鄧勁 楊錦華,2 康梅,*

(1 四川大學(xué)華西醫(yī)院實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)科臨床微生物室，成都 610041；2 蒼溪縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣元 628400)

細(xì)菌獲得性耐藥主要是由于細(xì)菌對(duì)相關(guān)抗菌藥物產(chǎn)生不同程度的抗性或耐受性，影響臨床治療效果，甚至造成耐藥菌株不地?cái)嗦雍蛡鞑?，最終導(dǎo)致耐藥性細(xì)菌的暴發(fā)[1-2]。隨著抗菌藥物大量使用，細(xì)菌耐藥成為威脅人類健康的公共衛(wèi)生問題，不同國家、地區(qū)的細(xì)菌耐藥情況及臨床分布有所不同[3-4]。為了解本院菌種分離情況和耐藥菌株的變化趨勢(shì)，能夠有效地幫助臨床控制耐藥細(xì)菌傳播，為臨床醫(yī)生合理用藥提供可靠依據(jù)，及時(shí)更新用藥方案，以防細(xì)菌廣泛性耐藥[5]。本文回顧性分析臨床微生物室分離的15908株細(xì)菌菌譜及耐藥監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)，整理報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來源

2019年度臨床分離菌共15908株，同一患者不同送檢標(biāo)本所培養(yǎng)出的相同菌株，不進(jìn)行重復(fù)統(tǒng)計(jì)；不合格(革蘭染色涂片結(jié)果為鱗狀上皮細(xì)胞＞25個(gè)/LP，WBC＜10個(gè)/LP)的痰液分離菌株該標(biāo)準(zhǔn)參考中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS/T499-2017《下呼吸道感染細(xì)菌培養(yǎng)操作指南》，及厭氧菌、真菌、分枝桿菌、諾卡菌、其他需氧放線菌、支原體不納入本次監(jiān)測(cè)范圍。

1.2 培養(yǎng)基、儀器及試劑

1.2.1 培養(yǎng)基

藥敏試驗(yàn)用Mueller-Hinton瓊脂平皿，肺炎鏈球菌及各組鏈球菌用含5%綿羊血瓊脂平皿，流感嗜血菌用HTM平皿；血培養(yǎng)瓶(法國生物梅里埃公司)，全自動(dòng)血培養(yǎng)儀報(bào)陽后按照血培養(yǎng)瓶類型轉(zhuǎn)種平皿，需氧血培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)種5%綿羊血瓊脂平皿和普通巧克力瓊脂平皿(未加抗生素)，厭氧血培養(yǎng)瓶在需氧血培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)種方案上增加厭氧血平皿。以上平皿除厭氧血平皿由重慶龐通醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)外，其余均為鄭州安圖生物股份有限公司生產(chǎn)。

1.2.2 儀器

BACT/ALERT 3D全自動(dòng)血培養(yǎng)儀(法國生物梅里埃公司)，全自動(dòng)生化鑒定及藥敏系統(tǒng)(Vitek 2 Compact，法國生物梅里埃公司)，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS，德國Bruker Corporation)，35℃電熱恒溫培養(yǎng)箱(四川浩洋醫(yī)療器械有限公司)，CO2培養(yǎng)箱(賽默飛世爾科技有限公司)。

1.2.3 試劑

全自動(dòng)生化鑒定和藥敏卡(GN,GP,GN67,XNO4,GP67,GP68)為法國生物梅里埃公司產(chǎn)品，抗菌藥物紙片為Oxoid公司產(chǎn)品，E-test條為鄭州安圖生物公司產(chǎn)品，包括青霉素、紅霉素、克林霉素、慶大霉素、利福平、復(fù)方磺胺甲噁唑、利奈唑胺、萬古霉素、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、氨芐西林、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢吡肟、亞胺培南、美羅培南、厄他培南、阿米卡星等，微量肉湯稀釋法為溫州康泰生物科技有限公司產(chǎn)品，包括多黏菌素B、替加環(huán)素。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌鑒定

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)進(jìn)行鑒定且分值≥2.0；采用直接涂布法，挑取單個(gè)待檢菌落涂布靶板，滴加1 μL 70%甲酸，自然干燥后再滴加1 μL基質(zhì)液即可。

1.3.2 藥敏試驗(yàn)

多數(shù)藥敏試驗(yàn)上自動(dòng)化藥敏測(cè)定系統(tǒng)(Vitek 2 Compact)及配套的藥敏卡，部分試驗(yàn)采用紙片擴(kuò)散法(Kirby-Bauer，KB)，對(duì)于少見耐藥或罕見耐藥表型或矛盾耐藥表型時(shí)采用E-test條或微量肉湯稀釋法復(fù)檢。質(zhì)控菌株按照CLSI要求，為金黃色葡萄球菌ATCC25923、金黃色葡萄球菌ATCC29213、大腸埃希菌ATCC25922、大腸埃希菌ATCC35218、肺炎克雷伯菌ATCC700603、銅綠假單胞菌ATCC27853、流感嗜血菌ATCC49247、肺炎鏈球菌ATCC49619等。

1.3.3 手工藥敏試驗(yàn)

流感嗜血菌藥敏試驗(yàn)采用KB法，黏液性銅綠假單胞菌藥敏試驗(yàn)采用KB法，棒桿菌藥敏試驗(yàn)采用MIC法。

1.3.4 β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)

頭孢硝噻吩紙片定性檢測(cè)流感嗜血菌、黏膜炎莫拉菌、淋病奈瑟菌，若陽性可預(yù)測(cè)對(duì)青霉素酶不穩(wěn)定青霉素類耐藥。

1.3.5 克雷伯菌屬(肺炎克雷伯菌和產(chǎn)酸克雷伯菌)、大腸埃希菌和奇異變形桿菌超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBL)檢測(cè)

ESBL初篩陽性標(biāo)準(zhǔn)：克雷伯菌屬(肺炎克雷伯菌和產(chǎn)酸克雷伯菌)、大腸埃希菌對(duì)頭孢泊肟、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢曲松或氨曲南中任一藥物耐藥，奇異變形桿菌對(duì)頭孢泊肟、頭孢他啶或頭孢噻肟任一藥物耐藥；ESBL確證陽性標(biāo)準(zhǔn)：頭孢他啶和頭孢他啶/克拉維酸或頭孢噻肟和頭孢噻肟/克拉維酸中任一藥物，加與不加克拉維酸抑菌圈相比增加5mm時(shí)，判定為產(chǎn)ESBL。

1.3.6 藥敏復(fù)核

(1)青霉素敏感金黃色葡萄球菌檢測(cè) 首先使用頭孢硝噻吩紙片檢測(cè)，若陰性則進(jìn)一步進(jìn)行青霉素邊緣實(shí)驗(yàn)。

(2)青霉素不敏感肺炎鏈球菌檢測(cè) 1 μg/片苯唑西林紙片測(cè)定復(fù)核菌的抑菌圈直徑，若≤19mm采用青霉素E-test 測(cè)定MIC值。

(3)耐萬古霉素腸球菌的檢測(cè) 對(duì)萬古霉素非敏感的菌株，用萬古霉素 E-test 復(fù)核 MIC值。

(4)替加環(huán)素和多黏菌素B耐藥株檢測(cè) 對(duì)替加環(huán)素和多黏菌素B非敏感菌株，采用微量肉湯稀釋法復(fù)核MIC值。

(5)碳青霉烯耐藥腸桿菌目細(xì)菌(CRE)檢測(cè) 對(duì)美羅培南、亞胺培南或厄他培南中任一藥物耐藥的腸桿菌，對(duì)于初次分離的耐藥株需用KB法或稀釋法復(fù)核。

1.3.7 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)

按照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)2020版文件判讀。

1.4 監(jiān)測(cè)指標(biāo)

監(jiān)測(cè)耐藥菌株檢出和分布情況、不同菌株對(duì)不同抗菌藥的耐藥性情況。

1.5 數(shù)據(jù)分析

全年耐藥菌數(shù)據(jù)分析用 WHONET 5.6軟件

2 結(jié)果

2.1 分離病原菌分布及來源

2019年1—12月共分離非重復(fù)株細(xì)菌15908株，所有病原菌中呼吸道標(biāo)本占約36.8%(5857/15908)、尿液標(biāo)本占約17.8%(2826/15908)、傷口分泌物標(biāo)本占約16.0%(2544/15908)、血液標(biāo)本占約12.0%(1912/15908)、腦脊液、胸腹腔積液及膽汁占約16.7%(2659/15908)。主要科室來源為門/急診科14.4%(2297/15908)、呼吸內(nèi)科4.9%(792/15908)、ICU 3.9%(633/159088)、泌尿外科3.3%(531/15908)、神經(jīng)外科3.2%(515/15908)。

2.2 臨床病原菌分布特點(diǎn)

15908 株細(xì)菌中，革蘭陽性菌共4880株，約占30.7%，其中葡萄球菌2387株，約占48.9%，腸球菌屬1120株，約占22.9%，α溶血性鏈球菌374株，約占7.6%，β溶血性鏈球菌112株，約占2.3%，棒桿菌屬110株，約占2.2%。革蘭陰性菌共10938株，約占69.3%，其中腸桿菌目6058株，約占55.4%，非發(fā)酵菌4175株，約占38.2%，苛養(yǎng)菌(肺炎鏈球菌、流感嗜血菌與黏膜炎莫拉菌)共766株，約占4.8%，見表1。

表1 15908株細(xì)菌菌譜分布Tab.1 Distribution of 15,908 bacterial strains

2.3 常見細(xì)菌對(duì)抗生素的體外藥敏情況

金黃色葡萄球菌中MRSA菌株27.6%；未發(fā)現(xiàn)VISA和VRSA菌株。屎腸球菌對(duì)萬古霉素和利奈唑胺的耐藥率分別為1.3%和0.3%；糞腸球?qū)芜虬返哪退幝蕿?.9%，未發(fā)現(xiàn)萬古霉素耐藥株。見表2。分離出肺炎鏈球菌154株，2株來源于腦脊液，均為RRSP，MIC值分別為0.5和1，PRSP的分離率1.3%，未分分離出對(duì)萬古霉素和利奈唑胺的耐藥株，見表3。

表2 主要革蘭陽性菌對(duì)常見抗生素的耐藥率(%)Tab.2 The resistance rate of major gram-positive stain to antibacterial agent (%)

表3 肺炎鏈球菌對(duì)常見抗生素的耐藥率(%)和敏感率(%)Tab.3 Resistance rate (%) and sensitivity rate (%) of Streptococcus pneumoniae to antibacterial agents

2019年共分離革蘭陰性菌10938株，以大腸埃希菌為主，占22.2%，其次是克雷伯菌屬、鮑曼不動(dòng)桿菌及銅綠假單胞菌。大腸埃希菌對(duì)氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林、頭孢他啶、慶大霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星的耐藥率高于克雷伯菌屬，而哌拉西林/他做巴坦、頭孢吡肟、亞胺培南、阿米卡星的耐藥率低于克雷伯菌屬大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌對(duì)亞胺培南的耐藥率分別為1.5%和16.5%；非發(fā)酵菌中鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)所有抗生素的耐藥率均高于銅綠假單胞菌，鮑曼不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌對(duì)亞胺培南的耐藥率分別為59.4%和18.2%。大腸埃希菌、克雷伯菌屬(肺炎克雷伯菌和產(chǎn)酸克雷伯菌)以及奇異變形桿菌中產(chǎn)ESBLs菌株分離率分別占56.4%、47.2%和45.8%，見表4。

表4 主要革蘭陰性菌對(duì)常見抗生素的耐藥率(%)Tab.4 Resistance rate of major gram-negative stain to antibacterial agent (%)

2019年分離出514株流感嗜血菌和98株黏膜炎莫拉菌，β-內(nèi)酰胺酶檢出率分別為71.2%和87.4%，未發(fā)現(xiàn)對(duì)美羅培南不敏感的流感嗜血菌，未分離出對(duì)頭孢曲松非敏感菌株，黏膜炎莫拉菌對(duì)阿奇霉素和紅霉素的非敏感率均為1.6%，見表5。110株棒桿菌屬(紋帶棒桿菌87株，占79.1%)除對(duì)慶大霉素和利福平的耐藥率較低，分別為14.5%和12.0%，其余抗生素的耐藥率均較高，未發(fā)現(xiàn)對(duì)萬古霉素和利奈唑胺耐藥的棒桿菌屬，見表6。

表5 流感嗜血菌和黏膜炎莫拉菌對(duì)常見抗生素的耐藥率(%)和敏感率(%)Tab.5 Resistance rate (%) and sensitivity rate (%) of Haemophilus influenzae and Moraxella catarrhalis to antibacterial agents

表6 棒桿菌屬對(duì)常見抗生素的耐藥率(%)和敏感率(%)Tab.6 Resistance rate (%) and sensitivity rate (%) of Corynebacterium spp to antibacterial agents

碳青霉烯類耐藥的肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌科室來源前3位為ICU、神經(jīng)外科和急診科，耐藥株標(biāo)本類型均主要來源于呼吸道，其次是傷口分泌物標(biāo)本，見表7～8。

表7 耐碳青霉烯類藥物菌株的科室來源及檢出率Tab.7 Department sources and detection rates of carbapenem-resistant strains

2.4 多重耐藥分離變化趨勢(shì)

金黃色葡萄球菌中MRSA菌株比例與2018年相比有所上升(27.6% vs 24.4%)；碳青酶烯耐藥肺炎克雷伯菌和碳青酶烯類耐藥的銅綠假單胞菌菌與2018年相比均有所下降(16.2% vs 17.2%，18.2% vs 22.6%)；碳青酶烯耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌相比2018年下降較明顯(61.2% vs 72.1%)。近年來常見多重耐藥細(xì)菌變化趨勢(shì)見圖1。

3 討論

2019年共分離15908株非重復(fù)細(xì)菌，較2018年增長12.3%(1950/15908)，革蘭陰性菌仍占最大比例，排在前5位的細(xì)菌依次是大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌，與2018年前5位細(xì)菌有所不同，嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌上升至第5位；革蘭陽性菌依然以金黃色葡萄球菌為主。

表8 耐碳青霉烯類藥物菌株的標(biāo)本類型分布及檢出率Tab.8 Specimen type distribution and rate of carbapenem resistant strains

從標(biāo)本送檢情況分析，呼吸道和尿液標(biāo)本仍占主要部分，無菌體液標(biāo)本送檢率仍待提高，其實(shí)無菌體液標(biāo)本檢驗(yàn)價(jià)值更高，臨床意義更大，更能幫助臨床醫(yī)生指導(dǎo)其診斷及用藥，無菌體液包括血液、 腦脊液、胸腹水、膽汁和關(guān)節(jié)液等，血培養(yǎng)結(jié)果對(duì)感染性疾病的診斷、治療和預(yù)后都有極為重要的意義，因此應(yīng)繼續(xù)加強(qiáng)臨床對(duì)血培養(yǎng)的規(guī)范采集的宣講，并需提高血培養(yǎng)及無菌體液的送檢意識(shí)[4]。

近年來隨著臨床大量碳青霉烯類抗菌藥物的使用，造成革蘭陰性菌對(duì)其耐藥性和耐藥率逐年上升，已經(jīng)成為目前全國臨床耐藥菌中關(guān)注的重點(diǎn)。在2018年以前，本院細(xì)菌對(duì)碳青酶烯類耐藥率的持續(xù)增長，肺炎克雷伯菌對(duì)碳青霉烯類耐藥率從2016年的3.7%增長到2018年的17.2%，銅綠假單胞菌對(duì)碳青酶烯類的耐藥率從2014年17.3%增長到2018年的22.6%，鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類耐藥率從2016年68.8%增長到2018年72.1%，給臨床的抗感染治療帶來挑戰(zhàn)，但在2019年，主要革蘭陰性菌對(duì)碳青酶烯類耐藥率均有所下降，尤其是銅綠假單胞菌對(duì)碳青酶烯類的耐藥率(18.2% vs 22.6%)、鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類耐藥率(61.2% vs 72.1%)較2018年顯著下降，肺炎克雷伯菌對(duì)碳青酶烯類的耐藥率(16.2% vs 17.2%)也呈下降趨勢(shì)，說明本院在開展碳青霉烯類耐藥專項(xiàng)整治工作中取得明顯效果。

臨床科室應(yīng)繼續(xù)加強(qiáng)患者碳青酶烯類耐藥的篩查，正確積極進(jìn)行病原學(xué)送檢，根據(jù)藥敏結(jié)果和碳青酶烯類耐藥基因型精準(zhǔn)合理的治療，同時(shí)在醫(yī)院感染管理部門的配合下，正確做好碳青霉烯類耐藥菌株的各項(xiàng)防控工作。微生物檢驗(yàn)工作者應(yīng)該積極配合醫(yī)院感染管理部門加強(qiáng)對(duì)碳青霉烯類耐藥菌株的監(jiān)測(cè)，實(shí)施多部門聯(lián)合模式感控干預(yù)策略，以降低碳青霉烯類耐藥菌的發(fā)生和傳播。

革蘭陽性菌中，金黃色葡萄球菌中的MRSA是醫(yī)院感染的最常見病原菌之一，增加了臨床對(duì)抗感染治療難度，由于它對(duì)臨床多數(shù)常用藥物的高水平耐藥，成為了所有醫(yī)務(wù)工作者研究的焦點(diǎn)。中國CHINET監(jiān)測(cè)網(wǎng)歷年監(jiān)測(cè)資料結(jié)果顯示，MRSA檢出率從2005年的69%持續(xù)下降至2016年的38.4%(P＜0.05)[6]。本院近年數(shù)據(jù)顯示，從2014年37.7%降至2018年的24.1%，呈逐年下降趨勢(shì)，提示最近幾年醫(yī)院對(duì)于MRSA的防控工作取得一定效果，但在2019年又上升至27.6%，說明臨床對(duì)金黃色葡萄球菌感染的防范有所松懈，因此在醫(yī)院多重耐藥的防治工作中要重視MRSA的耐藥率，臨床送檢今后應(yīng)規(guī)范操作，嚴(yán)格參照藥敏結(jié)果選用抗菌藥物，減少耐藥菌的產(chǎn)生。MRSA在醫(yī)院傳播的主要途徑經(jīng)手傳播，通過強(qiáng)調(diào)醫(yī)務(wù)工作人員的手衛(wèi)生，能夠有效避免交叉感染的發(fā)生，降低MRSA的感染率[7]。

糞腸球菌和屎腸球菌仍是引起醫(yī)院獲得性感染的重要病原菌。腸球菌是泌尿系統(tǒng)感染常見病原菌之一，僅次于大腸埃希菌。多篇研究數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)報(bào)道[8-10]，近年來屎腸球菌檢出率呈逐年上升趨勢(shì)，但本院近6年數(shù)據(jù)顯示，耐萬古霉素的腸球菌(VRE)由2014年11.0%降至2019年1.5%，說明嚴(yán)格的院內(nèi)感染控制方案已經(jīng)減少了此病原菌的發(fā)生。從2019年數(shù)據(jù)分析，屎腸球菌對(duì)于多數(shù)抗菌藥物的耐藥率明顯高于糞腸球菌，屎腸球菌對(duì)氨芐西林的耐藥率高達(dá)92.2%，對(duì)于慶大霉素耐藥率為52.1%。與全國多中心研究接近[11]。

綜上所述，多種病原菌的耐藥性依然較高，臨床應(yīng)加強(qiáng)科室管理，加強(qiáng)醫(yī)護(hù)人員培訓(xùn)，強(qiáng)化病房管理，防止耐藥菌株的流行，降低醫(yī)院感染的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。醫(yī)院感染管理部門應(yīng)采取相應(yīng)措施，以減少其流行暴發(fā)。臨床醫(yī)務(wù)人員在進(jìn)行經(jīng)驗(yàn)用藥的過程中須參照本院耐藥監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)，合理使用抗菌藥物，避免加重耐藥性增高的變遷。