白云洲，趙前程，2，3，呂 東，秦 娟，程瀠輝，李 萌，2，4，李 瑩，2，3

（1. 大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧大連 116023；2. 遼寧省水產(chǎn)品分析檢驗及加工技術(shù)科技服務(wù)中心，遼寧 大連 116023；3. 海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧大連 116023；4. 遼寧省水產(chǎn)品加工及綜合利用重點實驗室，遼寧大連 116023）

海參的保健功能一直備受關(guān)注，特別是幾次大規(guī)模疫情爆發(fā)之后更是得到廣泛認(rèn)可，正逐漸從傳統(tǒng)食材向健康機(jī)能性食品過渡[1]。海參產(chǎn)品主要以鹽漬和干制等傳統(tǒng)加工品為主，近年來針對消費者需求的簡便化加工品即食產(chǎn)品相繼面世[2-3]。在海參精深加工技術(shù)上，主要以酶解海參肽為主，海參膠囊、海參酒和海參液等保健功效產(chǎn)品已相繼走向市場[4-5]。

目前，海參的精深加工產(chǎn)品仍然匱乏，不能滿足市場多元化的需求，發(fā)酵海參產(chǎn)品仍處于空白階段。益生菌是通過攝入一定的量，對食用者的健康發(fā)揮有效作用的活性微生物，對維持腸道微生態(tài)穩(wěn)定、抑制病原微生物侵襲、調(diào)節(jié)免疫防御等方面有著重要作用[6]。納豆芽孢桿菌作為一種益生菌，屬于枯草芽孢桿菌的一個亞種，其蛋白酶活性較高，利用納豆芽孢桿菌進(jìn)行發(fā)酵能夠有效降解大分子蛋白質(zhì)，改善食品的營養(yǎng)價值，增強(qiáng)保健功效[7-8]。

將益生菌應(yīng)用到海參加工中，利用益生菌產(chǎn)生的蛋白酶分解大分子蛋白質(zhì)，開發(fā)綠色環(huán)保海參提取技術(shù)，不僅能夠填補市場空白，帶來巨大經(jīng)濟(jì)效益，同時還能對保健品行業(yè)的發(fā)展和人類的健康起到積極推動作用。但是，利用益生菌發(fā)酵海參的過程伴隨著復(fù)雜的物質(zhì)轉(zhuǎn)化，發(fā)酵前后海參功能成分如何變化，直接影響發(fā)酵這種加工方式在海參精深加工中的應(yīng)用[9]。以蛋白酶活性為指標(biāo)，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對納豆菌發(fā)酵海參的各個工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，為新型海參精深加工產(chǎn)品的開發(fā)與應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海參，大連財神島集團(tuán)有限公司提供；納豆芽孢桿菌實驗室分離保藏，福林酚試劑、酪氨酸、酪蛋白，北京索萊寶科技有限公司提供；無水葡萄糖、三氯乙酸、無水碳酸鈉、乙酸、磷酸氫二鈉、鹽酸、氫氧化鈉，天津市大茂化學(xué)試劑廠提供；LB 肉湯培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司提供。

千分之一精密電子天平，濟(jì)寧市裕澤工業(yè)科技有限公司產(chǎn)品；高壓蒸汽滅菌鍋，山東創(chuàng)美機(jī)械科技有限公司產(chǎn)品；FC3 酶標(biāo)儀，賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品；恒溫培養(yǎng)搖床，上海川一實驗儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 蛋白酶活性的測定

參照吳博華等人[10]的方法，并稍加改動，繪制酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線：

式中：

Y——吸光度；

X——酪氨酸質(zhì)量濃度，mg/mL。

樣品的測定：1 mL 適當(dāng)稀釋的發(fā)酵液樣品，加入酪蛋白底物緩沖液1 mL，迅速混勻后放入40 ℃水浴反應(yīng)10 min，取出后立即加入TCA 溶液2 mL，繼續(xù)水浴20 min。過濾剩余酪蛋白沉淀物，取1 mL濾液，加入碳酸鈉溶液5 mL 和福林酚試劑1 mL，于波長660 nm 處測定吸光度，蛋白酶活性計算公式如下：

式中：

A——酪氨酸釋放量，mg/mL；

V——反應(yīng)液總體積，mL；

N——酶液的稀釋倍數(shù)；

t——反應(yīng)時間，min。

1.2.2 單因素試驗

研究海參添加量（10%，20%，30%，40%，50%）、接種量（1%，2%，3%，4%，5%）、葡萄糖添加量（5%，10%，15%，20%，25%）、pH 值（4，5，6，7，8）、溫度（30，35，40，45 ℃） 和轉(zhuǎn)速（100，120，140，160，180 r/min） 等6 個因素對蛋白酶活性的影響，在研究單因素影響時，選取其余因素中間值為發(fā)酵條件，考查各因素對蛋白酶活性的影響。

1.2.3 響應(yīng)面試驗

（1） PB 試驗設(shè)計[11]。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，利用Design Expert 軟件，將海參添加量、葡萄糖添加量、接種量、pH 值、轉(zhuǎn)速和溫度6 個因素，以蛋白質(zhì)酶活力為響應(yīng)值，進(jìn)行PB 試驗設(shè)計試驗，每個因素設(shè)置高（+1） 和低（-1） 2 個水平。

海參納豆菌發(fā)酵各因素與水平設(shè)計見表1。

表1 海參納豆菌發(fā)酵各因素與水平設(shè)計

（2） CCD 試驗設(shè)計[11]。根據(jù)PB 試驗結(jié)果，利用Design Expert 軟件，以蛋白質(zhì)酶活力為響應(yīng)值，將對蛋白酶活性具有顯著影響的3 個因素（海參添加量、葡萄糖添加量和接種量） 進(jìn)行CCD 試驗。

表2 CCD 試驗各因素與水平設(shè)計

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均設(shè)置3 次平行，數(shù)據(jù)處理采用Excel 2010 進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，響應(yīng)面采用Design ExpertV 8.0.6.1 軟件進(jìn)行設(shè)計和方差分析，p＜0.05 為顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 海參添加量對蛋白酶活性的影響

海參添加量對蛋白酶活性的影響見圖1。

由圖1 可知，海參添加量為10%～20%時，蛋白酶活性隨著海參添加量的增加急劇增加，在海參添加量為40%時，蛋白酶活性達(dá)到最大，隨著海參添加量的繼續(xù)增加，蛋白酶活性開始下降。營養(yǎng)物質(zhì)的組成和濃度對微生物的生長有著顯著的影響，只有在合適的范圍內(nèi)，微生物才能正常生長，過高或過低都不利于微生物的生長[12]。因此，選取海參添加量20%～50%進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面試驗。

圖1 海參添加量對蛋白酶活性的影響

2.1.2 接種量對蛋白酶活性的影響接種量對蛋白酶活性的影響見圖2。

圖2 接種量對蛋白酶活性的影響

由圖2 可知，隨著接種量的增加，蛋白酶活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。接種量過低時，菌株的延滯期過長，不利于菌株的生長和產(chǎn)酶。接種量為2%時，蛋白酶的活性最高，但接種量為2%～5%時，蛋白酶活力無顯著性差異。因此，選取接種量2%～5%進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面試驗。

2.1.3 葡萄糖添加量對蛋白酶活性的影響

葡萄糖添加量對蛋白酶活性的影響見圖3。

圖3 葡萄糖添加量對蛋白酶活性的影響

由圖3 可知，隨著葡萄糖添加量的增加，蛋白酶活性逐漸降低。葡萄糖添加量為5%時，蛋白酶活性最高，但葡萄糖添加量為5%～10%時，蛋白酶活力無顯著性差異。葡萄糖濃度過高時，會導(dǎo)致滲透壓過高從而抑制菌株生長。因此，選取葡萄糖添加量5%～10%進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面試驗。

王京元等[8]在王茜等研究的基礎(chǔ)上利用車道功能矩陣和相位矩陣，給出相對完整的信號交叉口車道功能劃分的計算步驟. 但是只進(jìn)行簡單的理論計算，缺乏實證研究. 劉培華等[9]提出通過3階段：信號配時方案對比—確定渠化形式—信號配時優(yōu)化，結(jié)合Synchro等仿真軟件針對信號交叉口信號配時現(xiàn)狀方案進(jìn)行研究，給出優(yōu)化方案，文章針對北京某交叉口給出優(yōu)化過程，但是缺乏普適性.

2.1.4 pH 值對蛋白酶活性的影響

pH 值對蛋白酶活性的影響見圖4。

圖4 pH 值對蛋白酶活性的影響

由圖4 可知，隨著pH 值的增加，蛋白酶的活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，pH 值為7 時，蛋白酶活力最高，但pH 值為5～7 時，蛋白酶活力無顯著性差異。pH 值對菌株細(xì)胞膜的透過性和營養(yǎng)成分的可溶性均具有影響，從而影響菌株對營養(yǎng)成分的吸收和生長產(chǎn)生影響，與胡亞平等人[13]的結(jié)果相似，pH 值過高或過低都不利于納豆菌的生長。因此，選取pH值5～7 進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面試驗。

2.1.5 發(fā)酵溫度對蛋白酶活性的影響

發(fā)酵溫度對蛋白酶活性的影響見圖5。

圖5 發(fā)酵溫度對蛋白酶活性的影響

由圖5 可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，蛋白酶活性逐漸降低。發(fā)酵溫度為30 ℃時，蛋白酶活力最高，但發(fā)酵溫度為30～40 ℃時，蛋白酶活力無顯著性差異。有研究表明，納豆菌蛋白酶的最適發(fā)酵溫度為37 ℃，高于40 ℃蛋白酶的穩(wěn)定性降低[14]。因此，選取發(fā)酵溫度30～40 ℃進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面試驗。

2.1.6 轉(zhuǎn)速對蛋白酶活性的影響

轉(zhuǎn)速對蛋白酶活性的影響見圖6。

由圖6 可知，隨著轉(zhuǎn)速的增加，蛋白酶活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。轉(zhuǎn)速為120 r/min 時，蛋白酶活力最高，但轉(zhuǎn)速為120～180 r/min時，蛋白酶活力無顯著性差異。轉(zhuǎn)速影響發(fā)酵液中的溶解氧含量，納豆菌為好氧型微生物，轉(zhuǎn)速過低不利于菌株生長。王婷[15]采用納豆菌發(fā)酵海參卵，轉(zhuǎn)速為180 r/min時，蛋白酶活性最高可達(dá)6 723 U/mL。因此，選取轉(zhuǎn)速120～180 r/min 進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面試驗。

圖6 轉(zhuǎn)速對蛋白酶活性的影響

2.2 PB 試驗分析

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，選擇海參添加量、葡萄糖添加量、溫度、pH 值、接種量和轉(zhuǎn)速6 個因素，以蛋白酶活性作為響應(yīng)值，采用PB 試驗優(yōu)化納豆菌發(fā)酵海參的工藝條件。

PB 試驗設(shè)計及蛋白酶活性響應(yīng)值見表3，PB 試驗中各因素、水平及影響力見表4。

表3 PB 試驗設(shè)計及蛋白酶活性響應(yīng)值

表4 PB試驗中各因素、水平及影響力

試驗設(shè)計了5 個虛擬因素以滿足計算試驗誤差的需求，試驗次數(shù)為12 次，每個因素設(shè)置高、低2 個水平，考查影響蛋白酶活性的主要影響因素。表3為PB 試驗的設(shè)計及蛋白酶活性響應(yīng)值，根據(jù)表3 中的設(shè)計進(jìn)行發(fā)酵，測定了不同發(fā)酵條件下蛋白酶的活性。使用Design Expert 軟件進(jìn)行分析，可以獲得發(fā)酵條件對蛋白酶活性的影響及其顯著性。各變量對蛋白酶活性影響顯著程度依次為X3＞X1＞X2＞X6＞X4＞X5，設(shè)定置信度大于95%（p＜0.05） 為具有顯著影響，則海參添加量、葡萄糖添加量和接種量對蛋白酶活性有顯著性影響。

2.3 CCD 試驗分析

通過CCD 試驗對PB 試驗得到的3 個主要因素進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，以獲得每個因素的最佳條件。

CCD 試驗設(shè)計及蛋白酶活性響應(yīng)值見表5。

表5 CCD 試驗設(shè)計及蛋白酶活性響應(yīng)值

利用Design Expert 軟件進(jìn)行分析可得到蛋白酶活性與培養(yǎng)條件間的關(guān)系方程如下：

式中：Y——蛋白酶活性，U/mL。

CCD 試驗?zāi)Ｐ偷娘@著性分析見表6。

由表6 可知，試驗?zāi)Ｐ偷膒＜0.05，說明該模型顯著，可信度較高。3 個變量中海參添加量（X1），葡萄糖添加量（X2），接種量（X3） 對蛋白酶活性影響顯著，與PB 試驗的結(jié)果吻合。

表6 CCD 試驗?zāi)Ｐ偷娘@著性分析

通過響應(yīng)面優(yōu)化的方法，得到了上述的關(guān)系方程，從而可以求解該方程的極值，也就是蛋白酶活性最高值，同時求得對應(yīng)的因素值。通過對該方程求一階偏導(dǎo)，并令其等于零，即可求得X1，X2，X3分別為35%，7.5%和4%時，得到蛋白酶活性的最大理論值為522.56 U/mL。

2.4 響應(yīng)面交互作用分析

各因素交互作用對蛋白酶活性影響的響應(yīng)面見圖7。

由圖7 可知，三維圖中的等高線橢圓程度代表兩因素間交互作用對蛋白酶活性影響的顯著性，由圖7 可知，3 個因素之間的交互作用對蛋白酶活性影響都不顯著，結(jié)果與顯著性分析一致。但是，這3個擬合曲面的開口朝下，方程均有極大值，說明最優(yōu)值是在所設(shè)定的范圍內(nèi)的，也進(jìn)一步說明了最初取值范圍的正確性。

圖7 各因素交互作用對蛋白酶活性影響的響應(yīng)面

2.5 模型驗證

CCD 試驗中預(yù)測的最佳發(fā)酵條件為海參添加量、葡萄糖添加量和接種量分別為35%，7.5%和4.0%時，蛋白酶活性的最大理論值為522.56 U/mL。根據(jù)預(yù)測出的最佳條件進(jìn)行驗證試驗，得到蛋白酶活性的實際值為535.12 U/mL，與預(yù)測值522.56 U/mL 無顯著差異（p＞0.05），證明該模型具有可靠性。

3 結(jié)論

以蛋白酶活性作為檢測指標(biāo)，在海參添加量、葡萄糖添加量、溫度、pH 值、接種量、轉(zhuǎn)速等單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對納豆菌發(fā)酵海參的各個工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，最佳工藝條件為海參添加量35%，葡萄糖添加量7.5%，接種量4%，在該條件下測得蛋白酶活性為535.12 U/mL，與理論值522.56 U/mL 相近。為新型海參精深加工產(chǎn)品的開發(fā)與應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。