周 芳，邢曉玲，余春苗，周 洲，王 薇

（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院，江蘇泰州 225300）

地塞米松（Dexamethasone）又稱氟美松、氟甲強的松龍，是一種人工合成的糖皮質(zhì)激素，屬于甾體類化合物，在獸醫(yī)臨床中常用到醋酸地塞米松和地塞米松磷酸鈉。醋酸地塞米松為白色或類白色的結(jié)晶或結(jié)晶性粉末，在乙醇或氯仿中略溶，在乙醚中極微溶，在水中不溶，常制成片劑。地塞米松磷酸鈉為白色或微黃色粉末，在水中或甲醇中溶解，在丙酮、乙醚中幾乎不溶，常制備為注射劑。地塞米松的藥理作用主要是抗炎、抗過敏、免疫抑制和抗休克，在獸醫(yī)臨床上廣泛應用于治療母畜代謝病，或與抗生素聯(lián)合用于治療感染性疾病。由于其能提高飼料的轉(zhuǎn)化率，促進畜禽生長，因此也用于畜牧生產(chǎn)[1-2]。然而，如果在動物生長過程中過量或不正確使用該藥，會導致動物出現(xiàn)水腫、低血鉀、肌肉萎縮、幼畜生長停滯和骨質(zhì)疏松等癥狀；同時還會導致其在動物可食性組織中殘留。盡管這類藥物殘留很低，但如果長期食用地塞米松殘留超標食品，會引起人體激素代謝紊亂、肥胖、致畸或致癌等，產(chǎn)生蓄積性毒性、生態(tài)毒性，對人體健康和生態(tài)環(huán)境都會產(chǎn)生危害[3-5]。

1 地塞米松殘留限量規(guī)定

由于用藥安全意識淡薄和經(jīng)濟利益的驅(qū)使，養(yǎng)殖過程中不遵守休藥期或過量使用地塞米松的現(xiàn)象時有存在。為規(guī)范該藥物的使用、確保動物源性食品的質(zhì)量安全以及保證消費者的健康，有必要對動物源性食品中地塞米松的殘留加強管理。很多國家都嚴格禁止將地塞米松作為動物的生長激素進行使用，同時限制其用于動物源性食品中，并提出了嚴格的限量要求（表1）[6-7]。

表1 不同組織和國家對動物源性食品中地塞米松的最大殘留限量規(guī)定

2 地塞米松殘留檢測技術(shù)

2.1 儀器分析法

2.1.1 氣相色譜法

氣相色譜（Gas Chromatography，GC）是一種以氣體為流動相的色譜法，氣體流動相稱為載氣，注入進樣口的物質(zhì)或其衍生物被加熱氣化后，由載氣帶入色譜柱進行分離，先后被檢測器檢出。氣相色譜一般適用于分析分子量不大、有一定揮發(fā)性、在氣化或高溫下不分解的物質(zhì)，若分子量大可以通過各種處理衍生為易揮發(fā)的化合物進行測定。

糖皮質(zhì)激素揮發(fā)性不夠，應用氣相色譜技術(shù)檢測時通常需要進行適當?shù)难苌磻詷悠返那疤幚硐鄬Ρ容^麻煩。早期用于檢測糖皮質(zhì)激素的氣相色譜分析方法使用的是OV-17 柱，檢測的是糖皮質(zhì)激素的三甲基硅烷的衍生物[8]。氣相色譜的靈敏度可以基本達到獸藥殘留的要求，但不適合痕量獸藥殘留分析的要求。

2.1.2 高效液相色譜法

高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是目前應用廣泛的一種分離分析技術(shù)，采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動相泵裝入有固定相的色譜柱中，柱內(nèi)各成分在兩相中分配系數(shù)存在微小差異而被分離，通過檢測器實現(xiàn)對樣品的分析。該方法適合不揮發(fā)性化合物、極性化合物和熱不穩(wěn)定化合物的分析測定。糖皮質(zhì)激素的檢測通常選用配有紫外檢測器的液相色譜儀，可以提供比較滿意的選擇性和靈敏度。

20 世紀90 年代初，研究人員用正相和反相色譜法檢測牛肉中的地塞米松，此后用于檢測糖皮質(zhì)激素的正相和反相色譜技術(shù)得到迅速發(fā)展[9-10]。2007年我國農(nóng)業(yè)部發(fā)布了高效液相色譜法檢測豬可食性組織中地塞米松殘留的標準[11]。周佳等[12]建立了同時檢測畜禽肉中地塞米松和呋喃唑酮殘留的高效液相色譜法，該方法分離效果良好，平均回收率為85.41%～95.20%，最低檢出限達1.0 ～2.0 μg/mL。與氣相色譜技術(shù)相比，高效液相色譜不需要對樣品進行衍生化，易于操作；但由于糖皮質(zhì)激素的種類較多且分子結(jié)構(gòu)相似程度大，導致在用該法檢測時存在地塞米松和其他糖皮質(zhì)激素分離度欠佳的問題[6,13]。

2.1.3 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）是將GC 和MS 通過接口連接起來，GC 將復雜混合物分離成單組分后進入MS。MS 是在電場和磁場中將運動的離子，如帶電荷的原子、分子或分子碎片等，按它們的質(zhì)荷比分離后進行檢測的方法。色譜法不能對分析物進行準確定性及結(jié)構(gòu)鑒定，而與質(zhì)譜法聯(lián)用能很好地解決這些問題。隨著色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的出現(xiàn)，許多研究者開始使用GC-MS 對尿樣、血液、動物源性食品中的甾體激素殘留進行測定與分析，并且具有較高的靈敏度。但是，MCLAUGHLIN 等[9]在用GC-MS 測定牛肝臟和肌肉組織中的地塞米松前，對待測物進行三甲基硅烷-烯醇-三甲基硅烷衍生化，處理相對較煩瑣。

2.1.4 液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法

液相色譜與質(zhì)譜在液相色譜中被分離，離子化后經(jīng)質(zhì)譜的質(zhì)量分析器將離子碎片按質(zhì)量數(shù)分開，經(jīng)檢測器得到質(zhì)譜圖。該方法有液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用 法（Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，LC-MS）和 液 相 色 譜- 串 聯(lián) 質(zhì) 譜 法（Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，LCMS/MS），LC-MS/MS 相比LC-MS 能提供更多的質(zhì)譜信號，有更高的選擇性和靈敏度，對復雜樣品基質(zhì)中痕量組分的定性、定量分析具有獨特的優(yōu)勢，是分析糖皮質(zhì)激素的主要方法[2,6,14-15]。

使用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)能將糖皮質(zhì)激素中互為差向異構(gòu)體的地塞米松和倍他米松進行有效區(qū)分。DRAISCI 等[16]采用加速溶劑萃取法快速提取牛肝臟中的倍他米松和地塞米松，通過LC-MS 檢測了這兩種物質(zhì)，肝組織中的倍他米松和地塞米松的最低定量限可達1 μg/kg，回收率為74%～77%。ANTIGNAC 等[17]用C18固相萃取柱濃縮和凈化樣品，用LC-MS/MS 檢測了牛肉、尿、毛發(fā)中的倍他米松和地塞米松等12 種糖皮質(zhì)激素殘留，其中肉和尿中的激素殘留最低檢測限為0.04 ～0.07 μg/kg，毛發(fā)中的激素殘留最低檢測限為2.9 ～9.3 μg/kg，回收率為32%～67%。候亞莉等[18]將牛肉樣品在堿性條件下經(jīng)乙酸乙酯提取，正己烷脫脂，通過MCX 固相萃取小柱凈化，采用LC-MS/MS測定地塞米松、倍他米松、倍氯米松藥物殘留，檢出限和定量限分別為0.5 μg/kg和2.0 μg/kg，回收率在77.6%～97.9%。

對于牛奶中地塞米松的殘留檢測，因其中含有較多的蛋白質(zhì)、脂肪，目標化合物含量低，易對檢測造成干擾，因此前處理比較關(guān)鍵。任宏彬等[19]在用LC-MS 測定牛奶中地塞米松時，采用固相萃取法處理樣品并優(yōu)化色譜條件，方法的檢出限和定量限分別為0.08 μg/kg 和0.25 μg/kg，回收率為65.7%～85.7%。陳妍等[20]建立了一種快速測定牛奶中地塞米松殘留的LC-MS/MS 方法，檢出限為0.19 μg/kg，回收率為85%～107.2%，檢出限低于GB/T 22978—2008 中牛奶中地塞米松殘留量的測定[21]。該法采用乙腈提取，正己烷液液萃取，不需要采用固相萃取柱，大大簡化了提取凈化的過程，縮短了檢測時間，可用于牛奶中地塞米松殘留量的初步篩查。目前，檢測畜禽和牛奶中地塞米松和氯丙嗪均為單獨檢測或與其他同類物質(zhì)同時檢測，張燕等[22]開發(fā)了同時測定畜禽肉和牛奶中這兩種藥物殘留的方法。樣品經(jīng)乙腈提取，C18固相分散萃取凈化，通過LC-MS/MS 測定豬肉、牛肉、雞肉和牛奶中地塞米松及氯丙嗪，方法的檢出限為0.1 μg/kg，定量限為0.3 μg/kg，回收率為70.1%～119.4%。

2.1.5 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS），借助了液相色譜的理論及原理，基于小顆粒高性能微粒作為固定相，與傳統(tǒng)的HPLC技術(shù)相比提供了更高的效率，具有更強的分離能力。該方法分離能力高效、選擇性高、靈敏度高，在近些年的獸藥殘留分析中經(jīng)常被研究和應用。

基于此方法，有研究者開發(fā)出同時檢測一種動物源性食品中多種獸藥殘留的方法或檢測不同動物源食品中的地塞米松殘留的方法。仲伶俐等[23]將牛奶樣品通過乙腈提取后，采用Oasis PRiME HLB 固相萃取小柱凈化，建立了同時測定牛奶中地塞米松、替米考星、氟苯尼考和氯霉素藥物殘留的UPLCMS/MS，方法的檢測限達0.1 ～0.2 μg/kg，定量限為0.2 ～0.5 μg/kg，平均回收率為78.6%～94.7%。陳少莉等[24]在農(nóng)業(yè)部發(fā)布的LC-MS 檢測動物源性食品中糖皮質(zhì)激素類藥物多殘留方法的基礎上，對測定條件進行優(yōu)化，開發(fā)了UPLC-MS/MS 測定豬、牛肉、雞蛋和牛奶中的地塞米松，平均回收率在83.2%～108.2%，最低定量限在0.2 ～1.0 μg/kg[25]。楊毅青等[26]分別將牛奶、雞蛋樣品經(jīng)乙酸-乙酸鈉和甲醇溶液處理，通過兩種固相萃取柱串聯(lián)凈化樣品，使用UPLC-MS/MS 測定不同基質(zhì)中地塞米松殘留量，平均回收率為70.53%～118.25%，RSD 為3.5%～7%。曹麗麗等[27]采用QuEChERS 前處理，將不同動物源性基質(zhì)進行凈化后用UPLC-MS/MS 測定多種動物源性食品中的地塞米松殘留，檢出限為0.1 μg/kg，平均回收率為73.2%～95.9%。

2.2 免疫分析法

2.2.1 免疫層析法

免 疫 層 析 法（immunochromatography assay，ICA）是20 世紀末發(fā)展起來的一種結(jié)合了免疫技術(shù)和色譜層析技術(shù)的檢測方法，是基于抗原抗體特性免疫反應的一種新型膜檢測技術(shù)。在層析過程中，標記了膠體金或熒光物質(zhì)的抗體與樣本中的待檢測物質(zhì)結(jié)合形成復合物，通過毛細作用力在試紙條上層析，并被硝酸纖維素膜上的特異性抗體或抗原捕獲而富集，根據(jù)肉眼或儀器對條帶上的標記物進行觀察或檢測來實現(xiàn)定性或定量檢測。目前研究應用的熱點主要是膠體金免疫層析、熒光免疫層析和磁珠免疫層析[28]。免疫層析檢測技術(shù)具有單人份檢測、對操作者要求低、檢測快速和成本低等優(yōu)點，是免疫檢測方法中的常見技術(shù)。近年來，隨著地塞米松半抗原及抗體的開發(fā)，越來越多的研究者開發(fā)了基于免疫層析原理的地塞米松快速檢測方法。

WANG 等[29]制備了基于地塞米松琥珀酸酐衍生物半抗原的抗地塞米松單克隆抗體，該抗體對地塞米松具有高特異性，抗體的半抑制濃度（IC50）為0.095 ng/mL，并以此為基礎開發(fā)了用于檢測牛奶中地塞米松殘留的免疫層析膠體金試紙條，在牛奶樣品中的視覺臨界值（cutoff 值）為0.5 ng/mL，每次檢測僅需10 min。ZHANG 等[30]開發(fā)了基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光微球的免疫層析檢測方法，用于快速、定量檢測動物組織中的地塞米松，IC50為0.58 ng/mL，檢出限為0.3 μg/kg，平均回收率達84.5%，同時配套了手持讀取儀進行現(xiàn)場定量，可在10 min 內(nèi)讀取結(jié)果。LI 等[31]將膠乳顆粒應用于免疫層析，實現(xiàn)了牛奶和豬肉中地塞米松的定量檢測，15 min 內(nèi)完成檢測，肉眼判讀的檢出限分別為0.3 μg/L 和0.7 μg/kg，定量限分別為0.047 μg/L 和0.087 μg/kg，回收率為80.0%～122.8%。在此基礎上，LI 等[32]又開發(fā)了基于時間分辨熒光微球的地塞米松免疫層析檢測方法，配套手持式熒光讀取儀可定量檢測牛奶和豬肉中的地塞米松，cutoff 值分別為0.25 μg/L 和0.7 μg/kg，定量限分別達到0.003 μg/L 和0.062 μg/kg，檢測結(jié)果與LC-MS/MS 檢測結(jié)果基本一致。

免疫檢測技術(shù)已經(jīng)廣泛應用于人類醫(yī)學、動物醫(yī)學、食品安全和環(huán)境衛(wèi)生的檢驗。早期的免疫層析技術(shù)主要利用膠體金顯色原理進行定性檢測，近10 年來，隨著熒光材料（包括熒光染料、普通熒光微球、時間分辨微球和上轉(zhuǎn)發(fā)光微球等各種微球）和超順磁性納米微球新型標記物及檢測儀的開發(fā)，基于免疫層析平臺的定量檢測產(chǎn)品已經(jīng)實現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化。

2.2.2 酶聯(lián)免疫法

酶聯(lián)免疫法（Enzyme-Linked Immune Sorbent Assay，ELISA）是將抗原或抗體結(jié)合至某種固相載體表面，并保持其免疫活性，將抗原或抗體與某種酶聯(lián)結(jié)成酶標抗原或抗體，加入待測定樣品，使其與被吸附的抗原或抗體及后加入的酶標二抗之間發(fā)生免疫反應，最后加入酶反應底物，終止反應，根據(jù)顯色反應所產(chǎn)生顏色的深淺用分光光度計進行定性或定量分析。該方法具有靈敏度高、特異性強、分析時間短、樣品檢測成本低和復雜樣品預處理簡單的特點，適合于批量樣品的定性初篩工作。ELISA法的類型有間接法、雙抗體夾心法、競爭法。前兩種方法用于測定抗體和大分子抗原，應用于臨床診斷；競爭法按實驗步驟的不同又可分為直接競爭法和間接競爭法，適合測定小分子抗原，尤其適用于食品安全檢測領域[33-34]。

早在1998 年CERNI 等[35]開發(fā)了一種快速簡單的提取方法，并通過酶聯(lián)免疫法測定牛肝中地塞米松，回收率為92%～154%，檢出限和定量限分別 為1.43 μg/kg 和2.09 μg/kg。KOLANOVI?[36]對Euro-Proxima B.V.公司的皮質(zhì)類固醇酶聯(lián)免疫試劑盒性能進行了驗證，此試劑盒可檢測奶、肝臟、尿液等樣本中的地塞米松等皮質(zhì)類固醇，其中牛奶和肝臟中地塞米松的檢出限分別為0.2 μg/kg 和0.6 μg/kg，定量限分別為0.3 μg/kg 和1.4 μg/kg，回收率為68%～131%。VDOVENKO 等[37]開發(fā)了一種基于過氧化物酶檢測牛奶中地塞米松的化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測方法。通過對牛奶添加25%的甲醇并進行離心，防止了牛奶的基質(zhì)效應。檢測的IC50為0.9 ng/mL，檢測的變異系數(shù)為2.2%～9.9%，回收率在82%～142%。羅曉琴等[7]建立的間接競爭ELISA 法對雞肉樣本的最低檢測限為0.1 μg/kg，變異系數(shù)為9.0%～12.2%，該方法的樣本前處理簡單、靈敏度高、準確度和精密度可滿足獸藥殘留檢測要求。WANG 等[38]制備了地塞米松半抗原和多克隆抗體，并建立了間接競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗，檢測雞組織中的地塞米松，IC50為0.061 ng/mL，檢出限為0.015 μg/mL，回收率為83.3%～114.2%，變異系數(shù)為5.6%～9.5%；雞肉和雞肝中地塞米松的檢出限分別為0.3 μg/kg 和0.5 μg/kg，具有靈敏度高、精密性好的特點，不足之處在于抗體對地塞米松的結(jié)構(gòu)類似物有交叉反應，特異性欠缺。采用間接競爭ELISA法檢測地塞米松殘留，具有精確度和靈敏度較高、操作技術(shù)要求低、檢測時間短和檢測樣本量大等特點，適合于大量樣本中地塞米松殘留檢測的快速篩選，已成為目前用于畜禽組織中獸藥殘留檢測的常用方法。

3 結(jié)語

GC、GC-MS 檢測地塞米松殘留都需要對樣品進行衍生化，樣品的前處理比較煩瑣，目前應用不多。隨著聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在地塞米松殘留檢測中應用較多，LC-MS、LC-MS/MS、UPLCMS/MS 將色譜對復雜樣品的高分離能力與質(zhì)譜的高選擇性、高靈敏度以及能夠提供相對分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)信息的優(yōu)點結(jié)合起來，提高了樣品分析工作效率，目前在藥物分析、食品分析、環(huán)境分析等領域應用廣泛。在法定的動物源性食品中糖皮質(zhì)激素殘留檢測、地塞米松殘留檢測多采用該類方法。因動物源性食品中地塞米松的殘留水平較低，其屬于糖皮質(zhì)激素，內(nèi)源性的干擾物質(zhì)較多，基質(zhì)復雜難分離，會干擾實驗結(jié)果、污染儀器，所以在測定前會采用各種凈化處理方式對樣品基質(zhì)進行處理，如采用正己烷脫脂法、固相萃取法、QuEChERS 前處理，以達到對檢測物富集和便于測定的目的。儀器測定方法結(jié)果準確、靈敏度較好，但樣品前處理復雜、儀器昂貴、需專業(yè)人員操作且檢測時間長，由于檢測成本、檢測周期和人員要求的原因限制了其在基層的推廣及現(xiàn)場的高通量檢測。

目前地塞米松的免疫檢測方法主要是免疫層析和酶聯(lián)免疫，膠體金免疫層析法操作簡單、使用方便，適合檢測機構(gòu)、監(jiān)督部門、生產(chǎn)企業(yè)的現(xiàn)場快速檢測，屬于定性檢測方法，缺點是靈敏度欠佳。酶聯(lián)免疫分析法具有通量大、靈敏度高、特異性強和成本較低的特點，但操作過程需要專業(yè)人員操作，耗時較長、操作較煩瑣，且需要樣本積累到一定的數(shù)量，否則容易造成浪費，比較適用于中心實驗室的檢驗。近些年，隨著生物技術(shù)的發(fā)展和人們對食品安全的關(guān)注，地塞米松免疫檢測的原料及成品試劑盒也越來越成熟。理論上而言，只要制備了地塞米松的半抗原和抗體，就可以開發(fā)各種包括免疫層析、酶聯(lián)免疫、免疫熒光等在內(nèi)的免疫檢測方法。對于免疫層析而言，由于近年來出現(xiàn)了各種標記物，有望提高檢測的靈敏度，但傳統(tǒng)的膠體金或微球免疫熒光已能滿足各國對食品中地塞米松的檢出要求，所以將來的發(fā)展方向可能是進一步簡化各種樣本的前處理，使檢測方法更加簡單、快速。對于酶聯(lián)免疫檢測這種傳統(tǒng)的免疫檢測方法而言，因為靈敏度足夠高，可能更側(cè)重于提高檢測的特異性，以防止檢測過程中出現(xiàn)假陽性的情況。

獸藥殘留是影響動物源性食品安全的一個重要因素，檢測技術(shù)是保障食品安全的技術(shù)支撐，通過對地塞米松殘留檢測研究技術(shù)的綜述，以期為食品中該藥物的殘留檢測相關(guān)研究和安全監(jiān)管提供參考。同時，仍需要主管部門完善法律體系，從養(yǎng)殖的源頭控制和規(guī)范使用獸藥，遵守休藥期，多方面確保食品質(zhì)量安全和人們的健康。