鄧勁 楊錦華,2 康梅,*

(1 四川大學(xué)華西醫(yī)院實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)科臨床微生物室，成都 610041；2 蒼溪縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣元 628400)

細(xì)菌獲得性耐藥主要是由于細(xì)菌對相關(guān)抗菌藥物產(chǎn)生不同程度的抗性或耐受性，影響臨床治療效果，甚至造成耐藥菌株不地斷蔓延和傳播，最終導(dǎo)致耐藥性細(xì)菌的暴發(fā)[1-2]。隨著抗菌藥物大量使用，細(xì)菌耐藥成為威脅人類健康的公共衛(wèi)生問題，不同國家、地區(qū)的細(xì)菌耐藥情況及臨床分布有所不同[3-4]。為了解本院菌種分離情況和耐藥菌株的變化趨勢，能夠有效地幫助臨床控制耐藥細(xì)菌傳播，為臨床醫(yī)生合理用藥提供可靠依據(jù)，及時更新用藥方案，以防細(xì)菌廣泛性耐藥[5]。本文回顧性分析臨床微生物室分離的15908株細(xì)菌菌譜及耐藥監(jiān)測數(shù)據(jù)，整理報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來源

2019年度臨床分離菌共15908株，同一患者不同送檢標(biāo)本所培養(yǎng)出的相同菌株，不進(jìn)行重復(fù)統(tǒng)計(jì)；不合格(革蘭染色涂片結(jié)果為鱗狀上皮細(xì)胞＞25個/LP，WBC＜10個/LP)的痰液分離菌株該標(biāo)準(zhǔn)參考中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS/T499-2017《下呼吸道感染細(xì)菌培養(yǎng)操作指南》，及厭氧菌、真菌、分枝桿菌、諾卡菌、其他需氧放線菌、支原體不納入本次監(jiān)測范圍。

1.2 培養(yǎng)基、儀器及試劑

1.2.1 培養(yǎng)基

藥敏試驗(yàn)用Mueller-Hinton瓊脂平皿，肺炎鏈球菌及各組鏈球菌用含5%綿羊血瓊脂平皿，流感嗜血菌用HTM平皿；血培養(yǎng)瓶(法國生物梅里埃公司)，全自動血培養(yǎng)儀報陽后按照血培養(yǎng)瓶類型轉(zhuǎn)種平皿，需氧血培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)種5%綿羊血瓊脂平皿和普通巧克力瓊脂平皿(未加抗生素)，厭氧血培養(yǎng)瓶在需氧血培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)種方案上增加厭氧血平皿。以上平皿除厭氧血平皿由重慶龐通醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)外，其余均為鄭州安圖生物股份有限公司生產(chǎn)。

1.2.2 儀器

BACT/ALERT 3D全自動血培養(yǎng)儀(法國生物梅里埃公司)，全自動生化鑒定及藥敏系統(tǒng)(Vitek 2 Compact，法國生物梅里埃公司)，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS，德國Bruker Corporation)，35℃電熱恒溫培養(yǎng)箱(四川浩洋醫(yī)療器械有限公司)，CO2培養(yǎng)箱(賽默飛世爾科技有限公司)。

1.2.3 試劑

全自動生化鑒定和藥敏卡(GN,GP,GN67,XNO4,GP67,GP68)為法國生物梅里埃公司產(chǎn)品，抗菌藥物紙片為Oxoid公司產(chǎn)品，E-test條為鄭州安圖生物公司產(chǎn)品，包括青霉素、紅霉素、克林霉素、慶大霉素、利福平、復(fù)方磺胺甲噁唑、利奈唑胺、萬古霉素、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、氨芐西林、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢吡肟、亞胺培南、美羅培南、厄他培南、阿米卡星等，微量肉湯稀釋法為溫州康泰生物科技有限公司產(chǎn)品，包括多黏菌素B、替加環(huán)素。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌鑒定

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)進(jìn)行鑒定且分值≥2.0；采用直接涂布法，挑取單個待檢菌落涂布靶板，滴加1 μL 70%甲酸，自然干燥后再滴加1 μL基質(zhì)液即可。

1.3.2 藥敏試驗(yàn)

多數(shù)藥敏試驗(yàn)上自動化藥敏測定系統(tǒng)(Vitek 2 Compact)及配套的藥敏卡，部分試驗(yàn)采用紙片擴(kuò)散法(Kirby-Bauer，KB)，對于少見耐藥或罕見耐藥表型或矛盾耐藥表型時采用E-test條或微量肉湯稀釋法復(fù)檢。質(zhì)控菌株按照CLSI要求，為金黃色葡萄球菌ATCC25923、金黃色葡萄球菌ATCC29213、大腸埃希菌ATCC25922、大腸埃希菌ATCC35218、肺炎克雷伯菌ATCC700603、銅綠假單胞菌ATCC27853、流感嗜血菌ATCC49247、肺炎鏈球菌ATCC49619等。

1.3.3 手工藥敏試驗(yàn)

流感嗜血菌藥敏試驗(yàn)采用KB法，黏液性銅綠假單胞菌藥敏試驗(yàn)采用KB法，棒桿菌藥敏試驗(yàn)采用MIC法。

1.3.4 β-內(nèi)酰胺酶檢測

頭孢硝噻吩紙片定性檢測流感嗜血菌、黏膜炎莫拉菌、淋病奈瑟菌，若陽性可預(yù)測對青霉素酶不穩(wěn)定青霉素類耐藥。

1.3.5 克雷伯菌屬(肺炎克雷伯菌和產(chǎn)酸克雷伯菌)、大腸埃希菌和奇異變形桿菌超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBL)檢測

ESBL初篩陽性標(biāo)準(zhǔn)：克雷伯菌屬(肺炎克雷伯菌和產(chǎn)酸克雷伯菌)、大腸埃希菌對頭孢泊肟、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢曲松或氨曲南中任一藥物耐藥，奇異變形桿菌對頭孢泊肟、頭孢他啶或頭孢噻肟任一藥物耐藥；ESBL確證陽性標(biāo)準(zhǔn)：頭孢他啶和頭孢他啶/克拉維酸或頭孢噻肟和頭孢噻肟/克拉維酸中任一藥物，加與不加克拉維酸抑菌圈相比增加5mm時，判定為產(chǎn)ESBL。

1.3.6 藥敏復(fù)核

(1)青霉素敏感金黃色葡萄球菌檢測 首先使用頭孢硝噻吩紙片檢測，若陰性則進(jìn)一步進(jìn)行青霉素邊緣實(shí)驗(yàn)。

(2)青霉素不敏感肺炎鏈球菌檢測 1 μg/片苯唑西林紙片測定復(fù)核菌的抑菌圈直徑，若≤19mm采用青霉素E-test 測定MIC值。

(3)耐萬古霉素腸球菌的檢測 對萬古霉素非敏感的菌株，用萬古霉素 E-test 復(fù)核 MIC值。

(4)替加環(huán)素和多黏菌素B耐藥株檢測 對替加環(huán)素和多黏菌素B非敏感菌株，采用微量肉湯稀釋法復(fù)核MIC值。

(5)碳青霉烯耐藥腸桿菌目細(xì)菌(CRE)檢測 對美羅培南、亞胺培南或厄他培南中任一藥物耐藥的腸桿菌，對于初次分離的耐藥株需用KB法或稀釋法復(fù)核。

1.3.7 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)

按照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)2020版文件判讀。

1.4 監(jiān)測指標(biāo)

監(jiān)測耐藥菌株檢出和分布情況、不同菌株對不同抗菌藥的耐藥性情況。

1.5 數(shù)據(jù)分析

全年耐藥菌數(shù)據(jù)分析用 WHONET 5.6軟件

2 結(jié)果

2.1 分離病原菌分布及來源

2019年1—12月共分離非重復(fù)株細(xì)菌15908株，所有病原菌中呼吸道標(biāo)本占約36.8%(5857/15908)、尿液標(biāo)本占約17.8%(2826/15908)、傷口分泌物標(biāo)本占約16.0%(2544/15908)、血液標(biāo)本占約12.0%(1912/15908)、腦脊液、胸腹腔積液及膽汁占約16.7%(2659/15908)。主要科室來源為門/急診科14.4%(2297/15908)、呼吸內(nèi)科4.9%(792/15908)、ICU 3.9%(633/159088)、泌尿外科3.3%(531/15908)、神經(jīng)外科3.2%(515/15908)。

2.2 臨床病原菌分布特點(diǎn)

15908 株細(xì)菌中，革蘭陽性菌共4880株，約占30.7%，其中葡萄球菌2387株，約占48.9%，腸球菌屬1120株，約占22.9%，α溶血性鏈球菌374株，約占7.6%，β溶血性鏈球菌112株，約占2.3%，棒桿菌屬110株，約占2.2%。革蘭陰性菌共10938株，約占69.3%，其中腸桿菌目6058株，約占55.4%，非發(fā)酵菌4175株，約占38.2%，苛養(yǎng)菌(肺炎鏈球菌、流感嗜血菌與黏膜炎莫拉菌)共766株，約占4.8%，見表1。

表1 15908株細(xì)菌菌譜分布Tab.1 Distribution of 15,908 bacterial strains

2.3 常見細(xì)菌對抗生素的體外藥敏情況

金黃色葡萄球菌中MRSA菌株27.6%；未發(fā)現(xiàn)VISA和VRSA菌株。屎腸球菌對萬古霉素和利奈唑胺的耐藥率分別為1.3%和0.3%；糞腸球?qū)芜虬返哪退幝蕿?.9%，未發(fā)現(xiàn)萬古霉素耐藥株。見表2。分離出肺炎鏈球菌154株，2株來源于腦脊液，均為RRSP，MIC值分別為0.5和1，PRSP的分離率1.3%，未分分離出對萬古霉素和利奈唑胺的耐藥株，見表3。

表2 主要革蘭陽性菌對常見抗生素的耐藥率(%)Tab.2 The resistance rate of major gram-positive stain to antibacterial agent (%)

表3 肺炎鏈球菌對常見抗生素的耐藥率(%)和敏感率(%)Tab.3 Resistance rate (%) and sensitivity rate (%) of Streptococcus pneumoniae to antibacterial agents

2019年共分離革蘭陰性菌10938株，以大腸埃希菌為主，占22.2%，其次是克雷伯菌屬、鮑曼不動桿菌及銅綠假單胞菌。大腸埃希菌對氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林、頭孢他啶、慶大霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星的耐藥率高于克雷伯菌屬，而哌拉西林/他做巴坦、頭孢吡肟、亞胺培南、阿米卡星的耐藥率低于克雷伯菌屬大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌對亞胺培南的耐藥率分別為1.5%和16.5%；非發(fā)酵菌中鮑曼不動桿菌對所有抗生素的耐藥率均高于銅綠假單胞菌，鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌對亞胺培南的耐藥率分別為59.4%和18.2%。大腸埃希菌、克雷伯菌屬(肺炎克雷伯菌和產(chǎn)酸克雷伯菌)以及奇異變形桿菌中產(chǎn)ESBLs菌株分離率分別占56.4%、47.2%和45.8%，見表4。

表4 主要革蘭陰性菌對常見抗生素的耐藥率(%)Tab.4 Resistance rate of major gram-negative stain to antibacterial agent (%)

2019年分離出514株流感嗜血菌和98株黏膜炎莫拉菌，β-內(nèi)酰胺酶檢出率分別為71.2%和87.4%，未發(fā)現(xiàn)對美羅培南不敏感的流感嗜血菌，未分離出對頭孢曲松非敏感菌株，黏膜炎莫拉菌對阿奇霉素和紅霉素的非敏感率均為1.6%，見表5。110株棒桿菌屬(紋帶棒桿菌87株，占79.1%)除對慶大霉素和利福平的耐藥率較低，分別為14.5%和12.0%，其余抗生素的耐藥率均較高，未發(fā)現(xiàn)對萬古霉素和利奈唑胺耐藥的棒桿菌屬，見表6。

表5 流感嗜血菌和黏膜炎莫拉菌對常見抗生素的耐藥率(%)和敏感率(%)Tab.5 Resistance rate (%) and sensitivity rate (%) of Haemophilus influenzae and Moraxella catarrhalis to antibacterial agents

表6 棒桿菌屬對常見抗生素的耐藥率(%)和敏感率(%)Tab.6 Resistance rate (%) and sensitivity rate (%) of Corynebacterium spp to antibacterial agents

碳青霉烯類耐藥的肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌科室來源前3位為ICU、神經(jīng)外科和急診科，耐藥株標(biāo)本類型均主要來源于呼吸道，其次是傷口分泌物標(biāo)本，見表7～8。

表7 耐碳青霉烯類藥物菌株的科室來源及檢出率Tab.7 Department sources and detection rates of carbapenem-resistant strains

2.4 多重耐藥分離變化趨勢

金黃色葡萄球菌中MRSA菌株比例與2018年相比有所上升(27.6% vs 24.4%)；碳青酶烯耐藥肺炎克雷伯菌和碳青酶烯類耐藥的銅綠假單胞菌菌與2018年相比均有所下降(16.2% vs 17.2%，18.2% vs 22.6%)；碳青酶烯耐藥的鮑曼不動桿菌相比2018年下降較明顯(61.2% vs 72.1%)。近年來常見多重耐藥細(xì)菌變化趨勢見圖1。

3 討論

2019年共分離15908株非重復(fù)細(xì)菌，較2018年增長12.3%(1950/15908)，革蘭陰性菌仍占最大比例，排在前5位的細(xì)菌依次是大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌，與2018年前5位細(xì)菌有所不同，嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌上升至第5位；革蘭陽性菌依然以金黃色葡萄球菌為主。

表8 耐碳青霉烯類藥物菌株的標(biāo)本類型分布及檢出率Tab.8 Specimen type distribution and rate of carbapenem resistant strains

從標(biāo)本送檢情況分析，呼吸道和尿液標(biāo)本仍占主要部分，無菌體液標(biāo)本送檢率仍待提高，其實(shí)無菌體液標(biāo)本檢驗(yàn)價值更高，臨床意義更大，更能幫助臨床醫(yī)生指導(dǎo)其診斷及用藥，無菌體液包括血液、 腦脊液、胸腹水、膽汁和關(guān)節(jié)液等，血培養(yǎng)結(jié)果對感染性疾病的診斷、治療和預(yù)后都有極為重要的意義，因此應(yīng)繼續(xù)加強(qiáng)臨床對血培養(yǎng)的規(guī)范采集的宣講，并需提高血培養(yǎng)及無菌體液的送檢意識[4]。

近年來隨著臨床大量碳青霉烯類抗菌藥物的使用，造成革蘭陰性菌對其耐藥性和耐藥率逐年上升，已經(jīng)成為目前全國臨床耐藥菌中關(guān)注的重點(diǎn)。在2018年以前，本院細(xì)菌對碳青酶烯類耐藥率的持續(xù)增長，肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類耐藥率從2016年的3.7%增長到2018年的17.2%，銅綠假單胞菌對碳青酶烯類的耐藥率從2014年17.3%增長到2018年的22.6%，鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類耐藥率從2016年68.8%增長到2018年72.1%，給臨床的抗感染治療帶來挑戰(zhàn)，但在2019年，主要革蘭陰性菌對碳青酶烯類耐藥率均有所下降，尤其是銅綠假單胞菌對碳青酶烯類的耐藥率(18.2% vs 22.6%)、鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類耐藥率(61.2% vs 72.1%)較2018年顯著下降，肺炎克雷伯菌對碳青酶烯類的耐藥率(16.2% vs 17.2%)也呈下降趨勢，說明本院在開展碳青霉烯類耐藥專項(xiàng)整治工作中取得明顯效果。

臨床科室應(yīng)繼續(xù)加強(qiáng)患者碳青酶烯類耐藥的篩查，正確積極進(jìn)行病原學(xué)送檢，根據(jù)藥敏結(jié)果和碳青酶烯類耐藥基因型精準(zhǔn)合理的治療，同時在醫(yī)院感染管理部門的配合下，正確做好碳青霉烯類耐藥菌株的各項(xiàng)防控工作。微生物檢驗(yàn)工作者應(yīng)該積極配合醫(yī)院感染管理部門加強(qiáng)對碳青霉烯類耐藥菌株的監(jiān)測，實(shí)施多部門聯(lián)合模式感控干預(yù)策略，以降低碳青霉烯類耐藥菌的發(fā)生和傳播。

革蘭陽性菌中，金黃色葡萄球菌中的MRSA是醫(yī)院感染的最常見病原菌之一，增加了臨床對抗感染治療難度，由于它對臨床多數(shù)常用藥物的高水平耐藥，成為了所有醫(yī)務(wù)工作者研究的焦點(diǎn)。中國CHINET監(jiān)測網(wǎng)歷年監(jiān)測資料結(jié)果顯示，MRSA檢出率從2005年的69%持續(xù)下降至2016年的38.4%(P＜0.05)[6]。本院近年數(shù)據(jù)顯示，從2014年37.7%降至2018年的24.1%，呈逐年下降趨勢，提示最近幾年醫(yī)院對于MRSA的防控工作取得一定效果，但在2019年又上升至27.6%，說明臨床對金黃色葡萄球菌感染的防范有所松懈，因此在醫(yī)院多重耐藥的防治工作中要重視MRSA的耐藥率，臨床送檢今后應(yīng)規(guī)范操作，嚴(yán)格參照藥敏結(jié)果選用抗菌藥物，減少耐藥菌的產(chǎn)生。MRSA在醫(yī)院傳播的主要途徑經(jīng)手傳播，通過強(qiáng)調(diào)醫(yī)務(wù)工作人員的手衛(wèi)生，能夠有效避免交叉感染的發(fā)生，降低MRSA的感染率[7]。

糞腸球菌和屎腸球菌仍是引起醫(yī)院獲得性感染的重要病原菌。腸球菌是泌尿系統(tǒng)感染常見病原菌之一，僅次于大腸埃希菌。多篇研究數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)報道[8-10]，近年來屎腸球菌檢出率呈逐年上升趨勢，但本院近6年數(shù)據(jù)顯示，耐萬古霉素的腸球菌(VRE)由2014年11.0%降至2019年1.5%，說明嚴(yán)格的院內(nèi)感染控制方案已經(jīng)減少了此病原菌的發(fā)生。從2019年數(shù)據(jù)分析，屎腸球菌對于多數(shù)抗菌藥物的耐藥率明顯高于糞腸球菌，屎腸球菌對氨芐西林的耐藥率高達(dá)92.2%，對于慶大霉素耐藥率為52.1%。與全國多中心研究接近[11]。

綜上所述，多種病原菌的耐藥性依然較高，臨床應(yīng)加強(qiáng)科室管理，加強(qiáng)醫(yī)護(hù)人員培訓(xùn)，強(qiáng)化病房管理，防止耐藥菌株的流行，降低醫(yī)院感染的發(fā)生風(fēng)險。醫(yī)院感染管理部門應(yīng)采取相應(yīng)措施，以減少其流行暴發(fā)。臨床醫(yī)務(wù)人員在進(jìn)行經(jīng)驗(yàn)用藥的過程中須參照本院耐藥監(jiān)測數(shù)據(jù)，合理使用抗菌藥物，避免加重耐藥性增高的變遷。