李露露，李艷芬，尹美強(qiáng)，趙 娟，原向陽(yáng)，溫銀元

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801）

谷子（Setaria italic）因其根系發(fā)達(dá)、次生根生長(zhǎng)數(shù)量多、密集、龐大，且具有耐瘠薄、耐干旱，適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)[1-2]，深入開(kāi)展對(duì)谷子根系的研究對(duì)提高谷子的抗倒伏能力以及抗旱保苗能力至關(guān)重要，同時(shí)對(duì)于谷子的高產(chǎn)栽培也具有重要意義。

研究發(fā)現(xiàn)，GRAS 家族蛋白是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，分為8 個(gè)亞家族：SCL、LISCL、SHR、PAT1、DELLA、SCR、LS、HAM，參與植物的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、根和腋芽的發(fā)育、根瘤和菌根的形成、生長(zhǎng)發(fā)育、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、解毒作用、脅迫相關(guān)的應(yīng)答過(guò)程[3]。其中，SHORT-ROOT基因（SHR）對(duì)根的輻射模式和根頂端分生組織的形成至關(guān)重要[4-5]。BENFEY等[6]于1993 年首次發(fā)現(xiàn)SHR基因，它與擬南芥根的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)和輻射形態(tài)形成有關(guān)。2000 年，擬南芥的SHORT-ROOT基因（AtSHR）被成功克隆，其編碼區(qū)全長(zhǎng)1 593 bp，在根和莖中都有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物[7]。shr突變體的凱氏帶結(jié)構(gòu)消失[8]，內(nèi)皮層缺失，只保留有皮層，表現(xiàn)出短根、不定根增多的表型[9-10]。THOMAS 等[11]研究表明，SHR基因可作為細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)因子，影響玉米葉片維管組織和花環(huán)結(jié)構(gòu)的形成而調(diào)控葉片的發(fā)育。此外，SHR基因還介導(dǎo)植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中許多重要的信號(hào)途徑[12-13]，參與生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸（PIN3、PIN7、CYP79B2和SPS等12 個(gè)基因）[14-15]、側(cè)根和不定根的發(fā)生[16]、根尖分生組織干細(xì)胞的維持[17]、GA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑（GA3、SNE、RGL1 和RGL2基因）[18]和油菜素內(nèi)酯的生物合成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和感應(yīng)（BIN3、BRL3、Br6ox2和CYP90D1基因）[19-20]等多種代謝過(guò)程。

目前，已在多種植物如水稻[21]、甘藍(lán)型油菜[22]、白楊[23]和蒺藜苜蓿[24]等植物中發(fā)現(xiàn)了SHR基因，但在谷子中關(guān)于SHR基因的特征與表達(dá)模式的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究參照AtSHR基因，在NCBI和Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選谷子的SHR基因，對(duì)其加以鑒定和生物信息學(xué)分析，并對(duì)SHR基因在谷子不同生育時(shí)期各組織中的表達(dá)模式進(jìn)行分析，旨在為進(jìn)一步研究谷子SHR 蛋白的功能、作用途徑和谷子根的生長(zhǎng)發(fā)育及其輻射形態(tài)的形成提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 谷子SHR 基因的鑒定和基因信息挖掘

以AtSHR基因（AT4G37650）的cDNA 序列為基礎(chǔ)，在NCBI、Phytozome 上對(duì)谷子全基因組進(jìn)行BLASTn 比對(duì)，獲得SiSHR基因，下載擬南芥、水稻和谷子SHR基因的全基因序列、CDS 序列和蛋白序列用于后續(xù)生物信息學(xué)分析。利用已獲得的SHR基因的全基因序列和CDS 序列在GSDS 在線工具中繪制谷子SHR基因、擬南芥和水稻SHR基因的基因結(jié)構(gòu)圖[25]；用MEME 4.10.2（http://memesuite.org/tools/meme）在線軟件進(jìn)行motif 分析[26]。并用MEGA 7.0 軟件構(gòu)建SHR基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，分析其進(jìn)化關(guān)系。用SHR基因轉(zhuǎn)錄起始位置（ATG）上游2 000 bp 的序列，利用PlantCARE 在線數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行啟動(dòng)子順式作用元件分析。

1.2 SiSHR 蛋白的理化性質(zhì)分析和空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

用ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）[27]分析谷子SHR 蛋白的理化性質(zhì)和氨基酸組成，并用ProtScale 分析其疏水性。采用在線工具PRABI（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl? page=/NPSA/npsa_sopma.html）對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)；谷子和擬南芥SHR 蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)利用在線軟件SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive）預(yù)測(cè)。

1.3 SiSHR 基因在谷子中的組織特異性表達(dá)分析

以晉谷42 號(hào)為材料，分別在苗期和灌漿期取谷子根、莖、葉、葉鞘、穗頸、穗共6 個(gè)組織，液氮速凍，保存于-80 ℃超低溫冰箱中。

使用Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)引物（表1），以谷子Actin基因作為內(nèi)參基因，引物由上海生工生物有限公司合成。采用改良RNSiso Plus 法[28]提取總RNA 并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，稀釋3 倍于-20 ℃保存。qRT-PCR使用SYBR?PremixExTaqⅡ（TliRNaseH Plus）試劑盒（TaKaRa）完成。采用2-ΔΔCt計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)樣品3 個(gè)重復(fù)。

表1 SHR 蛋白引物序列Tab.1 Primer sequence of SHR proteins

2 結(jié)果與分析

2.1 SiSHR 基因的鑒定和生物信息學(xué)分析

以AtSHR的cDNA 序列為模板，在NCBI、Phytozome 上對(duì)谷子全基因組進(jìn)行BLASTn 比對(duì)，獲得了2 個(gè)SiSHR基因，分別命名為SiSHR1（Seita.9G355300）、SiSHR2（Seita.2G372300），其中SiSHR1基因的CDS 長(zhǎng)度為1 908 bp，編碼635 個(gè)氨基酸，位于谷子的9 號(hào)染色體上；SiSHR2基因的CDS 長(zhǎng)度為1 785 bp，編碼594 個(gè)氨基酸，位于谷子的2 號(hào)染色體上。

用GSDS 繪制SHR基因的基因結(jié)構(gòu)圖如圖1所示，與水稻和擬南芥相比，SiSHR基因在結(jié)構(gòu)上基本一致，SiSHR基因與水稻和擬南芥的SHR基因都只有1 個(gè)外顯子，沒(méi)有內(nèi)含子。SHR基因的基因結(jié)構(gòu)物種間差異不大。

系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明，SiSHR基因與OsSHR基因在進(jìn)化上同源性較高（圖2-A）。SiSHR1基因與OsSHR1基因聚為一類，SiSHR2基因與OsSHR2基因聚為一類，擬南芥、煙草（A0A1S4A5 E5 TOBAC）、辣 椒（A0A2G3AB65 CAPAN）的SHR基因聚為一類。motif 分析發(fā)現(xiàn)了10 個(gè)保守基序，依次命名為motif 1～motif 10（圖2-B）。其中，motif 6 位于氨基酸序列中部，為VHIID 保守基序，motif 9 為PFYRE 保守基 序，motif 10 為SAW保守基序（圖2-C）。SHR 蛋白在結(jié)構(gòu)上總體保守。

圖2 SHR 蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析與motif 分析Fig.2 Phylogenetic analysis and motif analysis of SHR proteins

2.2 SiSHR 基因的啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件分析

為認(rèn)識(shí)SiSHR基因應(yīng)答各種反應(yīng)的潛在機(jī)制，分析了其啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件，結(jié)果如圖3所示，2 個(gè)SiSHR基因的啟動(dòng)子區(qū)均含有光信號(hào)、激素（ABA、生長(zhǎng)素、MeJA）、脅迫（低溫）、分生組織表達(dá)、醇溶蛋白代謝調(diào)控相關(guān)元件和MYBHv1 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。除此之外，SiSHR1特有晝夜節(jié)律控制響應(yīng)元件和GA 代謝響應(yīng)元件，SiSHR2特有細(xì)胞周期調(diào)控元件和水楊酸響應(yīng)元件。存在的這些調(diào)控元件說(shuō)明SiSHR基因家族成員不僅能夠響應(yīng)光、脅迫等外界環(huán)境信號(hào)，而且還能應(yīng)答多種激素信號(hào)，調(diào)控谷子的生長(zhǎng)發(fā)育。

圖3 SiSHR 基因啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件分析Fig.3 Cis-acting elements analysis in SiSHR gene promoter region

2.3 SiSHR 蛋白的理化性質(zhì)和二、三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

谷子SHR 蛋白的理化性質(zhì)分析結(jié)果表明（表2），SiSHR1 蛋白的分子式為C2933H4485N877O943S15，分子質(zhì)量為67 601.09 u，其中絲氨酸（Ser，14.0%）含量最高；SiSHR2 蛋白的分子式為C2784H4299N817O899S16，分子質(zhì)量為64 111.65 u，其中絲氨酸（Ser，13.3%）與丙氨酸（Ala，13.3%）含量最高；SiSHR1 蛋白和SiSHR2 蛋白的等電點(diǎn)均小于7，不穩(wěn)定系數(shù)均大于40，平均親水性指數(shù)均小于0，說(shuō)明SiSHR1 和SiSHR2 均為酸性不穩(wěn)定的親水蛋白。ProtScale 疏水性分析結(jié)果也表明，SiSHR 是親水蛋白（圖4）。

表2 谷子SHR 蛋白的理化性質(zhì)Tab.2 Physical and chemical properties of SiSHR protein in Setaria italica

圖4 SiSHR 蛋白的疏水性預(yù)測(cè)Fig.4 Hydrophobicity prediction of SiSHR proteins

PRABI 對(duì)SiSHR 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果如圖5 所示，主要由α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲組成，約占85%。對(duì)SiSHR 蛋白進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)的建模發(fā)現(xiàn)（圖6），谷子SHR 蛋白空間構(gòu)象（包括二級(jí)結(jié)構(gòu)的走向和空間折疊方向）與擬南芥的十分相似，二者均模擬到5b3g.1 模型，為SHORT-ROOT 蛋白模型。

圖5 SiSHR 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.5 Secondary structure prediction of SiSHR proteins

圖6 SHR 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.6 Tertiary structure prediction of SHR proteins

2.4 SiSHR 蛋白互作分析

為探究谷子中SHR 蛋白在谷子生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的作用，對(duì)SiSHR 蛋白的互作情況進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SiSHR1 和SiSHR2 均為根形態(tài)建成的核心作用因子（圖7），均可與5 個(gè)蛋白互作，CYCLIN家族蛋白（Si032222m）調(diào)控細(xì)胞周期，C2H2 轉(zhuǎn)錄因子蛋白（Si005031m）調(diào)控分生組織的形成，GRAS 轉(zhuǎn)錄因子家族的SCL 蛋白（Si032551m）調(diào)控根的生長(zhǎng)發(fā)育，SHBY 家族蛋白（Si013112m）調(diào)控細(xì)胞分裂，WOX 家族蛋白（Si002900m）調(diào)控根尖的生長(zhǎng)，Ser/Thr 蛋白激酶（Si016636m）與植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的多種途徑有關(guān)。其中，SHR 蛋白與SCL 蛋白以共表達(dá)方式進(jìn)行互作，其他蛋白與SHR 蛋白具體的互作情況還有待進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

圖7 SiSHR 蛋白互作分析Fig.7 Interaction analysis of SiSHR proteins

2.5 SiSHR 基因的時(shí)空表達(dá)模式分析

以晉谷42 號(hào)的不同組織為材料，分析SHR基因在谷子中的時(shí)空表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖8），SiSHR1 和SiSHR2這2 個(gè)基因在谷子不同生育時(shí)期存在不同程度的表達(dá)，呈現(xiàn)出時(shí)空特異性。這2個(gè)基因在萌發(fā)3 d 的種子中都有一定的表達(dá)；在苗期，2 個(gè)SHR基因在根、莖、葉中均有表達(dá)，其中根中表達(dá)量最高，在莖中表達(dá)量最低；在灌漿期，2 個(gè)基因在根中高表達(dá)，在其余組織中表達(dá)量則很低。說(shuō)明SHR基因在谷子根系的形態(tài)建成過(guò)程中有重要作用，同時(shí)也參與谷子苗期葉的生長(zhǎng)。除根以外的其他組織中，SiSHR1的表達(dá)量均低于SiSHR2，且除根和葉以外的其他組織中SiSHR1的表達(dá)量很低，說(shuō)明SiSHR基因?qū)茸拥拿劝l(fā)、葉片發(fā)育及根的形態(tài)建成由SiSHR1、SiSHR2共同調(diào)控，而對(duì)其他方面的調(diào)控主要是SiSHR2在起作用。

圖8 SiSHR1/SiSHR2 基因的組織特異性表達(dá)Fig.8 Tissue-specific expression of SiSHR1/SiSHR2 genes

3 結(jié)論與討論

谷子有發(fā)達(dá)的根系，次生根密集。SHR基因介導(dǎo)側(cè)根和不定根的發(fā)生、維管束細(xì)胞的發(fā)育以及根尖分生組織的生長(zhǎng)，對(duì)根的形態(tài)構(gòu)成有重要作用[5,12,16-17]。研究發(fā)現(xiàn)，不同物種中存在SHR基因數(shù)目的不同，擬南芥中有1 個(gè)[6]，水稻中有2 個(gè)[21]，在谷子基因組中鑒定到2 個(gè)SHR基因，編碼的蛋白含有VHIID 結(jié)構(gòu)域和PFYYE 結(jié)構(gòu)域，它們是SHR蛋白保持活性的必要結(jié)構(gòu)域，SHR 蛋白在VHIID結(jié)構(gòu)域與其他轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合發(fā)揮作用[29]。

有研究發(fā)現(xiàn)，GA 信號(hào)與SHR 共同調(diào)控?cái)M南芥根的形成[30]；SHR 和SCR 可以促進(jìn)PIN 蛋白的表達(dá)和極性分布，調(diào)控根尖生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)[31]；生長(zhǎng)素響應(yīng)因子(ARFs)調(diào)控SHR 由維管組織向基本組織移動(dòng)[32]，同時(shí)它可以促進(jìn)生長(zhǎng)素從胚芽向胚根運(yùn)輸，為胚根提供生長(zhǎng)素的位置信號(hào)[33]。在側(cè)根原基形成過(guò)程中，SHR 啟動(dòng)子介導(dǎo)mIAA14-GR 影響側(cè)根原基中的生長(zhǎng)素信號(hào)，抑制側(cè)根的形成[34]。本研究中，SiSHR基因的啟動(dòng)子區(qū)含有GA、生長(zhǎng)素、水楊酸和ABA 信號(hào)響應(yīng)元件，可能通過(guò)調(diào)控GA、生長(zhǎng)素、水楊酸和ABA 信號(hào)途徑參與調(diào)控谷子根的形態(tài)建成；蛋白互作預(yù)測(cè)結(jié)果表明，SiSHR 蛋白與SCL 蛋白的互作方式為共表達(dá)，與擬南芥中SHR基因與SCR基因和SCL基因常形成SHR-SCRSCL3 復(fù)合體共同影響根輻射的形態(tài)形成[35]的研究結(jié)果一致。

有研究發(fā)現(xiàn)，SHR基因缺失導(dǎo)致植物出現(xiàn)短根的形態(tài)[30]，在本研究中，SiSHR1/SiSHR2基因在谷子的苗期和灌漿期在根中均有相對(duì)較高的表達(dá)量，且在苗期根中的表達(dá)量高于灌漿期的表達(dá)量，由此推測(cè)，SiSHR基因在谷子中有調(diào)控根系形成的作用。SHR的過(guò)表達(dá)促進(jìn)葉脈組織形成，zmshr1突變體的維管組織、葉組織發(fā)育不正常（包括葉肉細(xì)胞和維管鞘細(xì)胞）[11]；擬南芥SHR功能缺失抑制細(xì)胞分裂、擾亂細(xì)胞核內(nèi)復(fù)制過(guò)程，導(dǎo)致細(xì)胞增殖過(guò)程提前停止[36]，shr突變體和scr突變體的蓮座葉生長(zhǎng)受到抑制[37]；OsSHR2在發(fā)育的小葉脈中表達(dá)，促進(jìn)氣孔分化，但OsSHR1不表達(dá)[38]；SiSHR1在葉片中的表達(dá)量低于SiSHR2，與水稻中一致，SiSHR基因在谷子苗期葉片中的相對(duì)表達(dá)量遠(yuǎn)高于灌漿期成熟的葉片中的表達(dá)量，表明SiSHR基因可能調(diào)控谷子葉片的發(fā)育。由此推測(cè)，谷子的萌發(fā)、葉片發(fā)育及根的形態(tài)建成由SiSHR1、SiSHR2共同調(diào)控，而對(duì)其他方面的調(diào)控主要是SiSHR2在起作用。

本研究從谷子中鑒定出2 個(gè)SHR基因，其中，SiSHR1基因位于9 號(hào)染色體，編碼635 個(gè)氨基酸；SiSHR2基因位于2 號(hào)染色體，編碼594 個(gè)氨基酸。SiSHR 蛋白均為不穩(wěn)定的酸性親水性蛋白，二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲組成，三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與SHORT-ROOT 蛋白模型（5b3g.1）相似。值得注意的是，SiSHR啟動(dòng)子區(qū)含有光、激素（GA、ABA、生長(zhǎng)素、水楊酸）等響應(yīng)元件，SHR 蛋白與CYCLIN、C2H2、SCL、SHBY、WOX 蛋白互作，其中SiSHR 蛋白與SCL 蛋白的互作方式為共表達(dá)，故推測(cè)SiSHR 蛋白可能通過(guò)應(yīng)答GA、生長(zhǎng)素和ABA 信號(hào)途徑，及蛋白互作的方式參與調(diào)控。進(jìn)一步對(duì)晉谷42 號(hào)中SiSHR基因在不同時(shí)期組織中的表達(dá)進(jìn)行差異分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SiSHR1/SiSHR2基因在根中的表達(dá)量最高；更重要的是，苗期根和葉片中的表達(dá)量均顯著高于灌漿期根和葉片中表達(dá)量，表明SiSHR基因的表達(dá)參與調(diào)控谷子根的形態(tài)建成和葉片發(fā)育，為谷子SiSHR基因在根和葉片中的調(diào)控機(jī)制研究奠定了理論基礎(chǔ)。