崇小萌 田冶 劉穎 姚尚辰 尹利輝 許明哲

(中國食品藥品檢定研究院，北京 102629)

頭孢硫脒是由我國自行研制并首先應(yīng)用于臨床的半合成頭孢菌素[1]，作為第1代頭孢菌素，頭孢硫脒對革蘭陽性菌作用較強(qiáng)，尤其對葡萄球菌和腸球菌具有很強(qiáng)的抗菌活性，臨床應(yīng)用較為廣泛[2-3]。穩(wěn)定性實驗結(jié)果顯示注射用頭孢硫脒具有較好的化學(xué)穩(wěn)定性及物理穩(wěn)定性[4]。

頭孢硫脒的合成路線主要有兩種，第一種為以7-ACA為起始原料，在低溫、堿性條件下與溴乙酰溴反應(yīng)制得溴乙酰7-ACA，再與N,N'-二異丙基硫脲在三乙胺存在下制得，第二條是先由N,N'-二異丙基脲基-2-硫代乙酸鹽酸鹽與Vilsmeier試劑作用制得活性酯，再將活性酯與帶有硅基保護(hù)基的7-ACA反應(yīng)制得[5]。合成路線不同、生產(chǎn)工藝參數(shù)不同會導(dǎo)致終產(chǎn)品中所含有的雜質(zhì)種類不同，因此通過分析產(chǎn)品中的雜質(zhì)譜情況可初步判斷生產(chǎn)廠家所采用的工藝路線及參數(shù)是否合理，對產(chǎn)品中雜質(zhì)的分析與控制是質(zhì)量控制的重點。藥物雜質(zhì)譜表征存在于藥品中的所有已知雜質(zhì)和未知雜質(zhì)的種類和含量[6]，其與藥物生產(chǎn)的工藝路線、原輔料屬性、工藝參數(shù)等密切相關(guān)，目前在仿制藥注冊、原料藥產(chǎn)地變更、補(bǔ)充申請藥品注冊標(biāo)準(zhǔn)等方面已被予以高度關(guān)注[7-9]。對頭孢硫脒原料中部分雜質(zhì)分析已有文獻(xiàn)報道[10-11]，但對注射用頭孢硫脒中雜質(zhì)譜的系統(tǒng)分析尚未見文獻(xiàn)報道，本文在對4個廠家10批頭孢硫脒原料以及12個廠家143批注射用頭孢硫脒的雜質(zhì)進(jìn)行分析的基礎(chǔ)上，總結(jié)出注射用頭孢硫脒特征雜質(zhì)譜，并對各雜質(zhì)進(jìn)行了定性分析，探索雜質(zhì)與生產(chǎn)工藝及關(guān)鍵質(zhì)控點的相關(guān)性，為工藝路線、產(chǎn)品質(zhì)量評價提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

頭孢硫脒原料：4廠家10批；注射用頭孢硫脒：12廠家143批。

十二水合磷酸氫二鈉: 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，20130427，≥99.0%；一水合檸檬酸：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，20160108，≥99.8%；頭孢硫脒對照品：中國食品藥品檢定研究院，130523-201203，99.0%。

2 檢測方法

2.1 HPLC法測定有關(guān)物質(zhì)

液相色譜儀：Agilent1200 infinity Series，工作站：Agilent OpenLab2.3。

色譜柱：Kromasil 100-5C18(4.6 mm×250 mm 5 μm)；流動相：磷酸鹽緩沖液(取無水磷酸氫二鈉2.76 g，檸檬酸1.29 g，加水溶解并稀釋成1000 mL)-乙腈(86:14)。流速：1.0 mL/min；檢測器：紫外PDA；檢測波長：254 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣器溫度：4℃；進(jìn)樣體積：10 μL。

2.2 LC-MS方法確認(rèn)雜質(zhì)結(jié)構(gòu)

2.2.1 采用柱切換HPLC-MS方法

3201 S1-2雙元泵，3202 S1-2真空脫氣機(jī)，3014 S1-2柱溫箱，3012 S1-2柱切換系統(tǒng)，3133 S1-2自動進(jìn)樣器，以上來自SHISEIDO(Tokyo, Japan), Accela二極管陣列檢測器(Thermo Fisher Scientific Inc.,Massachusetts, USA)；3200Q TRAP質(zhì)譜儀(Applied Biosystems Inc., California, USA)；工作站為Analyst?軟件(version 1.6.2)。

色譜柱為Capcell Pak MGⅡC18(150 mm× 4.6 mm，5 μm)；切換閥：六通閥A和B；切換用定量環(huán)體積：500 μL；流動相：C相： 含有1%甲酸的水溶液；D相：乙腈-1%甲酸溶液；梯度洗脫[0 min(100%C～0 B)；5.5 min (100%C～0 D)；25 min(0 C～100%D)；30min (0 C～100%D)]。MS參數(shù)：ESI離子源，二級質(zhì)譜掃描，掃描范圍：100～1000Da；氣簾氣：20 L/h，電離電壓：+5000 V；離子源溫度：400.00℃；吹掃氣1：60 L/h；吹掃氣2：60 L/h；碰撞誘導(dǎo)解離：中等；解簇電壓：+30.0 V；入口電壓：+6.0 V；碰撞電源：+62.00 V；碰撞電壓：35 V，出口電壓：+3.00 V。

2.2.2 采用柱切換HPLC-MS方法

Thermal QExactive Focus高分辨質(zhì)譜儀；Dionex U3000 雙三元液相色譜儀。DIANOX P680A 二維液相色譜系統(tǒng)。

色譜柱為Capcell Pak MGⅡC18(150 mm× 4.6 mm,5 μm)；切換閥：六通閥A和B；切換用定量環(huán)體積：500 μL；流動相：C相： 含有1%甲酸的水溶液；D相：乙腈-1%甲酸溶液；梯度洗脫 [0 min(100%C～0 B)；5.5min(100%C～0 D)；25 min(0 C～100%D)；30 min (0 C～100%D)]。LC-MSn質(zhì)譜方法：掃描電壓(+)3000.0V，毛細(xì)管溫度(+)350.0℃，鞘氣(+)35L/h，輔助氣(+)10.00L/h，最大噴霧電流(+)100.00，探針加熱器溫度(+)350.00℃，S-棱鏡RF水平50.00，離子源為HESI，掃描范圍：100～1000 Da；一級質(zhì)譜方法：正離子模式，分辨率70000，二級質(zhì)譜方法：分辨率17500；分離窗口：3.0m/z；(N)CE: 10V；缺省電荷狀態(tài)：1。

2.3 粉末X-衍射測定原料晶型

Rigaku Smartlab粉末X-射線衍射儀。陽極靶:Cu；電壓及電流：45 kV，200 mA；單色儀：Ni濾光片；檢測器：D/teX Ultra 250一維陣列檢測器；掃描范圍：2θ＝3°～60°；掃描間隔：0.01°；掃描速度：8°/min；狹縫系統(tǒng)：Soller Slit：5.0°；IS：1/2°；ISL：10.0 mm；RS1：20.0 mm ；RS2：20.0 mm。制樣方法：取供試品約100 mg，置載樣玻璃片上，用玻璃板正壓法制片。

2 結(jié)果與討論

2.1 頭孢硫脒原料有關(guān)物質(zhì)分析

對4個廠家頭孢硫脒原料進(jìn)行分析，其典型色譜圖如圖1所示，由圖中可知，頭孢硫脒原料中共檢出6種主要雜質(zhì)，其中雜質(zhì)1為各廠家最大單個雜質(zhì)。每個廠家所含雜質(zhì)種類不同，有2個廠家的原料不含雜質(zhì)2和雜質(zhì)5，只有1個廠家的原料含有雜質(zhì)6。

2.2 注射用頭孢硫脒有關(guān)物質(zhì)分析

對12廠家143批注射用頭孢硫脒有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行HPLC分析，其典型色譜圖如圖2所示，全部樣品中共檢出6種主要雜質(zhì)，與原料一致，可見注射用頭孢硫脒中的主要雜質(zhì)均來自原料，在制劑生產(chǎn)過程中并未引入新的雜質(zhì)。其中，雜質(zhì)1、雜質(zhì)3和雜質(zhì)4含量較高，雜質(zhì)1為各廠家制劑中最大單個雜質(zhì)；雜質(zhì)2和雜質(zhì)5的含量較低，樣品中這兩種雜質(zhì)均小于0.1%，部分樣品中不含有雜質(zhì)2和雜質(zhì)5。143批樣品中僅有13批樣品含有雜質(zhì)6，且含量均小于0.1%，13批樣品均來自同一廠家，但此廠家其余27批樣品中未檢出雜質(zhì)6，造成此結(jié)果的原因可能是由于所采用的原料生產(chǎn)工藝不穩(wěn)定。各雜質(zhì)在樣品中的含量分布見圖3。

頭孢硫脒原料及注射用頭孢硫脒中均未檢出中國藥典中的雜質(zhì)C(頭孢硫脒?；铫?即溴乙酰-7-ACA(含量低于0.05%)，雜質(zhì)C為頭孢硫脒合成過程中的中間產(chǎn)物(合成路線如圖4所示)，文獻(xiàn)報道[12]，控制調(diào)節(jié)溴乙酰-7-ACA與N,N'-二異丙基硫脲反應(yīng)時的溫度可有效地降低溴乙酰-7-ACA的殘留，再進(jìn)一步精制可使其含量再降低，說明目前各廠家原料合成過程中初始原料的配比以及反應(yīng)條件控制得更精確，工藝更優(yōu)化。

3 雜質(zhì)結(jié)構(gòu)確證

采用柱切換LC-MS方法，對注射用頭孢硫脒樣品中全部6種雜質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了確證。

3.1 雜質(zhì)1結(jié)構(gòu)確證

雜質(zhì)1的+EMS圖及+EPI@m/z431.3[M+H]+的二級質(zhì)譜如圖5所示，由該雜質(zhì)的質(zhì)譜圖可知，該雜質(zhì)的[M+H]+峰為431.0，分子量為430.0；根據(jù)EPI碎片離子，推測裂解途徑如圖6所示，推測雜質(zhì)1為頭孢硫脒3位側(cè)鏈脫去乙?；笮纬傻慕到怆s質(zhì)，即去乙酰頭孢硫脒。

3.2 雜質(zhì)2結(jié)構(gòu)確證

雜質(zhì)2的+EMS圖及+EPI@m/z431.2[M+H]+的二級質(zhì)譜如圖7所示，該質(zhì)譜圖中存在m/z431.0[M+H]+峰以及m/z452.9[M+Na]+峰，因此推斷其分子量為430.0；根據(jù)分子量，初步判斷該雜質(zhì)可能為雜質(zhì)1的同分異構(gòu)體(包括Δ-3異構(gòu)和7S異構(gòu))以及去乙酰氧頭孢硫脒的亞砜異構(gòu)體。

質(zhì)譜圖中存在m/z201.2、m/z159.2以及m/z117.2的碎片峰，說明雜質(zhì)分子中含有與頭孢硫脒相同的7位側(cè)鏈；存在m/z258.2的碎片峰，說明發(fā)生了頭孢類化合物典型的A型裂解，進(jìn)一步說明該雜質(zhì)含有與頭孢硫脒相同的7位側(cè)鏈；而對于m/z313.1碎片離子裂解途徑的推斷可以判定該雜質(zhì)不是去乙酰氧頭孢硫脒的亞砜異構(gòu)體，推測裂解途徑如圖8所示。

比較雜質(zhì)1和雜質(zhì)2的紫外光譜圖(圖9)可知，兩個雜質(zhì)的最大吸收波長一致，推斷兩個雜質(zhì)的共軛結(jié)構(gòu)一致，故初步推斷雜質(zhì)2為雜質(zhì)1的7S異構(gòu)體，該雜質(zhì)屬于頭孢硫脒的降解產(chǎn)物。在注射用頭孢硫脒的一些部頒標(biāo)準(zhǔn)中需要控制氯乙酰-7-ACA(頭孢硫脒?；铫?，該雜質(zhì)相對頭孢硫脒的保留時間為0.4，與雜質(zhì)2一致，在進(jìn)行檢驗中容易將雜質(zhì)2誤判為頭孢硫脒?；铫?，通過此次質(zhì)譜分析，明確了該雜質(zhì)結(jié)構(gòu)，確定了頭孢硫脒原料及制劑中均未檢出頭孢硫脒?；铫颉５谀壳爸袊幍?015年版頭孢硫脒有關(guān)物質(zhì)分析的色譜方法中，無法準(zhǔn)確區(qū)分雜質(zhì)2和頭孢硫脒?；铫?。

3.3 雜質(zhì)3結(jié)構(gòu)確證

雜質(zhì)3的+EMS圖及+EPI@m/z415.2[M+H]+的二級質(zhì)譜如圖10所示，由該雜質(zhì)的質(zhì)譜圖可知，該雜質(zhì)的[M+H]+峰為415.1，推測其分子量為414.1；根據(jù)EPI碎片離子，推測裂解途徑如圖11所示，推測雜質(zhì)3為頭孢硫脒3位側(cè)鏈脫去乙酰氧基的降解雜質(zhì)，即去乙酰氧頭孢硫脒。

3.4 雜質(zhì)4結(jié)構(gòu)確證

雜質(zhì)4的+EMS圖及+EPI@m/z413.3[M+H]+的二級質(zhì)譜圖如圖12所示，由該雜質(zhì)的質(zhì)譜圖可知，該雜質(zhì)的[M+H]+峰為413.3，推測其分子量為412.3，其裂解規(guī)律與雜質(zhì)3類似，推測裂解途徑如圖13所示，推測雜質(zhì)4為頭孢硫脒內(nèi)酯。

3.5 雜質(zhì)5結(jié)構(gòu)確證

雜質(zhì)5的+EMS圖及+EPI@m/z489.0[M+H]+的二級質(zhì)譜圖如圖14所示，由該雜質(zhì)的質(zhì)譜圖可知，該雜質(zhì)的[M+H]+峰為489.1，推測其分子量比頭孢硫脒多了16Da，說明雜質(zhì)5比頭孢硫脒多了一個氧原子。進(jìn)一步的二級質(zhì)譜分析表明，存在m/z429.0的脫3位側(cè)鏈特征碎片峰，推斷該氧原子在母核或7位側(cè)鏈上，二級質(zhì)譜圖中存在m/z201.1、159.1和117.1 3個7-位側(cè)鏈特征碎片峰，故氧原子不在7-位側(cè)鏈上而是在母核上，初步推斷為母核6元雜環(huán)中的硫原子形成亞砜，此雜質(zhì)屬于頭孢硫脒合成過程中的工藝雜質(zhì)。裂解途徑如圖15所示。

3.6 雜質(zhì)6結(jié)構(gòu)確證

由于雜質(zhì)6在質(zhì)譜中不易電離，我們采用了QExactive Focus高分辨質(zhì)譜儀對雜質(zhì)6進(jìn)行柱切換分析。其一級質(zhì)譜圖如圖16所示，在一級質(zhì)譜圖中，豐度較高的3個離子峰(m/z為489.91、412.86和384.87)均有同位素峰，且同位素豐度比為1:2:1，推斷這些離子峰中均含有2個Br原子。m/z為489.91的離子其二級質(zhì)譜圖如圖17所示，由圖中可知，其二級質(zhì)譜包括了m/z為412.86和384.87的碎片離子，兩個碎片離子與m/z為489.91的離子相差77.05和105.04，根據(jù)頭孢硫脒裂解規(guī)律，此應(yīng)為脫去3位側(cè)鏈產(chǎn)生的碎片離子，故推測此化合物3位側(cè)鏈與頭孢硫脒相同；此化合物并未產(chǎn)生頭孢硫脒7位側(cè)鏈特征碎片離子(m/z201、159和117)，故推測此化合物7位側(cè)鏈也與頭孢硫脒不同；在二級質(zhì)譜圖中，產(chǎn)生了m/z156.01的碎片離子，此離子為頭孢硫脒母核進(jìn)行A裂解后的典型碎片離子，故推測此化合物可能與頭孢硫脒具有相同的母核結(jié)構(gòu)。此化合物[M+H]+峰為偶數(shù)，故此化合物含氮原子數(shù)目與頭孢硫脒不相同。綜合上述結(jié)果，初步推斷此化合物為頭孢硫脒原料中的工藝雜質(zhì)。經(jīng)調(diào)研，原料中含有此雜質(zhì)的生產(chǎn)廠家所采用的合成路線與其它廠家是一致的，可能是合成反應(yīng)過程中某個參數(shù)控制不當(dāng)，造成了含溴中間體的產(chǎn)生，或者是合成的物料純度不高，含有此雜質(zhì)。

4 關(guān)鍵指針雜質(zhì)的確定

綜上所述，通過對頭孢硫脒原料及注射用頭孢硫脒中雜質(zhì)譜的分析，對全部6種雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了確證，對其來源進(jìn)行了分析，結(jié)果見表1。

表1 6種主要雜質(zhì)名稱、來源及檢出水平Tab.1 The name, source and detected level of 6 main impurities

在全部廠家的原料以及制劑中，最大單個雜質(zhì)均為雜質(zhì)1，即去乙酰頭孢硫脒，此雜質(zhì)可進(jìn)一步產(chǎn)生雜質(zhì)2，即去乙酰頭孢硫脒7S-異構(gòu)體，雜質(zhì)1脫水即可產(chǎn)生雜質(zhì)3，即去乙酰氧頭孢硫脒，而雜質(zhì)1的3位羥基與4位羧基發(fā)生酯化反應(yīng)即可產(chǎn)生雜質(zhì)4，及頭孢硫脒內(nèi)酯。由此可見，頭孢硫脒中的降解雜質(zhì)2、3、4均與雜質(zhì)1相關(guān)，故雜質(zhì)1可作為關(guān)鍵指針性雜質(zhì)反應(yīng)產(chǎn)品的降解情況。頭孢硫脒可通過多種途徑產(chǎn)生雜質(zhì)1，包括加熱，酸降解、堿降解等，故此雜質(zhì)的含量還可以反映出原料以及制劑在貯存、運輸?shù)冗^程中的條件是否合理。

原料及制劑中均未檢出頭孢硫脒?；?酰化物Ⅰ、Ⅱ)，說明目前在原料合成過程中，生產(chǎn)廠家已經(jīng)注意控制起始原料的質(zhì)量、反應(yīng)物的配比以及工藝參數(shù)，使得頭孢硫脒?；镫s質(zhì)的產(chǎn)生降到最低，遠(yuǎn)低于質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中要求的限度。但個別廠家原料中產(chǎn)生了新的工藝雜質(zhì)，即雜質(zhì)6，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中應(yīng)對此雜質(zhì)進(jìn)行關(guān)注，以全面反映原料生產(chǎn)過程中的工藝控制。雜質(zhì)6可作為反映產(chǎn)品生產(chǎn)工藝控制情況的指針性雜質(zhì)。

5 頭孢硫脒原料晶型

頭孢硫脒原料存在多種晶型，不同晶型的化學(xué)穩(wěn)定性不同。對4個不同廠家的原料進(jìn)行粉末X-衍射分析，衍射圖譜如圖18所示，各廠家原料均為結(jié)晶型原料，特征衍射峰的峰位置、數(shù)量及相對強(qiáng)度基本一致，只是在2θ為15～20°之間的衍射峰數(shù)量及峰形略有不同，說明各廠家頭孢硫脒原料晶型基本一致。該結(jié)果提示，良好的工藝控制，可以保證頭孢硫脒原料最終產(chǎn)品均有較好的晶型，進(jìn)而保證制劑產(chǎn)品的穩(wěn)定性。

6 結(jié)論

綜上所述，頭孢硫脒原料及注射用頭孢硫脒中共檢出6種主要雜質(zhì)，雜質(zhì)種類較少，各廠家制劑產(chǎn)品中雜質(zhì)含量均小于現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的限度，制劑有關(guān)物質(zhì)整體水平較好，這說明良好的原料晶型控制可以在一定程度上保證制劑的質(zhì)量。確定針對降解反應(yīng)以及工藝控制的關(guān)鍵指針性雜質(zhì)，有助于從雜質(zhì)譜方面更加準(zhǔn)確快速地了解產(chǎn)品質(zhì)量以及生產(chǎn)工藝情況。