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        HPLC法測定人血漿中亞胺培南濃度及建立臨床標本采樣流程

        2022-06-16 02:43:10許金娜倪穗琴
        廣州醫(yī)藥 2022年3期
        關(guān)鍵詞:培南血樣亞胺

        蔡 婕 許金娜 倪穗琴

        廣州市第一人民醫(yī)院臨床藥學科 (廣州 510180)

        亞胺培南(imipenem, IMP)是重癥感染患者常用的碳青霉烯類抗菌藥物,適用于多種病原體所致和需氧/厭氧菌引起的混合感染[1]。重癥感染患者病情復雜,同時常合并多臟器功能衰竭、低蛋白血癥以及臟器替代支持治療(如連續(xù)腎替代治療或體外膜肺氧合等),從而導致患者出現(xiàn)水鈉潴留、血流再分布等現(xiàn)象,藥動學行為難以預測[2],此時依舊按照經(jīng)驗用藥可能導致患者血藥濃度過高或不達標,繼而出現(xiàn)不良反應(yīng)或療效不佳。

        亞胺培南為時間依賴性抗菌藥物,通常推薦日劑量分多次給藥和(或)延長滴注時間來增加臨床療效,評價該類藥物療效的相關(guān)參數(shù)為游離抗菌藥的%T>MIC,即%fT>MIC(血藥濃度維持在最低抑菌濃度以上的時間)[3]。普通患者達到40%T>MIC可達到殺菌效果,多重耐藥菌或重癥感染時需達到100%T>MIC,甚至40%T>4~5×MIC[4]才能獲得較佳療效。因此,對重癥患者進行治療藥物監(jiān)測,有助于臨床及時調(diào)整劑量,制定個體化給藥方案[5]。

        相比于其他抗菌藥物,亞胺培南在血漿中不穩(wěn)定,易受溫度、pH值等影響[6-7],因此,臨床標本保存方式不當或未在規(guī)定的時間內(nèi)送檢,會造成測定結(jié)果不準確。本研究旨在建立HPLC法測定亞胺培南血藥濃度,并考察在不同條件下的穩(wěn)定性,以期建立規(guī)范的臨床標本采樣流程,為開展亞胺培南TDM提供科學依據(jù)。

        1 資料與方法

        1.1 儀器與試藥

        高效液相色譜儀(HPLC 1260,美國Agilent公司);電子分析天平(CPA225D,德國Sartorius公司);離心機(H1650,湖南湘儀實驗儀器);渦旋儀(NP-30S,上海精科實業(yè)有限公司);超聲波清洗機(KQ-300DE,昆山市超聲儀器有限公司)。

        亞胺培南標準品(批號CS30026-F67081,純度:92.5%,EP歐洲藥品健康管理局);乙腈,甲醇(色譜純,德國Merck公司);3-(N-嗎啉基)丙磺酸(3-morpholinopropanesulfonic acid,MOPS)(批號:M105135,含量:99.5%,上海阿拉丁公司);乙酸銨、氫氧化鈉均為分析純。

        1.2 色譜條件

        流動相:0.01 mol·L-1乙酸銨溶液(pH 6.8):乙腈=95∶5;色譜柱:Agilent Zorbax SB-AQ(4.6 mm×250 mm,5 μm);進樣量:30 μL;流速:1.0 mL·L-1;柱溫:30 ℃;紫外波長:298 nm。

        1.3 溶液配置

        1.3.1 穩(wěn)定劑配制 將2.64 g MOPS粉末溶于100 mL超純水中,再用1 mol·L-1NaOH調(diào)節(jié)pH值至6.8,混勻后過濾,4 ℃冷藏備用。

        1.3.2 儲備液配制 精密稱取適量亞胺培南標準品于容量瓶中,加入MOPS制成約1 mg·mL-1儲備液并分裝,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.4 血漿樣本處理

        實驗室收到患者血樣后,將血樣以3 000 r·min-1離心5 min,然后精密吸取血樣與MOPS各100 μL(1∶1),再加入乙腈300 μL,渦旋混勻,14 000 r·min-1離心5 min,取上清液進樣。

        1.5 方法學驗證

        1.5.1 專屬性試驗 在上述色譜條件下分別將空白血漿、空白血漿+亞胺培南和用藥患者血漿進樣,并將圖譜進行比對,考察方法的專屬性。

        1.5.2 標準曲線和定量下限 用MOPS將亞胺培南儲備液稀釋為3.30、6.60、13.20、26.40、52.80、105.60 μg·mL-1的溶液,再加入等比例空白血漿,以濃度x為橫坐標,峰面積A為縱坐標,進行線性回歸分析,定量下限為信噪比等于10。

        1.5.3 準確度與精密度 亞胺培南儲備液用MOPS稀釋為0.41、0.83、52.80和70.40 μg·mL-1的溶液各5份,并加入等比例空白血漿,連續(xù)測定3批樣品(分兩天進行),得出平均濃度測定值,計算方法的回收率、批間和批內(nèi)相對標準偏差(relative standard deviation,RSD,分別考察方法的準確度和精密度。

        1.5.4 穩(wěn)定性試驗

        1.5.4.1 穩(wěn)定性血漿 取亞胺培南儲備液100 μL,加入MOPS配制為低、中、高3個濃度(0.83、52.80和70.40 μg·mL-1),并加入等比例(100 μL)空白血漿,在-20 ℃、4 ℃和室溫下分別放置2、4、6、12、18、24、48、72 h,在測定當天處理血樣,考察加入MOPS中亞胺培南穩(wěn)定性。

        1.5.4.2 非穩(wěn)定性血漿 取亞胺培南儲備液100 μL,加入空白血漿配制為低、中、高3個濃度(0.83、52.80和70.40 μg·mL-1),在-20 ℃、4 ℃和室溫下分別放置2、4、6、12、18、24、48、72 h,在測定當天,加入等比例(100 μL)MOPS,考察在未加入MOPS下亞胺培南穩(wěn)定性。

        2 結(jié) 果

        2.1 方法學評價

        2.1.1 專屬性 由圖1可知,亞胺培南峰形良好,保留時間約為4.1 min,溶劑、血漿中內(nèi)源物質(zhì)等對其測定無干擾,見圖1。

        圖1 HPLC法測定亞胺培南色譜圖A.空白血漿;B.空白血漿+亞胺培南;C.用藥患者血漿

        2.1.2 標準曲線和定量下限 亞胺培南在3.30~105.60 μg·mL-1內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系,回歸方程為y=11.34x+1.117(R2=0.999 1),定量下限為0.41 μg·mL-1。

        2.1.3 準確度與精密度 亞胺培南在四個濃度下(0.41、0.83、52.80和70.40 μg·mL-1),批內(nèi)回收率為(97.83±2.75)%~(103.54±3.98)%,RSD為2.81%~7.17%;批間回收率為(99.43±3.74)%~(104.24±4.48)%,RSD為3.76%~11.97%,批內(nèi)和批間RSD均<15%,符合生物樣本測定要求(見表1)。

        表1 亞胺培南血藥濃度測定方法的準確度和精密度

        2.1.4 穩(wěn)定性 在穩(wěn)定性血漿中,亞胺培南在-20 ℃或4 ℃下,放置72 h保留比例分別為93.93%和91.93%,在室溫放置18 h后,降解比例超過15%;在非穩(wěn)定性血漿中,在-20 ℃和4 ℃放置24 h保留比例在90%以上,在室溫放置6 h后,降解比例劇增,當放置12 h時,降解比例接近20%(見圖2)。以上說明加入MOPS時,亞胺培南在低溫條件下可穩(wěn)定72 h,在室溫可穩(wěn)定18 h;未加入MOPS時,亞胺培南在低溫下穩(wěn)定24 h,室溫穩(wěn)定6 h。

        圖2 不同放置條件下亞胺培南的穩(wěn)定性

        2.2 亞胺培南臨床標本采樣流程建立

        基于亞胺培南穩(wěn)定性試驗結(jié)果,制定臨床標本采樣流程(圖3)。臨床科室在采集患者血樣后,務(wù)必在6 h內(nèi)送檢,若無法立即送檢,則保存血樣于4 ℃冰箱內(nèi),并在24 h內(nèi)送檢。實驗室收到臨床樣本后,需立即進行處理(加入穩(wěn)定劑并保存于冰箱內(nèi)),并在72 h檢測完畢,以保證亞胺培南測定結(jié)果的準確性。

        圖3 亞胺培南臨床標本采樣流程

        3 討 論

        亞胺培南結(jié)構(gòu)中因C-N鍵自由旋轉(zhuǎn)受阻,因此存在一對旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體(順式A和反式B)[8],一般情況下,該異構(gòu)體相互轉(zhuǎn)化、動態(tài)平衡,但在測定血藥濃度時需要抑制異構(gòu)體的分離,避免出現(xiàn)寬峰或裂峰[9]。劉浩等[8]研究表明,溫度、pH等對異構(gòu)體分離有一定影響,柱溫越低,異構(gòu)體轉(zhuǎn)化速率降低,峰形易展寬并出現(xiàn)裂分[10];pH越低,異構(gòu)體分離越大,因此在建立血藥濃度方法時,需提高柱溫并避免使用酸性流動相。同時,考慮到亞胺培南易受溫度影響而降解,柱溫不宜設(shè)置過高。綜上,本方法將柱溫設(shè)為30 ℃,且流動相選用中性溶液(乙酸銨緩沖液pH 6.8)。亞胺培南極性較強,摸索方法時緩沖液比例多在90%以上,為延長色譜柱壽命,本試驗選用耐純水的AQ色譜柱[11]。

        由于亞胺培南穩(wěn)定性較差,溫度、pH值等對其穩(wěn)定性均有影響[12-13],宜用中性緩沖液儲存[14],本試驗選擇MOPS(pH 6.8)作為穩(wěn)定劑[15-16],并重點考察了不同溫度下,亞胺培南在穩(wěn)定性血漿(先加入MOPS)和非穩(wěn)定性血漿(測定時再加入MOPS)的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示,相同溫度下,亞胺培南在穩(wěn)定性血漿中保留比例均大于非穩(wěn)定性血漿;低溫條件下(-20 ℃或4 ℃)保留比例均大于室溫,說明低溫和加入穩(wěn)定劑有助于提高亞胺培南的穩(wěn)定性。在未加入穩(wěn)定劑時,亞胺培南在低溫條件下可保持24 h穩(wěn)定,在室溫時只能保持6 h穩(wěn)定,提示血樣采集后須立即送檢(室溫下不超過6 h),若無法送檢,應(yīng)放置4 ℃不超過24 h;在穩(wěn)定性血漿中,亞胺培南在-20 ℃和4 ℃保存72 h均可滿足測定要求,因此,我科收到血樣后需立即進行處理,并在72 h內(nèi)檢測完畢。

        本研究建立的亞胺培南血藥濃度測定方法簡便、靈敏、重復性好,可廣泛應(yīng)用于臨床。同時,基于穩(wěn)定性試驗結(jié)果建立臨床標本采樣流程,以規(guī)范臨床送檢時間和保證結(jié)果準確,為亞胺培南治療藥物監(jiān)測提供科學依據(jù)。

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