥可能導(dǎo)致患者血藥濃度過(guò)高或不達(dá)標(biāo)，繼而出現(xiàn)不良反應(yīng)或療效不佳。

亞胺培南為時(shí)間依賴性抗菌藥物，通常推薦日劑量分多次給藥和(或)延長(zhǎng)滴注時(shí)間來(lái)增加臨床療效，評(píng)價(jià)該類藥物療效的相關(guān)參數(shù)為游離抗菌藥的%T>MIC，即%fT>MIC(血藥濃度維持在最低抑菌濃度以上的時(shí)間)[3]。普通患者達(dá)到40%T>MIC可達(dá)到殺菌效果，多重耐藥菌或重癥感染時(shí)需達(dá)到100%T>MIC，甚至40%T>4～5×MIC[4]才能獲得較佳療效。因此，對(duì)重癥患者進(jìn)行治療藥物監(jiān)測(cè)，有助于臨床及時(shí)調(diào)整劑量，制定個(gè)體化給藥方案[5]。

相比于其他抗菌藥物，亞胺培南在血漿中不穩(wěn)定，易受溫度、pH值等影響[6-7]，因此，臨床標(biāo)本保存方式不當(dāng)或未在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)送檢，會(huì)造成測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確。本研究旨在建立HPLC法測(cè)定亞胺培南血藥濃度，并考察在不同條件下的穩(wěn)定性，以期建立規(guī)范的臨床標(biāo)本采樣流程，為開(kāi)展亞胺培南TDM提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 儀器與試藥

高效液相色譜儀(HPLC 1260，美國(guó)Agilent公司)；電子分析天平(CPA225D，德國(guó)Sartorius公司)；離心機(jī)(H1650，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器)；渦旋儀(NP-30S，上海精科實(shí)業(yè)有限公司)；超聲波清洗機(jī)(KQ-300DE，昆山市超聲儀器有限公司)。

亞胺培南標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)CS30026-F67081，純度：92.5%，EP歐洲藥品健康管理局)；乙腈，甲醇(色譜純，德國(guó)Merck公司)；3-(N-嗎啉基)丙磺酸(3-morpholinopropanesulfonic acid,MOPS)(批號(hào)：M105135，含量：99.5%，上海阿拉丁公司)；乙酸銨、氫氧化鈉均為分析純。

1.2 色譜條件

流動(dòng)相：0.01 mol·L-1乙酸銨溶液(pH 6.8)：乙腈=95∶5；色譜柱：Agilent Zorbax SB-AQ(4.6 mm×250 mm，5 μm)；進(jìn)樣量：30 μL；流速：1.0 mL·L-1；柱溫：30 ℃；紫外波長(zhǎng)：298 nm。

1.3 溶液配置

1.3.1 穩(wěn)定劑配制 將2.64 g MOPS粉末溶于100 mL超純水中，再用1 mol·L-1NaOH調(diào)節(jié)pH值至6.8，混勻后過(guò)濾，4 ℃冷藏備用。

1.3.2 儲(chǔ)備液配制 精密稱取適量亞胺培南標(biāo)準(zhǔn)品于容量瓶中，加入MOPS制成約1 mg·mL-1儲(chǔ)備液并分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 血漿樣本處理

實(shí)驗(yàn)室收到患者血樣后，將血樣以3 000 r·min-1離心5 min，然后精密吸取血樣與MOPS各100 μL(1∶1)，再加入乙腈300 μL，渦旋混勻，14 000 r·min-1離心5 min，取上清液進(jìn)樣。

1.5 方法學(xué)驗(yàn)證

1.5.1 專屬性試驗(yàn) 在上述色譜條件下分別將空白血漿、空白血漿+亞胺培南和用藥患者血漿進(jìn)樣，并將圖譜進(jìn)行比對(duì)，考察方法的專屬性。

1.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量下限 用MOPS將亞胺培南儲(chǔ)備液稀釋為3.30、6.60、13.20、26.40、52.80、105.60 μg·mL-1的溶液，再加入等比例空白血漿，以濃度x為橫坐標(biāo)，峰面積A為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析，定量下限為信噪比等于10。

1.5.3 準(zhǔn)確度與精密度 亞胺培南儲(chǔ)備液用MOPS稀釋為0.41、0.83、52.80和70.40 μg·mL-1的溶液各5份，并加入等比例空白血漿，連續(xù)測(cè)定3批樣品(分兩天進(jìn)行)，得出平均濃度測(cè)定值，計(jì)算方法的回收率、批間和批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD，分別考察方法的準(zhǔn)確度和精密度。

1.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

1.5.4.1 穩(wěn)定性血漿 取亞胺培南儲(chǔ)備液100 μL，加入MOPS配制為低、中、高3個(gè)濃度(0.83、52.80和70.40 μg·mL-1)，并加入等比例(100 μL)空白血漿，在-20 ℃、4 ℃和室溫下分別放置2、4、6、12、18、24、48、72 h，在測(cè)定當(dāng)天處理血樣，考察加入MOPS中亞胺培南穩(wěn)定性。

1.5.4.2 非穩(wěn)定性血漿 取亞胺培南儲(chǔ)備液100 μL，加入空白血漿配制為低、中、高3個(gè)濃度(0.83、52.80和70.40 μg·mL-1)，在-20 ℃、4 ℃和室溫下分別放置2、4、6、12、18、24、48、72 h，在測(cè)定當(dāng)天，加入等比例(100 μL)MOPS，考察在未加入MOPS下亞胺培南穩(wěn)定性。

2 結(jié) 果

2.1 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.1.1 專屬性 由圖1可知，亞胺培南峰形良好，保留時(shí)間約為4.1 min，溶劑、血漿中內(nèi)源物質(zhì)等對(duì)其測(cè)定無(wú)干擾,見(jiàn)圖1。

圖1 HPLC法測(cè)定亞胺培南色譜圖A.空白血漿；B.空白血漿+亞胺培南；C.用藥患者血漿

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量下限 亞胺培南在3.30～105.60 μg·mL-1內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系，回歸方程為y=11.34x+1.117(R2=0.999 1)，定量下限為0.41 μg·mL-1。

2.1.3 準(zhǔn)確度與精密度 亞胺培南在四個(gè)濃度下(0.41、0.83、52.80和70.40 μg·mL-1)，批內(nèi)回收率為(97.83±2.75)%～(103.54±3.98)%，RSD為2.81%～7.17%；批間回收率為(99.43±3.74)%～(104.24±4.48)%，RSD為3.76%～11.97%，批內(nèi)和批間RSD均<15%，符合生物樣本測(cè)定要求(見(jiàn)表1)。

表1 亞胺培南血藥濃度測(cè)定方法的準(zhǔn)確度和精密度

2.1.4 穩(wěn)定性 在穩(wěn)定性血漿中，亞胺培南在-20 ℃或4 ℃下，放置72 h保留比例分別為93.93%和91.93%，在室溫放置18 h后，降解比例超過(guò)15%；在非穩(wěn)定性血漿中，在-20 ℃和4 ℃放置24 h保留比例在90%以上，在室溫放置6 h后，降解比例劇增，當(dāng)放置12 h時(shí)，降解比例接近20%(見(jiàn)圖2)。以上說(shuō)明加入MOPS時(shí)，亞胺培南在低溫條件下可穩(wěn)定72 h，在室溫可穩(wěn)定18 h；未加入MOPS時(shí)，亞胺培南在低溫下穩(wěn)定24 h，室溫穩(wěn)定6 h。

圖2 不同放置條件下亞胺培南的穩(wěn)定性

2.2 亞胺培南臨床標(biāo)本采樣流程建立

基于亞胺培南穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果，制定臨床標(biāo)本采樣流程(圖3)。臨床科室在采集患者血樣后，務(wù)必在6 h內(nèi)送檢，若無(wú)法立即送檢，則保存血樣于4 ℃冰箱內(nèi)，并在24 h內(nèi)送檢。實(shí)驗(yàn)室收到臨床樣本后，需立即進(jìn)行處理(加入穩(wěn)定劑并保存于冰箱內(nèi))，并在72 h檢測(cè)完畢，以保證亞胺培南測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

圖3 亞胺培南臨床標(biāo)本采樣流程

3 討 論

亞胺培南結(jié)構(gòu)中因C-N鍵自由旋轉(zhuǎn)受阻，因此存在一對(duì)旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體(順式A和反式B)[8]，一般情況下，該異構(gòu)體相互轉(zhuǎn)化、動(dòng)態(tài)平衡，但在測(cè)定血藥濃度時(shí)需要抑制異構(gòu)體的分離，避免出現(xiàn)寬峰或裂峰[9]。劉浩等[8]研究表明，溫度、pH等對(duì)異構(gòu)體分離有一定影響，柱溫越低，異構(gòu)體轉(zhuǎn)化速率降低，峰形易展寬并出現(xiàn)裂分[10]；pH越低，異構(gòu)體分離越大，因此在建立血藥濃度方法時(shí)，需提高柱溫并避免使用酸性流動(dòng)相。同時(shí)，考慮到亞胺培南易受溫度影響而降解，柱溫不宜設(shè)置過(guò)高。綜上，本方法將柱溫設(shè)為30 ℃，且流動(dòng)相選用中性溶液(乙酸銨緩沖液pH 6.8)。亞胺培南極性較強(qiáng)，摸索方法時(shí)緩沖液比例多在90%以上，為延長(zhǎng)色譜柱壽命，本試驗(yàn)選用耐純水的AQ色譜柱[11]。

由于亞胺培南穩(wěn)定性較差，溫度、pH值等對(duì)其穩(wěn)定性均有影響[12-13]，宜用中性緩沖液儲(chǔ)存[14]，本試驗(yàn)選擇MOPS(pH 6.8)作為穩(wěn)定劑[15-16]，并重點(diǎn)考察了不同溫度下，亞胺培南在穩(wěn)定性血漿(先加入MOPS)和非穩(wěn)定性血漿(測(cè)定時(shí)再加入MOPS)的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，相同溫度下，亞胺培南在穩(wěn)定性血漿中保留比例均大于非穩(wěn)定性血漿；低溫條件下(-20 ℃或4 ℃)保留比例均大于室溫，說(shuō)明低溫和加入穩(wěn)定劑有助于提高亞胺培南的穩(wěn)定性。在未加入穩(wěn)定劑時(shí)，亞胺培南在低溫條件下可保持24 h穩(wěn)定，在室溫時(shí)只能保持6 h穩(wěn)定，提示血樣采集后須立即送檢(室溫下不超過(guò)6 h)，若無(wú)法送檢，應(yīng)放置4 ℃不超過(guò)24 h；在穩(wěn)定性血漿中，亞胺培南在-20 ℃和4 ℃保存72 h均可滿足測(cè)定要求，因此，我科收到血樣后需立即進(jìn)行處理，并在72 h內(nèi)檢測(cè)完畢。

本研究建立的亞胺培南血藥濃度測(cè)定方法簡(jiǎn)便、靈敏、重復(fù)性好，可廣泛應(yīng)用于臨床。同時(shí)，基于穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果建立臨床標(biāo)本采樣流程，以規(guī)范臨床送檢時(shí)間和保證結(jié)果準(zhǔn)確，為亞胺培南治療藥物監(jiān)測(cè)提供科學(xué)依據(jù)。