鞠正福 周巨川 董國(guó)秀

（1 青島市城陽(yáng)區(qū)上馬街道辦事處農(nóng)業(yè)農(nóng)村服務(wù)中心，山東青島266112；2 青島藍(lán)佳生物科技有限公司，山東青島266112）

猴頭菌Hericium erinaceus，別名猴頭蘑、羊毛菌、猴頭菇，屬真菌界，擔(dān)子菌門(mén)，傘菌綱，多孔菌目，齒菌科，猴頭菌屬。猴頭菌是一種腐生菌，子實(shí)體為團(tuán)塊狀、質(zhì)地柔軟，子實(shí)體的中部和中下部為圓柱狀菌針，全形似刺猬或猴頭，子實(shí)體初期為白色，干后呈淺褐色，孢子呈球形，光滑無(wú)色[1-2]。

猴頭菌是一種藥食兩用菌，含多糖類(lèi)及氨基酸，并含多肽類(lèi)及草菌酸[3]。研究表明，猴頭菌不僅對(duì)消化系統(tǒng)疾病有特殊療效，而且還具有增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、抗衰老、降血糖、保護(hù)神經(jīng)和抗菌作用[4]。

猴頭菌人工栽培技術(shù)已較為成熟，但生產(chǎn)周期長(zhǎng)、產(chǎn)量低且不穩(wěn)定。發(fā)酵培養(yǎng)猴頭菌菌絲體，成本低，周期短，產(chǎn)量高。目前關(guān)于猴頭菌深層發(fā)酵有關(guān)研究報(bào)道的結(jié)論還不完全一致[5-9]，劉艷芳等[5]研究得出最優(yōu)培養(yǎng)基主要為葡萄糖3%，可溶性淀粉2%，酵母膏1%；劉靈霞[6]研究得出液體培養(yǎng)猴頭菌的最佳碳源是葡萄糖，最佳氮源為蛋白胨；劉曉鵬等[8]報(bào)道可溶性淀粉和黃豆粉分別為最佳的碳源和氮源；信文娟等[9]篩選出葡萄糖3%，山藥粉0.4%，花生粉1%，玉米漿干粉0.6%為猴頭菌發(fā)酵培養(yǎng)的最優(yōu)培養(yǎng)基。由此可見(jiàn)，不同研究者得出的猴頭菌液體培養(yǎng)基配方存在很大差異。

試驗(yàn)以猴頭菌菌絲體干重為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)猴頭菌液體培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，提高其菌絲體產(chǎn)量，為猴頭菌相關(guān)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

（1）菌株：猴頭菌菌株CGMCC5.783，購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。

（2）培養(yǎng)基：斜面培養(yǎng)基采用PDA 培養(yǎng)基，取去皮馬鈴薯200 g，切成小塊，加水1 000 mL 煮沸30 min，濾去馬鈴薯塊，加葡萄糖20 g，瓊脂20 g，加蒸餾水將濾液補(bǔ)足至1 000 mL，pH自然，115 ℃滅菌30 min。

液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖2%，蛋白胨1%，Mg‐SO4·7H2O 0.1%，KH2PO40.15%，pH 自然，250 mL 三角瓶裝液量100 mL，115 ℃滅菌30 min。

（3）主要儀器設(shè)備：JL2004B 分析天平（上海佑科儀器儀表有限公司）、TMHS-50 恒溫恒濕培養(yǎng)箱（常州托曼儀器制造有限公司）、YXQ-LS-50S 型立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、ZW-QH23 組合式振蕩培養(yǎng)箱（常州金壇中旺儀器制造有限公司）、YT-700 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（紹興滬越儀器設(shè)備有限公司）。

1.2 培養(yǎng)方法

1.2.1 猴頭菌斜面的制備

將0.5 cm2的猴頭菌菌絲塊接種于PDA 斜面培養(yǎng)基中，置于26 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d，備用。

1.2.2 液體種子培養(yǎng)

在無(wú)菌條件下，將4 塊0.5 cm2的斜面猴頭菌菌絲接入裝有100 mL液體種子培養(yǎng)基的搖瓶中，置于轉(zhuǎn)速為150 r/min 的搖床上26 ℃振蕩培養(yǎng)7 d，再次接入液體種子培養(yǎng)基中，相同條件下培養(yǎng)7 d，備用。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)

將約7 d菌齡的菌種接入裝有100 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中（250 mL 三角瓶裝液量100 mL）接種量為10%，置于26 ℃，轉(zhuǎn)速為150 r/min 搖床上振蕩培養(yǎng)10 d。

1.2.4 碳源篩選試驗(yàn)

碳源主要考察對(duì)象為遲效碳源，為滿足菌絲體初期生長(zhǎng)的養(yǎng)分需求，故添加葡萄糖10 g/L，另外添加蛋白 胨5 g/L，MgSO4·7H2O1 g/L，KH2PO41.5 g/L，VB10.01 g/L，在此基礎(chǔ)上分別添加可溶性淀粉、玉米粉（煮沸30 min，4 層紗布過(guò)濾取濾液，以下玉米粉處理相同）、甘蔗糖蜜、蔗糖、紅糖和甘油，添加量均為30 g/L，pH 5.5，在115 ℃條件下滅菌30 min。每個(gè)碳源處理3個(gè)重復(fù)。

1.2.5 氮源篩選試驗(yàn)

葡 萄 糖 30 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L、KH2PO41.5 g/L、VB10.01 g/L，在此基礎(chǔ)上分別添加酵母粉、黃豆粉（煮沸30 min，4 層紗布過(guò)濾取濾液，以下黃豆粉處理相同）、豆粕粉、蛋白胨、牛肉粉，添加量均為10 g/L，pH 5.5，在115 ℃條件下滅菌30 min。每個(gè)氮源處理3個(gè)重復(fù)。

1.2.6 碳氮源正交試驗(yàn)

選取碳源葡萄糖和玉米粉，氮源酵母粉和黃豆粉為因素進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)，正交表選用L9（34），正交設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

表1 碳氮源正交因素和水平 單位：g/L

1.3 菌絲體測(cè)定方法

用50 μm濾膜抽濾收集菌絲體，稱濕重并記錄，于60 ℃烘箱中干燥28 h至恒重，記錄菌絲體干重。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試碳源對(duì)猴頭菌菌絲體生物量的影響

由圖1 可知，以玉米粉為碳源的培養(yǎng)基獲得的猴頭菌菌絲體生物量（菌絲干重，下同）最高（1.39%），以甘油為碳源的培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌絲體生物量最低。由此可知，猴頭菌對(duì)玉米粉的利用率最高，對(duì)甘油的利用率最低。葡萄糖是速效碳源，能夠在菌絲體生長(zhǎng)初期快速提供碳源，玉米粉作為遲效碳源，在菌絲體生長(zhǎng)后期有明顯的促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)作用，所以最佳碳源選擇玉米粉和葡萄糖復(fù)配進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖1 供試碳源對(duì)猴頭菌菌絲體生物量的影響

2.2 供試氮源對(duì)猴頭菌菌絲體生物量的影響

以往研究表明，無(wú)機(jī)氮源不宜用于真菌培養(yǎng)[9]，故試驗(yàn)全部用有機(jī)氮源。

由圖2 可知，以黃豆粉為氮源的培養(yǎng)基獲得的猴頭菌菌絲體生物量最高（1.41%），酵母粉其次，以蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基獲得的菌絲體生物量最低。故選擇黃豆粉和酵母粉復(fù)配進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖2 供試氮源對(duì)猴頭菌菌絲體生物量的影響

2.3 復(fù)合碳氮源的正交試驗(yàn)結(jié)果

圖3 菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)前期（左為第一次培養(yǎng)液體種子，右為轉(zhuǎn)接后液體種子）

圖4 菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)后期（培養(yǎng)第9天）

圖5 過(guò)濾后菌絲體（驗(yàn)證試驗(yàn)）

由表2 可知，組合5 的猴頭菌菌絲體干重最高，所對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基為玉米粉30 g/L，葡萄糖10 g/L，酵母粉12.5 g/L，黃豆粉5 g/L。從K值分析看出各因素最大K值對(duì)應(yīng)的試驗(yàn)組合為A2B2C2D1，所對(duì)應(yīng)的因素水平為玉米粉30 g/L，葡萄糖10 g/L，酵母粉10 g/L，黃豆粉5 g/L。從R值看出RA＞RB＞RD＞RC，即四因素影響力大小比較為玉米粉＞葡萄糖＞黃豆粉＞酵母粉。

表2 復(fù)合碳氮源的正交試驗(yàn)結(jié)果

由表3 正交試驗(yàn)方差分析的F值可知，與其他因素相比玉米粉對(duì)猴頭菌菌絲體干重影響有顯著性差異。從F值大小比較四因素之間影響力大小，與表2中R值分析結(jié)果一致。

表3 復(fù)合碳氮源的正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

從K值可知，最優(yōu)組合為玉米粉30 g/L，葡萄糖10 g/L，酵母粉10 g/L，黃豆粉5 g/L，并不在9 組試驗(yàn)內(nèi)，對(duì)該組合重復(fù)3次驗(yàn)證試驗(yàn)，獲得菌絲體干重平均為25.1 g/L。

3 小結(jié)與討論

碳源是食用菌重要營(yíng)養(yǎng)之一，單糖（如葡萄糖）可以直接被吸收，有利于菌絲體生長(zhǎng)初期吸收利用。復(fù)合碳源原料具有資源豐富、成本低廉的優(yōu)點(diǎn)，是規(guī)?；a(chǎn)的首選，所以最佳碳源選擇復(fù)配玉米粉和葡萄糖。

從菌絲體營(yíng)養(yǎng)需求來(lái)看，氮源是最重要的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，是合成氨基酸和核酸不可缺少的原料。氮源不足會(huì)嚴(yán)重影響菌絲體的生長(zhǎng)。大多數(shù)食用菌利用有機(jī)氮的能力優(yōu)于利用無(wú)機(jī)氮[6]，復(fù)合氮源比單一組分氮源培養(yǎng)菌絲的生物量高，因?yàn)橛袡C(jī)氮中含有一些微量元素，如金屬元素和生長(zhǎng)因子等可促進(jìn)菌絲體生長(zhǎng)。

由單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)最終確定適宜猴頭菌菌絲體生長(zhǎng)的液體培養(yǎng)基為玉米粉30 g/L，葡萄糖10 g/L，酵母粉10 g/L，黃豆粉5 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，KH2PO41.5 g/L，VB10.01 g/L，驗(yàn)證試驗(yàn)獲得猴頭菌菌絲體干重為25.1 g/L。

試驗(yàn)結(jié)果為猴頭菌液體培養(yǎng)菌絲體提供數(shù)據(jù)支撐。