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        注射用頭孢硫脒雜質(zhì)譜分析及質(zhì)量控制

        2022-06-16 05:36:14崇小萌田冶劉穎姚尚辰尹利輝許明哲
        中國抗生素雜志 2022年4期
        關(guān)鍵詞:側(cè)鏈乙酰注射用

        崇小萌 田冶 劉穎 姚尚辰 尹利輝 許明哲

        (中國食品藥品檢定研究院,北京 102629)

        頭孢硫脒是由我國自行研制并首先應(yīng)用于臨床的半合成頭孢菌素[1],作為第1代頭孢菌素,頭孢硫脒對革蘭陽性菌作用較強(qiáng),尤其對葡萄球菌和腸球菌具有很強(qiáng)的抗菌活性,臨床應(yīng)用較為廣泛[2-3]。穩(wěn)定性實驗結(jié)果顯示注射用頭孢硫脒具有較好的化學(xué)穩(wěn)定性及物理穩(wěn)定性[4]。

        頭孢硫脒的合成路線主要有兩種,第一種為以7-ACA為起始原料,在低溫、堿性條件下與溴乙酰溴反應(yīng)制得溴乙酰7-ACA,再與N,N'-二異丙基硫脲在三乙胺存在下制得,第二條是先由N,N'-二異丙基脲基-2-硫代乙酸鹽酸鹽與Vilsmeier試劑作用制得活性酯,再將活性酯與帶有硅基保護(hù)基的7-ACA反應(yīng)制得[5]。合成路線不同、生產(chǎn)工藝參數(shù)不同會導(dǎo)致終產(chǎn)品中所含有的雜質(zhì)種類不同,因此通過分析產(chǎn)品中的雜質(zhì)譜情況可初步判斷生產(chǎn)廠家所采用的工藝路線及參數(shù)是否合理,對產(chǎn)品中雜質(zhì)的分析與控制是質(zhì)量控制的重點。藥物雜質(zhì)譜表征存在于藥品中的所有已知雜質(zhì)和未知雜質(zhì)的種類和含量[6],其與藥物生產(chǎn)的工藝路線、原輔料屬性、工藝參數(shù)等密切相關(guān),目前在仿制藥注冊、原料藥產(chǎn)地變更、補(bǔ)充申請藥品注冊標(biāo)準(zhǔn)等方面已被予以高度關(guān)注[7-9]。對頭孢硫脒原料中部分雜質(zhì)分析已有文獻(xiàn)報道[10-11],但對注射用頭孢硫脒中雜質(zhì)譜的系統(tǒng)分析尚未見文獻(xiàn)報道,本文在對4個廠家10批頭孢硫脒原料以及12個廠家143批注射用頭孢硫脒的雜質(zhì)進(jìn)行分析的基礎(chǔ)上,總結(jié)出注射用頭孢硫脒特征雜質(zhì)譜,并對各雜質(zhì)進(jìn)行了定性分析,探索雜質(zhì)與生產(chǎn)工藝及關(guān)鍵質(zhì)控點的相關(guān)性,為工藝路線、產(chǎn)品質(zhì)量評價提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 樣品與試劑

        頭孢硫脒原料:4廠家10批;注射用頭孢硫脒:12廠家143批。

        十二水合磷酸氫二鈉: 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,20130427,≥99.0%;一水合檸檬酸:國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,20160108,≥99.8%;頭孢硫脒對照品:中國食品藥品檢定研究院,130523-201203,99.0%。

        2 檢測方法

        2.1 HPLC法測定有關(guān)物質(zhì)

        液相色譜儀:Agilent1200 infinity Series,工作站:Agilent OpenLab2.3。

        色譜柱:Kromasil 100-5C18(4.6 mm×250 mm 5 μm);流動相:磷酸鹽緩沖液(取無水磷酸氫二鈉2.76 g,檸檬酸1.29 g,加水溶解并稀釋成1000 mL)-乙腈(86:14)。流速:1.0 mL/min;檢測器:紫外PDA;檢測波長:254 nm;柱溫:30℃;進(jìn)樣器溫度:4℃;進(jìn)樣體積:10 μL。

        2.2 LC-MS方法確認(rèn)雜質(zhì)結(jié)構(gòu)

        2.2.1 采用柱切換HPLC-MS方法

        3201 S1-2雙元泵,3202 S1-2真空脫氣機(jī),3014 S1-2柱溫箱,3012 S1-2柱切換系統(tǒng),3133 S1-2自動進(jìn)樣器,以上來自SHISEIDO(Tokyo, Japan), Accela二極管陣列檢測器(Thermo Fisher Scientific Inc.,Massachusetts, USA);3200Q TRAP質(zhì)譜儀(Applied Biosystems Inc., California, USA);工作站為Analyst?軟件(version 1.6.2)。

        色譜柱為Capcell Pak MGⅡC18(150 mm× 4.6 mm,5 μm);切換閥:六通閥A和B;切換用定量環(huán)體積:500 μL;流動相:C相: 含有1%甲酸的水溶液;D相:乙腈-1%甲酸溶液;梯度洗脫[0 min(100%C~0 B);5.5 min (100%C~0 D);25 min(0 C~100%D);30min (0 C~100%D)]。MS參數(shù):ESI離子源,二級質(zhì)譜掃描,掃描范圍:100~1000Da;氣簾氣:20 L/h,電離電壓:+5000 V;離子源溫度:400.00℃;吹掃氣1:60 L/h;吹掃氣2:60 L/h;碰撞誘導(dǎo)解離:中等;解簇電壓:+30.0 V;入口電壓:+6.0 V;碰撞電源:+62.00 V;碰撞電壓:35 V,出口電壓:+3.00 V。

        2.2.2 采用柱切換HPLC-MS方法

        Thermal QExactive Focus高分辨質(zhì)譜儀;Dionex U3000 雙三元液相色譜儀。DIANOX P680A 二維液相色譜系統(tǒng)。

        色譜柱為Capcell Pak MGⅡC18(150 mm× 4.6 mm,5 μm);切換閥:六通閥A和B;切換用定量環(huán)體積:500 μL;流動相:C相: 含有1%甲酸的水溶液;D相:乙腈-1%甲酸溶液;梯度洗脫 [0 min(100%C~0 B);5.5min(100%C~0 D);25 min(0 C~100%D);30 min (0 C~100%D)]。LC-MSn質(zhì)譜方法:掃描電壓(+)3000.0V,毛細(xì)管溫度(+)350.0℃,鞘氣(+)35L/h,輔助氣(+)10.00L/h,最大噴霧電流(+)100.00,探針加熱器溫度(+)350.00℃,S-棱鏡RF水平50.00,離子源為HESI,掃描范圍:100~1000 Da;一級質(zhì)譜方法:正離子模式,分辨率70000,二級質(zhì)譜方法:分辨率17500;分離窗口:3.0m/z;(N)CE: 10V;缺省電荷狀態(tài):1。

        2.3 粉末X-衍射測定原料晶型

        Rigaku Smartlab粉末X-射線衍射儀。陽極靶:Cu;電壓及電流:45 kV,200 mA;單色儀:Ni濾光片;檢測器:D/teX Ultra 250一維陣列檢測器;掃描范圍:2θ=3°~60°;掃描間隔:0.01°;掃描速度:8°/min;狹縫系統(tǒng):Soller Slit:5.0°;IS:1/2°;ISL:10.0 mm;RS1:20.0 mm ;RS2:20.0 mm。制樣方法:取供試品約100 mg,置載樣玻璃片上,用玻璃板正壓法制片。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 頭孢硫脒原料有關(guān)物質(zhì)分析

        對4個廠家頭孢硫脒原料進(jìn)行分析,其典型色譜圖如圖1所示,由圖中可知,頭孢硫脒原料中共檢出6種主要雜質(zhì),其中雜質(zhì)1為各廠家最大單個雜質(zhì)。每個廠家所含雜質(zhì)種類不同,有2個廠家的原料不含雜質(zhì)2和雜質(zhì)5,只有1個廠家的原料含有雜質(zhì)6。

        2.2 注射用頭孢硫脒有關(guān)物質(zhì)分析

        對12廠家143批注射用頭孢硫脒有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行HPLC分析,其典型色譜圖如圖2所示,全部樣品中共檢出6種主要雜質(zhì),與原料一致,可見注射用頭孢硫脒中的主要雜質(zhì)均來自原料,在制劑生產(chǎn)過程中并未引入新的雜質(zhì)。其中,雜質(zhì)1、雜質(zhì)3和雜質(zhì)4含量較高,雜質(zhì)1為各廠家制劑中最大單個雜質(zhì);雜質(zhì)2和雜質(zhì)5的含量較低,樣品中這兩種雜質(zhì)均小于0.1%,部分樣品中不含有雜質(zhì)2和雜質(zhì)5。143批樣品中僅有13批樣品含有雜質(zhì)6,且含量均小于0.1%,13批樣品均來自同一廠家,但此廠家其余27批樣品中未檢出雜質(zhì)6,造成此結(jié)果的原因可能是由于所采用的原料生產(chǎn)工藝不穩(wěn)定。各雜質(zhì)在樣品中的含量分布見圖3。

        頭孢硫脒原料及注射用頭孢硫脒中均未檢出中國藥典中的雜質(zhì)C(頭孢硫脒?;铫?即溴乙酰-7-ACA(含量低于0.05%),雜質(zhì)C為頭孢硫脒合成過程中的中間產(chǎn)物(合成路線如圖4所示),文獻(xiàn)報道[12],控制調(diào)節(jié)溴乙酰-7-ACA與N,N'-二異丙基硫脲反應(yīng)時的溫度可有效地降低溴乙酰-7-ACA的殘留,再進(jìn)一步精制可使其含量再降低,說明目前各廠家原料合成過程中初始原料的配比以及反應(yīng)條件控制得更精確,工藝更優(yōu)化。

        3 雜質(zhì)結(jié)構(gòu)確證

        采用柱切換LC-MS方法,對注射用頭孢硫脒樣品中全部6種雜質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了確證。

        3.1 雜質(zhì)1結(jié)構(gòu)確證

        雜質(zhì)1的+EMS圖及+EPI@m/z431.3[M+H]+的二級質(zhì)譜如圖5所示,由該雜質(zhì)的質(zhì)譜圖可知,該雜質(zhì)的[M+H]+峰為431.0,分子量為430.0;根據(jù)EPI碎片離子,推測裂解途徑如圖6所示,推測雜質(zhì)1為頭孢硫脒3位側(cè)鏈脫去乙?;笮纬傻慕到怆s質(zhì),即去乙酰頭孢硫脒。

        3.2 雜質(zhì)2結(jié)構(gòu)確證

        雜質(zhì)2的+EMS圖及+EPI@m/z431.2[M+H]+的二級質(zhì)譜如圖7所示,該質(zhì)譜圖中存在m/z431.0[M+H]+峰以及m/z452.9[M+Na]+峰,因此推斷其分子量為430.0;根據(jù)分子量,初步判斷該雜質(zhì)可能為雜質(zhì)1的同分異構(gòu)體(包括Δ-3異構(gòu)和7S異構(gòu))以及去乙酰氧頭孢硫脒的亞砜異構(gòu)體。

        質(zhì)譜圖中存在m/z201.2、m/z159.2以及m/z117.2的碎片峰,說明雜質(zhì)分子中含有與頭孢硫脒相同的7位側(cè)鏈;存在m/z258.2的碎片峰,說明發(fā)生了頭孢類化合物典型的A型裂解,進(jìn)一步說明該雜質(zhì)含有與頭孢硫脒相同的7位側(cè)鏈;而對于m/z313.1碎片離子裂解途徑的推斷可以判定該雜質(zhì)不是去乙酰氧頭孢硫脒的亞砜異構(gòu)體,推測裂解途徑如圖8所示。

        比較雜質(zhì)1和雜質(zhì)2的紫外光譜圖(圖9)可知,兩個雜質(zhì)的最大吸收波長一致,推斷兩個雜質(zhì)的共軛結(jié)構(gòu)一致,故初步推斷雜質(zhì)2為雜質(zhì)1的7S異構(gòu)體,該雜質(zhì)屬于頭孢硫脒的降解產(chǎn)物。在注射用頭孢硫脒的一些部頒標(biāo)準(zhǔn)中需要控制氯乙酰-7-ACA(頭孢硫脒?;铫?,該雜質(zhì)相對頭孢硫脒的保留時間為0.4,與雜質(zhì)2一致,在進(jìn)行檢驗中容易將雜質(zhì)2誤判為頭孢硫脒?;铫?,通過此次質(zhì)譜分析,明確了該雜質(zhì)結(jié)構(gòu),確定了頭孢硫脒原料及制劑中均未檢出頭孢硫脒?;铫颉5谀壳爸袊幍?015年版頭孢硫脒有關(guān)物質(zhì)分析的色譜方法中,無法準(zhǔn)確區(qū)分雜質(zhì)2和頭孢硫脒?;铫?。

        3.3 雜質(zhì)3結(jié)構(gòu)確證

        雜質(zhì)3的+EMS圖及+EPI@m/z415.2[M+H]+的二級質(zhì)譜如圖10所示,由該雜質(zhì)的質(zhì)譜圖可知,該雜質(zhì)的[M+H]+峰為415.1,推測其分子量為414.1;根據(jù)EPI碎片離子,推測裂解途徑如圖11所示,推測雜質(zhì)3為頭孢硫脒3位側(cè)鏈脫去乙酰氧基的降解雜質(zhì),即去乙酰氧頭孢硫脒。

        3.4 雜質(zhì)4結(jié)構(gòu)確證

        雜質(zhì)4的+EMS圖及+EPI@m/z413.3[M+H]+的二級質(zhì)譜圖如圖12所示,由該雜質(zhì)的質(zhì)譜圖可知,該雜質(zhì)的[M+H]+峰為413.3,推測其分子量為412.3,其裂解規(guī)律與雜質(zhì)3類似,推測裂解途徑如圖13所示,推測雜質(zhì)4為頭孢硫脒內(nèi)酯。

        3.5 雜質(zhì)5結(jié)構(gòu)確證

        雜質(zhì)5的+EMS圖及+EPI@m/z489.0[M+H]+的二級質(zhì)譜圖如圖14所示,由該雜質(zhì)的質(zhì)譜圖可知,該雜質(zhì)的[M+H]+峰為489.1,推測其分子量比頭孢硫脒多了16Da,說明雜質(zhì)5比頭孢硫脒多了一個氧原子。進(jìn)一步的二級質(zhì)譜分析表明,存在m/z429.0的脫3位側(cè)鏈特征碎片峰,推斷該氧原子在母核或7位側(cè)鏈上,二級質(zhì)譜圖中存在m/z201.1、159.1和117.1 3個7-位側(cè)鏈特征碎片峰,故氧原子不在7-位側(cè)鏈上而是在母核上,初步推斷為母核6元雜環(huán)中的硫原子形成亞砜,此雜質(zhì)屬于頭孢硫脒合成過程中的工藝雜質(zhì)。裂解途徑如圖15所示。

        3.6 雜質(zhì)6結(jié)構(gòu)確證

        由于雜質(zhì)6在質(zhì)譜中不易電離,我們采用了QExactive Focus高分辨質(zhì)譜儀對雜質(zhì)6進(jìn)行柱切換分析。其一級質(zhì)譜圖如圖16所示,在一級質(zhì)譜圖中,豐度較高的3個離子峰(m/z為489.91、412.86和384.87)均有同位素峰,且同位素豐度比為1:2:1,推斷這些離子峰中均含有2個Br原子。m/z為489.91的離子其二級質(zhì)譜圖如圖17所示,由圖中可知,其二級質(zhì)譜包括了m/z為412.86和384.87的碎片離子,兩個碎片離子與m/z為489.91的離子相差77.05和105.04,根據(jù)頭孢硫脒裂解規(guī)律,此應(yīng)為脫去3位側(cè)鏈產(chǎn)生的碎片離子,故推測此化合物3位側(cè)鏈與頭孢硫脒相同;此化合物并未產(chǎn)生頭孢硫脒7位側(cè)鏈特征碎片離子(m/z201、159和117),故推測此化合物7位側(cè)鏈也與頭孢硫脒不同;在二級質(zhì)譜圖中,產(chǎn)生了m/z156.01的碎片離子,此離子為頭孢硫脒母核進(jìn)行A裂解后的典型碎片離子,故推測此化合物可能與頭孢硫脒具有相同的母核結(jié)構(gòu)。此化合物[M+H]+峰為偶數(shù),故此化合物含氮原子數(shù)目與頭孢硫脒不相同。綜合上述結(jié)果,初步推斷此化合物為頭孢硫脒原料中的工藝雜質(zhì)。經(jīng)調(diào)研,原料中含有此雜質(zhì)的生產(chǎn)廠家所采用的合成路線與其它廠家是一致的,可能是合成反應(yīng)過程中某個參數(shù)控制不當(dāng),造成了含溴中間體的產(chǎn)生,或者是合成的物料純度不高,含有此雜質(zhì)。

        4 關(guān)鍵指針雜質(zhì)的確定

        綜上所述,通過對頭孢硫脒原料及注射用頭孢硫脒中雜質(zhì)譜的分析,對全部6種雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了確證,對其來源進(jìn)行了分析,結(jié)果見表1。

        表1 6種主要雜質(zhì)名稱、來源及檢出水平Tab.1 The name, source and detected level of 6 main impurities

        在全部廠家的原料以及制劑中,最大單個雜質(zhì)均為雜質(zhì)1,即去乙酰頭孢硫脒,此雜質(zhì)可進(jìn)一步產(chǎn)生雜質(zhì)2,即去乙酰頭孢硫脒7S-異構(gòu)體,雜質(zhì)1脫水即可產(chǎn)生雜質(zhì)3,即去乙酰氧頭孢硫脒,而雜質(zhì)1的3位羥基與4位羧基發(fā)生酯化反應(yīng)即可產(chǎn)生雜質(zhì)4,及頭孢硫脒內(nèi)酯。由此可見,頭孢硫脒中的降解雜質(zhì)2、3、4均與雜質(zhì)1相關(guān),故雜質(zhì)1可作為關(guān)鍵指針性雜質(zhì)反應(yīng)產(chǎn)品的降解情況。頭孢硫脒可通過多種途徑產(chǎn)生雜質(zhì)1,包括加熱,酸降解、堿降解等,故此雜質(zhì)的含量還可以反映出原料以及制劑在貯存、運輸?shù)冗^程中的條件是否合理。

        原料及制劑中均未檢出頭孢硫脒?;?酰化物Ⅰ、Ⅱ),說明目前在原料合成過程中,生產(chǎn)廠家已經(jīng)注意控制起始原料的質(zhì)量、反應(yīng)物的配比以及工藝參數(shù),使得頭孢硫脒?;镫s質(zhì)的產(chǎn)生降到最低,遠(yuǎn)低于質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中要求的限度。但個別廠家原料中產(chǎn)生了新的工藝雜質(zhì),即雜質(zhì)6,質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中應(yīng)對此雜質(zhì)進(jìn)行關(guān)注,以全面反映原料生產(chǎn)過程中的工藝控制。雜質(zhì)6可作為反映產(chǎn)品生產(chǎn)工藝控制情況的指針性雜質(zhì)。

        5 頭孢硫脒原料晶型

        頭孢硫脒原料存在多種晶型,不同晶型的化學(xué)穩(wěn)定性不同。對4個不同廠家的原料進(jìn)行粉末X-衍射分析,衍射圖譜如圖18所示,各廠家原料均為結(jié)晶型原料,特征衍射峰的峰位置、數(shù)量及相對強(qiáng)度基本一致,只是在2θ為15~20°之間的衍射峰數(shù)量及峰形略有不同,說明各廠家頭孢硫脒原料晶型基本一致。該結(jié)果提示,良好的工藝控制,可以保證頭孢硫脒原料最終產(chǎn)品均有較好的晶型,進(jìn)而保證制劑產(chǎn)品的穩(wěn)定性。

        6 結(jié)論

        綜上所述,頭孢硫脒原料及注射用頭孢硫脒中共檢出6種主要雜質(zhì),雜質(zhì)種類較少,各廠家制劑產(chǎn)品中雜質(zhì)含量均小于現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的限度,制劑有關(guān)物質(zhì)整體水平較好,這說明良好的原料晶型控制可以在一定程度上保證制劑的質(zhì)量。確定針對降解反應(yīng)以及工藝控制的關(guān)鍵指針性雜質(zhì),有助于從雜質(zhì)譜方面更加準(zhǔn)確快速地了解產(chǎn)品質(zhì)量以及生產(chǎn)工藝情況。

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