黃青盈，呂嘉昕，何秋愉，武 全，劉明秋

(復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 上海工業(yè)菌株工程研究中心， 上海 200438)

纖維素在自然界分布廣泛，是世界上最豐富的可再生生物質(zhì)資源之一。秸稈是主要的農(nóng)業(yè)廢棄物，富含可利用的纖維素資源，同時(shí)亦存在難降解和難以資源化的問題。我國秸稈資源豐富，每年產(chǎn)量超過9億噸,但秸稈及其副產(chǎn)物綜合利用率平均不到40%[1]。秸稈的主要成分有灰分、纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等，在自然條件下降解緩慢。因此，傳統(tǒng)方法主要將其焚燒處理，該方法效率低、耗能大且會(huì)造成較為嚴(yán)重的環(huán)境污染。我國也出臺(tái)了對(duì)焚燒秸稈的禁令，但要從根本上解決秸稈處理問題，重點(diǎn)在于使用更有效且環(huán)保的處理方式，使之分解成為可利用的生物質(zhì)能源、肥料、易消化的飼料及制造原料。禾本類造紙傳統(tǒng)技術(shù)是加入堿液蒸煮，會(huì)產(chǎn)生大量黑液造成嚴(yán)重環(huán)境污染，我國從90年代末就全面關(guān)停所有草類造紙項(xiàng)目。隨著國家禁止洋垃圾的進(jìn)口和禁塑令的實(shí)施，結(jié)合國內(nèi)草多木少的國情，很多研究都把目光集中在水稻、小麥秸稈上?？紤]到環(huán)保需求，需要采用生物方法與機(jī)械方法結(jié)合，用生物方法對(duì)秸稈進(jìn)行制漿預(yù)處理，去除部分木質(zhì)素，熟化秸稈，提高后續(xù)步驟效率[1]。纖維素水解還可生成多種產(chǎn)物如乙醇、烷烴、琥珀酸、乳酸乙酯等，可作為新能源生產(chǎn)和資源化利用的重要原料[2]。

降解纖維素的方法包括物理法、化學(xué)法和生物法。物理法主要是使用高溫?zé)峤到?，化學(xué)法則較多使用酸堿試劑和氧化劑，這兩種方法不僅耗能大、成本高，而且處理過程會(huì)造成環(huán)境污染，產(chǎn)生有害副產(chǎn)物[3]。生物法則是利用能夠產(chǎn)生纖維素降解酶的細(xì)菌、真菌、放線菌等微生物來進(jìn)行處理[4]，耗能少、成本低，且環(huán)境友好[5]，因此受到廣泛關(guān)注，也取得了一定成果[6]。降解纖維素和木質(zhì)素的微生物有細(xì)菌、真菌和假單胞菌、鏈霉菌等放線菌[7]。真菌產(chǎn)纖維素酶的能力很強(qiáng)[8]，而細(xì)菌具有更強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性，生長更快，能夠產(chǎn)生特異性更高的多酶復(fù)合物[9]。劉曉飛等[10]從賽地黑土中篩選出一株能高效降解纖維素的放線菌，濾紙酶活性(FPA)達(dá)到(11.94±0.51)U/mL，最優(yōu)條件下對(duì)玉米秸稈5 d降解率可達(dá)23.54%；孟建宇等[11]從大興安嶺森林土壤中獲取了能降解纖維素的真菌，兩株真菌羧甲基纖維素(CMC)酶活性可分別達(dá)到103.89 U/mL和158.36 U/mL；江高飛等[12]研究了能夠在高溫好氧堆肥中保持高度熱穩(wěn)定性并降解纖維素的菌株，在55～65 ℃和75 ℃條件下依舊能發(fā)揮較高的效用；張必周等[13]在低溫條件下尋找能高效降解纖維素的復(fù)配菌，在15 ℃模擬環(huán)境培養(yǎng)下濾紙酶活性(FPA)為32.96 U/mL。

為了避免物理和化學(xué)方法處理纖維素的弊端，挖掘更多更有效的纖維素處理的微生物資源，本研究擬從多種環(huán)境中分離具有降解纖維素潛力的菌種，對(duì)其進(jìn)行馴化、篩選，并測定其降解纖維素和產(chǎn)多種與纖維素和木質(zhì)素有關(guān)酶的能力。將這些菌種用于降解水稻秸稈，考察單菌及不同混合菌種的降解效果和最佳降解條件，此外還嘗試將其用于造紙?jiān)辖斩挼念A(yù)處理，為秸稈的生物處理和資源化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種與秸稈樣品

菌種分離自復(fù)旦大學(xué)食堂廚余垃圾、餐廚垃圾處理廠的廢水及處理廠周圍被廢水浸潤的土壤。

002A為實(shí)驗(yàn)室已鑒定的自研混合菌劑，主要為枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌，常用于養(yǎng)牛場牲畜糞便及餐廚垃圾處理，用于豐富菌種，增加混合菌劑效用。

秸稈于2020年9—10月采自浙江平湖市和江蘇鹽城市水稻田，晾干切成2～3 cm小段，置于陰涼干燥處儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 材料以及儀器

酵母粉、蛋白胨購自英國Oxoid公司；葡萄糖購自華大公司；氯化鈉購自福晨化學(xué)公司；硫酸鎂、磷酸氫二鉀購自上海文旻生化科技有限公司；明膠、瓊脂、微晶纖維素購自生工生物工程(上海)股份有限公司；剛果紅購自天津市大茂化學(xué)試劑場；羧甲基纖維素鈉購自湖南佰歐泰醫(yī)藥有限責(zé)任公司；分光光度計(jì)為上海菁華科技儀器有限公司產(chǎn)品；掃描電鏡為TESCAN公司產(chǎn)品，型號(hào)VEGA3。

1.2 培養(yǎng)基

馴化富集培養(yǎng)基的配制參考文獻(xiàn)[14]，通過梯度減少有機(jī)成分使細(xì)菌逐漸適應(yīng)，以加入的濾紙片作為碳源，同時(shí)觀察馴化期間濾紙片是否發(fā)生了崩解。LB培養(yǎng)基配制： 酵母粉5 g,蛋白胨10 g,NaCl 5 g，加水定容至1 000 mL，使用5 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7左右，121 ℃ 15 min滅菌。無機(jī)培養(yǎng)基配制： KH2PO43 g，MgSO4·7H2O 3 g，加水定容至1 000 mL，121 ℃ 15 min滅菌。第1次馴化培養(yǎng)基配制： 50 mL LB培養(yǎng)基中加入濾紙片1 g，121 ℃ 15 min滅菌。第2次馴化培養(yǎng)基配制： 25 mL LB培養(yǎng)基，25 mL無機(jī)培養(yǎng)基，加入濾紙片1 g，121 ℃ 15 min滅菌。第3次馴化培養(yǎng)基配制： 10 mL LB培養(yǎng)基，40 mL無機(jī)培養(yǎng)基，加入濾紙片1 g，121 ℃ 15 min滅菌。篩選培養(yǎng)基的配制參考文獻(xiàn)[15]： 微晶纖維素10 g，KH2PO41 g，酵母粉1 g，蛋白胨2 g，MgSO40.5 g，NaCl 0.5 g，瓊脂15 g，加水定容至1 000 mL，121 ℃ 15 min滅菌。驗(yàn)證性質(zhì)培養(yǎng)基配制采用孟建宇等[11]的方法： K2HPO40.5 g，微晶纖維素1.88 g，MgSO40.25 g，明膠2 g，剛果紅0.2 g，瓊脂1.4 g，加水定容至1 000 mL，121 ℃ 15 min滅菌。產(chǎn)酶培養(yǎng)基的配制參考文獻(xiàn)[16]： 羧甲基纖維素鈉15.0 g，酵母粉5.0 g，KH2PO42.0 g，121 ℃ 15 min滅菌。秸稈發(fā)酵培養(yǎng)基的配制參考文獻(xiàn)[17]： 100 mL LB培養(yǎng)基中加入秸稈條3 g，121 ℃ 15 min滅菌。

1.3 菌種馴化分離鑒定

將各來源菌種分別依次接種纖維素富集培養(yǎng)基馴化3次，每次馴化時(shí)于搖床中220 r/min 30 ℃培養(yǎng)7 d，并觀察培養(yǎng)基變化[18]。

將第3次馴化后錐形瓶中的菌稀釋涂布于篩選培養(yǎng)基中，將涂布后形態(tài)結(jié)構(gòu)不同的菌落進(jìn)行分離純化，在平板純化3次后挑單克隆接入液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，置于4 ℃冰箱備用[19]。

菌種鑒定： 將分離得到的菌種接種于液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，各取1 mL菌液加入離心管中。按照諸葛誠祥[20]的方法提取DNA進(jìn)行測序鑒定。引物27F： 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，引物1492R： 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，PCR反應(yīng)條件： 94 ℃變性3 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s,30次循環(huán)后,于72 ℃下最后延伸10 min，使反應(yīng)產(chǎn)物擴(kuò)增充分，目標(biāo)片段1 500 bp。PCR產(chǎn)物由上海擎科生物進(jìn)行測序。

1.4 降解纖維素驗(yàn)證

于含有剛果紅的纖維素驗(yàn)證培養(yǎng)基上三點(diǎn)接種分離到的各菌種。30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 d后觀察是否有脫色圈。由于剛果紅可與纖維素形成紅色復(fù)合物，當(dāng)纖維素被菌種分泌的酶分解后就會(huì)產(chǎn)生以菌落為中心的透明圈，以此定性驗(yàn)證菌種對(duì)纖維素的降解能力[21]。

1.5 酶活力測定

采用文獻(xiàn)[22]的所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次： 菌株活化后以1%(體積比)接種量接入10 mL發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d，于4 ℃、10 000 r/min條件下離心5 min，取上清液即粗酶液加蒸餾水稀釋5倍測定酶活力[23]。

纖維素酶活力的測定采用DNS法，酶活力單位(U/L)定義為： 實(shí)驗(yàn)條件下1 L酶液1 min催化底物生成1 μmol葡萄糖的量。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制： 分別配制濃度為0.05、0.1、0.2、0.5、1 mg/mL的葡萄糖溶液，在每根試管中加入各濃度梯度葡萄糖溶液0.5 mL和pH 4.8 0.05 mol/L的K2HPO4-檸檬酸溶液各2 mL、0.5 mL DNS試劑，沸水浴5 min后迅速冷卻，540 nm處測定其OD值，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

羧甲基纖維素酶活力的測定底物為質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%羧甲基纖維素鈉的檸檬酸緩沖液(0.05 mol/L pH 4.4)，外切葡聚糖酶活底物為質(zhì)量濃度1%的微晶纖維素溶液；β-葡聚糖酶活力的測定底物為質(zhì)量濃度1%的水楊苷溶液；纖維素相關(guān)酶的總酶活的測定底物為1 cm×6 cm的新華濾紙1條。

在2 mL底物溶液中準(zhǔn)確加入已稀釋的粗酶液0.5 mL，50 ℃條件下水浴30 min后加入0.5 mL DNS，沸水浴5 min后取出并立即冷卻，搖勻后在波長540 nm處測定吸光度值，對(duì)照葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線用吸光度值求出還原糖的含量然后計(jì)算出酶活力[24]。

1.6 木質(zhì)素有關(guān)酶活力測定

由于秸稈中含有的木質(zhì)素也是影響其降解的重要因素，因此也采用文獻(xiàn)[25]的方法探究其余木質(zhì)素有關(guān)的酶活力，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

木質(zhì)素過氧化物酶活性測定： 底物為加入1 mmol/L白藜蘆醇的醋酸鈉緩沖液(pH 4.5，1 mmol/L)2 mL，設(shè)空白對(duì)照，水浴預(yù)熱至60 ℃后加入稀釋5倍后粗酶液0.5 mL，用1 mmol/L H2O20.5 mL啟動(dòng)反應(yīng)。在波長310 nm處測定體系內(nèi)吸光度的增加值，1個(gè)酶活力單位(U)定義為每分鐘每毫升濾液吸光值增加0.1[26]。

錳過氧化物酶活性測定： 底物為加入1 mmol/L MnSO4為底物的醋酸緩沖液(pH 4.6，1 mmol/L)2 mL，設(shè)空白對(duì)照，水浴預(yù)熱至60 ℃后加入稀釋5倍后粗酶液0.5 mL，用1 mmol/L H2O20.5 mL啟動(dòng)反應(yīng)。在波長270 nm處測定體系內(nèi)吸光度的增加值，1個(gè)酶活力單位(U)定義為每分鐘每毫升濾液吸光值增加0.1。

漆酶活性測定： 底物為1 mmol/L ABTS(2,2′-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate))的醋酸鈉緩沖液(pH 4.5，1 mmol/L)2 mL，設(shè)空白對(duì)照，水浴預(yù)熱至60 ℃后加入稀釋5倍后粗酶液0.5 mL。在波長420 nm處測定體系內(nèi)吸光度的增加值，1個(gè)酶活力單位(U)定義為每分鐘每毫升濾液吸光值增加0.1。

1.7 秸稈降解及條件優(yōu)化

將初篩效果較好的菌株接種于LB培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，接種5%(體積比)菌液于100 mL秸稈發(fā)酵培養(yǎng)基中，對(duì)照加相同體積無菌水。分別置于30 ℃、220 r/min恒溫培養(yǎng)7 d后將發(fā)酵后的秸稈殘?jiān)鼜腻F形瓶倒出并用無菌水沖洗干凈，然后置于高溫烘箱中65 ℃烘干8 h至恒重，取出烘干后的秸稈稱重并計(jì)算秸稈相對(duì)降解率=(W0-W)/W0×100%，W0為對(duì)照秸稈殘?jiān)芍兀琖為降解后秸稈殘?jiān)芍?，每株菌重?fù)3次[27]。

選取部分效果較好的菌種，LB培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后測定OD600，以其中最低的一組為標(biāo)準(zhǔn)，其余各組稀釋至OD600相同后以等比例混合，組成多種混合菌劑以5%的接種量分別接種秸稈發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵后測定相對(duì)降解率選出最佳組合，重復(fù)3次。

選取最佳效果的混合菌種，分別置于3組單一條件變量的情況下測定不同條件變化對(duì)于秸稈降解率的影響，重復(fù)3次： 發(fā)酵前菌種培養(yǎng)初始pH分別為5、6、7、8、9；培養(yǎng)基碳源含量分別為1、2、3、4、5 g/L；發(fā)酵溫度分別為20、25、30、35、40 ℃[28]。

1.8 掃描電鏡觀察

將最佳纖維素降解菌發(fā)酵處理后的秸稈和原始秸稈在4 ℃條件下用2.5%戊二醛固定液液浸泡1 d，然后用濃度為50%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液依次處理10 min，放入冷凍干燥儀中脫水處理1 d。干燥好的秸稈細(xì)條經(jīng)過噴金處理后在掃描電子顯微鏡下觀察秸稈在處理前后表面的差異[29]。

1.9 秸稈造紙制漿預(yù)處理

以002A及本實(shí)驗(yàn)篩選得到的菌種為實(shí)驗(yàn)菌種，每組各取100 g秸稈裝入杯中，菌液接種量為秸稈重量的10%，加水700 mL浸沒秸稈翻攪均勻，放入培養(yǎng)箱，40 ℃培養(yǎng)，第3、5、7天觀察并送樣至造紙廠檢測[30]。后續(xù)使用20%接菌量和100 mL LB培養(yǎng)基加10%接菌量以改進(jìn)效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種分離鑒定

馴化過程中觀察到濾紙條的崩解。經(jīng)過多次馴化和篩選，分離出單菌落后進(jìn)行16S rRNA鑒定，得到以下11個(gè)菌株： X1(Bacilluscereus)、X2(Bacillusthuringiensis)、X3(Alcaligenesfaecalis)、X4(Bacilluscereus)、Y1(Bacilluscereus)、Y3(Alcaligenesfaecalis)、X5(Bacilluscereus)、X8(Bacillussp.)、X9(Bacilluscereus)、X10(Klebsiellaoxytoca)、X11(Citrobacterfreundii)，其相似度如表1所示。進(jìn)一步使用Mega軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析Bacilluscereus屬的5個(gè)菌株(X1、X4、X5、X9、Y1)以及與它們類似的模式菌株，結(jié)果如圖1所示。

表1 各菌株鑒定結(jié)果

圖1 B.cereus屬的5個(gè)菌株系統(tǒng)發(fā)育樹分析Fig.1 Phylogenetic analysis of five B.cereus strains

2.2 降解纖維素驗(yàn)證

由于剛果紅可與纖維素形成紅色復(fù)合物，當(dāng)纖維素被菌種分泌的酶分解成小分子糖等物質(zhì)后就會(huì)產(chǎn)生以菌落為中心的透明圈，以此驗(yàn)證菌種對(duì)纖維素降解能力，11個(gè)菌株在驗(yàn)證培養(yǎng)基上的透明圈直徑見表2，降解較好的菌種為X1、X2、X4、X8、Y1。

表2 各菌株脫色圈直徑和菌落直徑比值

2.3 纖維素有關(guān)酶活測定

將所得菌種活化后接種發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d后離心獲得粗酶液，進(jìn)一步測定這些菌種產(chǎn)生的與纖維素有關(guān)的酶活力來定量衡量其降解纖維素的能力，結(jié)果如圖2所示： 羧甲基纖維素酶活力最高的菌株為Y1，酶活力達(dá)到了331.79 U/L，除此之外，X2、X8、Y1的羧甲基纖維素酶活力也較高，均達(dá)到300 U/L以上。外切葡聚糖酶活力最高的菌株為X8，酶活力達(dá)到了314.85 U/L，除此之外，外切葡聚糖酶活力較高的菌株還有X2、X5，均達(dá)到300 U/L以上。X10的β-葡聚糖酶酶活力最高，達(dá)到了307.91 U/L，X3、X5、Y3的β-葡聚糖酶酶活力也達(dá)到了290 U/L以上。濾紙酶活力最高的菌株為Y1，酶活力達(dá)到了370.52 U/L，另外超過320 U/L的菌株有X1、X2、X10、Y1。前3種酶均為纖維素降解過程中共同作用的酶，濾紙酶活力則代表纖維素相關(guān)酶總酶活力，因此選取各種酶活力都相對(duì)較高的X1、X2、X5、X8、X10、Y1、Y3組成1號(hào)混合菌種參與后續(xù)的秸稈降解混合菌實(shí)驗(yàn)。

2.4 木質(zhì)素有關(guān)酶活的測定

將粗酶液稀釋5倍后測定與木質(zhì)素有關(guān)的酶活力，設(shè)空白對(duì)照計(jì)算其吸光度增加值，1個(gè)酶活力單位(U)定義為每分鐘每毫升濾液吸光值增加0.1，結(jié)果如圖3所示。木質(zhì)素過氧化物酶活力較高的菌株有X2、X3、X5，其中最高的是X2，酶活力達(dá)到1 388 U/mL，其余的也均在1 000 U/mL以上；錳過氧化物酶活力較高的菌株有X2、X3、X5、X11、Y3，其中最高的是X2，酶活力達(dá)到316 U/mL，其余也均在200 U/mL以上；漆酶活力較高的菌株有X2、X3、X5，其中最高的是X2，酶活力達(dá)到696 U/mL，其余也均在300 U/mL以上。因此選取X2、X3、X5這3種與木質(zhì)素有關(guān)的酶活力均較高的菌株組成2號(hào)混合菌種參與后續(xù)的秸稈降解混合菌實(shí)驗(yàn)。

圖2 菌株纖維素酶活力Fig.2 Cellulase activity of each strain底物分別為羧甲基纖維素鈉、微晶纖維素、水楊苷和濾紙，DNS法測定酶活力.

圖3 菌株木質(zhì)素有關(guān)酶活力Fig.3 Lignin-related enzyme activities of each strain底物分別為白藜蘆醇、MnSO4、ABTS，分光光度法測定酶活力.

2.5 秸稈降解及條件優(yōu)化

將11個(gè)菌株接種至加入秸稈條的培養(yǎng)基中，以無菌水為對(duì)照，稱量培養(yǎng)7 d后秸稈剩余干重并計(jì)算降解率，結(jié)果如圖4所示。對(duì)秸稈降解效果最好的菌株為X2，達(dá)到21.64%，除此之外超過15%的菌株還有X1、X4和X5。將本實(shí)驗(yàn)篩選得到的混合菌(篩選混，包括X1、X2、X3、X4、X5、X8、X9、X10、X11，Y1、Y3)、2.3節(jié)中提到的1號(hào)混合菌、2.4節(jié)中提到的2號(hào)混合菌以及所有菌株混合(ALL混，包括篩選混合菌和002A，002A用于豐富菌種和改進(jìn)降解效果)作為4組混合菌種，進(jìn)行秸稈發(fā)酵，培養(yǎng)7 d后計(jì)算相對(duì)降解率，使用R分析對(duì)這4組混合菌的降解率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，得到結(jié)果為F=31.1>F0.05(3,8)=4.07，P=0.000 9<0.05，因此秸稈相對(duì)降解率差異顯著，即這4種菌對(duì)于秸稈降解能力有差異。平均相對(duì)降解率見表3，所有菌種混合(ALL混合)降解秸稈效率最高，降解率達(dá)到了23.86%。選取最佳混合菌種即所有菌種混合菌劑，測定3種不同條件變量即發(fā)酵前菌種培養(yǎng)初始pH(發(fā)酵pH仍為正常值即pH=7以避免秸稈被酸性或堿性溶液腐蝕影響實(shí)驗(yàn)效果)、發(fā)酵溫度和培養(yǎng)基碳源含量對(duì)秸稈降解效率的影響。菌種培養(yǎng)pH對(duì)秸稈降解率有顯著影響，F(xiàn)=268.6>F0.05(4,10)=3.48，P<0.000 1，結(jié)果如圖5所示。秸稈的降解率在菌種活化培養(yǎng)條件呈酸性和堿性的時(shí)候明顯降低，隨著pH值的上升，降解率先降后升，pH=7時(shí)降解效率最佳，為23.92%。碳源含量對(duì)秸稈降解率有顯著影響，F(xiàn)=5.887>F0.05(4,10)，P=0.010 6<0.05，碳源量為1 g/L 時(shí)降解率最高為24.61%。發(fā)酵溫度對(duì)秸稈降解率有顯著影響，F(xiàn)=74.21>F0.05(4,10)，P<0.000 1，隨著發(fā)酵溫度的上升，秸稈的降解率逐漸上升然后下降，35 ℃時(shí)達(dá)到最高降解率25.08%。因此，秸稈降解的最佳條件為發(fā)酵液pH為7，發(fā)酵溫度為35 ℃，培養(yǎng)基碳源量為1 g/L。

圖4 菌株秸稈降解率Fig.4 Straw degradation rate of each strain

表3 混合菌秸稈降解率

圖5 3種條件變量對(duì)秸稈降解率的影響Fig.5 The influence of three condition variables on straw degradation rate發(fā)酵前菌種培養(yǎng)初始pH(發(fā)酵pH仍為正常值即pH=7以避免秸稈被酸性或堿性溶液腐蝕影響實(shí)驗(yàn)效果)分別為5，6，7，8，9；培養(yǎng)基碳源含量分別為1，2，3，4，5 g/L；發(fā)酵溫度分別為20，25，30，35，40 ℃.

2.6 掃描電鏡觀察

比較最佳條件下混合菌劑發(fā)酵前后秸稈經(jīng)固定干燥噴金處理后在掃描電子顯微鏡下的圖像，尺度為200 μm，放大200倍，結(jié)果見圖6.可以發(fā)現(xiàn)發(fā)酵前秸稈結(jié)構(gòu)較為完整，表皮光滑，發(fā)酵后秸稈發(fā)生了缺刻斷裂，可以看到混合菌劑對(duì)于秸稈結(jié)構(gòu)具有一定的破壞能力，體現(xiàn)了其降解能力。

圖6 發(fā)酵前后秸稈掃描電鏡圖像Fig.6 SEM images of straw before and after fermentation注： 尺度200 μm，放大200倍.

2.7 秸稈造紙制漿預(yù)處理

要達(dá)到后續(xù)機(jī)械操作的條件，需要將纖維細(xì)胞的細(xì)胞壁打破，讓細(xì)胞吸水至飽和，使纖維比重近似于水，可以懸浮在水中。以10%濃度接種量處理大量秸稈時(shí)，所有降解秸稈混合菌種5 d處理效果最好，達(dá)到了一定的軟化且并未過度腐爛。該混合菌劑后續(xù)增加接入濃度至20%或接種量10%并加入100 mL LB培養(yǎng)基3 d后接近接種量10%的樣本6 d的效果，縮短了處理時(shí)間。目前可以達(dá)到以下處理效果： (1) 熟化秸稈，樣本手感相對(duì)柔軟；(2) 粉碎成造紙需要的長度后，在水中攪拌，樣本有5%～10%左右的纖維懸浮在水中；(3) 20%濃度的樣本攪拌后，所排出的水相對(duì)潔凈。經(jīng)機(jī)械處理后，接菌量為10%和20%的秸稈所制作的粗漿樣本如圖7所示，接菌量20%的樣本較為細(xì)膩，孔隙較小，耐折度達(dá)到5～6次，灰廢不超過15%，能夠作為后續(xù)機(jī)械操作的原料使用。

圖7 不同接菌量預(yù)處理的秸稈粗漿制片F(xiàn)ig.7 Preparation of coarse straw pulp pretreated with different inoculation amounts

3 討 論

本研究采用梯度營養(yǎng)培養(yǎng)基馴化的方法來強(qiáng)化篩選能夠降解纖維素的菌種，菌種來源于含有豐富纖維素的廚余垃圾及被其污染的水和土壤，本文實(shí)驗(yàn)中主要將其用于降解高纖維素含量的秸稈。微生物降解秸稈相比物理和化學(xué)方法對(duì)于環(huán)境的影響最小，符合目前環(huán)保發(fā)展的需求，避免了處理過程中造成更大的次生污染。本研究所篩選菌種均屬于細(xì)菌，雖然很多真菌比如白腐真菌等降解纖維素能力很強(qiáng)[31]，但是細(xì)菌具有環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)、數(shù)量多、種類豐富、易于獲取等優(yōu)勢，后續(xù)還可以考慮進(jìn)行遺傳修飾構(gòu)建工程菌株進(jìn)一步提高其降解能力。本研究篩選出的菌株具有產(chǎn)纖維素酶及產(chǎn)木質(zhì)素酶的能力，也可作為酶制劑的來源。

考慮到秸稈難降解的原因主要是含有纖維素和木質(zhì)素，因此，將部分酶活力較高的單菌混合來處理秸稈，最終發(fā)現(xiàn)降解效果最佳的是所有菌種混合得到的菌劑?？赡苁蔷N多樣性提高使菌群結(jié)構(gòu)更加豐富、均勻,且碳水化合物的代謝通路豐度提高，改善了其生長和產(chǎn)酶能力。不同的降解菌對(duì)纖維素中不同成分降解具有一定的特異性，多種菌株混合可以通過酶系互補(bǔ)達(dá)到產(chǎn)酶周期縮短、產(chǎn)酶能力增強(qiáng)、提高降解效率的效果[28]，但不同菌種之間可能存在合作促進(jìn)作用也可能存在競爭拮抗作用，本研究由于研究周期限制未對(duì)此作出深入探討，但不同菌種酶系的相互作用和整體混合菌群的生態(tài)特點(diǎn)也可以作為后續(xù)研究的一個(gè)方向[32]。考慮到復(fù)合菌系之間的拮抗作用，一些促進(jìn)秸稈降解微生物增殖的營養(yǎng)液作為秸稈助腐劑也能使秸稈降解效率有所提升，成為秸稈降解研究的另一出路[33]。

也有很多學(xué)者對(duì)產(chǎn)纖維素酶的菌種培養(yǎng)條件(包括碳源、氮源、金屬鹽、培養(yǎng)溫度、pH值、金屬離子影響、接種量和誘導(dǎo)物質(zhì)量濃度等)進(jìn)行了研究[34-36]。對(duì)秸稈降解條件的測定結(jié)果表明，培養(yǎng)時(shí)過酸或者過堿均會(huì)嚴(yán)重影響菌種生長，導(dǎo)致秸稈降解效果急劇下降，自然條件下混合菌劑效果最佳；適當(dāng)升高溫度有助于菌種快速生長和秸稈熟化降解，但是溫度過高也可能影響菌種生長，降低降解效率，但是也保持在一個(gè)比較高的效率水平，在大規(guī)模堆肥處理秸稈過程中也可以考慮使用本實(shí)驗(yàn)得到的菌種進(jìn)行輔助處理；碳源充足時(shí)，細(xì)菌生長較快因此降解秸稈效率也比較高，而適當(dāng)減少碳源量會(huì)使細(xì)菌增加對(duì)秸稈的利用，因此可以實(shí)現(xiàn)減少資源消耗而獲得較高降解效率的目的。本研究所使用混合菌劑處理秸稈的發(fā)酵條件并不苛刻，可以在自然狀態(tài)下投入使用且效果較好。

本研究將纖維素降解菌初步應(yīng)用于造紙制漿預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)可以在較短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)于秸稈的熟化，使其吸收更多液體，纖維更符合后續(xù)機(jī)械處理的要求，也為秸稈處理應(yīng)用作為造紙?jiān)蟍37]提供了新的可能性。