駱玉兔，潘家華，劉 云，田胤純，劉 俊

江蘇省泰州市第二人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，江蘇泰州 225500

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是呼吸系統(tǒng)一種常見(jiàn)的多發(fā)性疾病，病死率較高，主要致病因素是過(guò)多吸入有害顆?；驓怏w，造成肺內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)、肺部炎癥等，多發(fā)于中老年人群[1]?，F(xiàn)階段的治療方案雖獲得一定療效，但無(wú)法完全抑制病情發(fā)展，在降低患者病死率方面效果不佳[2]。為了闡明COPD發(fā)病機(jī)制需要探討COPD病情發(fā)展中的特異性生物標(biāo)志物，這是開(kāi)發(fā)臨床新藥、改善患者預(yù)后的關(guān)鍵。沉默信息調(diào)節(jié)因子相關(guān)酶1(SIRT1)參與細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制并發(fā)揮一定調(diào)控作用；活化轉(zhuǎn)錄因子4(ATF4)在氧化應(yīng)激反應(yīng)中具有一定的調(diào)控作用；表達(dá)于Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞表面的涎液化糖鏈抗原-6(KL-6)是一種糖蛋白，在肺疾病中具有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值[3-5]。但SIRT1、ATF4、KL-6在COPD病情發(fā)展與氣道重塑中的研究較少。因此本研究旨在分析不同病情嚴(yán)重程度COPD患者SIRT1、ATF4、KL-6蛋白的水平差異，探討COPD患者不同氣道重塑程度與SIRT1、ATF4、KL-6蛋白表達(dá)的相關(guān)性，探討SIRT1、ATF4、KL-6蛋白在COPD病情發(fā)展以及氣道重塑中的可能調(diào)控機(jī)制。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2020年1月至2021年5月在本院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科診斷為急性加重期COPD合并肺腫瘤、穩(wěn)定期COPD合并肺腫瘤的肺葉切除組織蠟塊標(biāo)本各40例分別作為急性期組、穩(wěn)定期組，另選取本院呼吸內(nèi)科保存的40例確診為非COPD的肺腫瘤患者肺葉切除組織蠟塊標(biāo)本作為對(duì)照組，收集所有研究對(duì)象的臨床資料。急性期組：男21例，女19例；年齡35～66歲，平均(54.41±3.22)歲；體質(zhì)量指數(shù)(BMI)18～25 kg/m2，平均(21.43±1.03)kg/m2；病程1～12年，平均(6.38±2.11)年；有糖尿病史23例，吸煙史22例，飲酒史23例。穩(wěn)定期組：男20例，女20例；年齡35～64歲，平均(54.39±3.22)歲；BMI 18～25 kg/m2，平均(21.38±1.02)kg/m2；病程1～12年，平均(6.38±2.11)年；有糖尿病史21例，吸煙史24例，飲酒史22例。對(duì)照組：男23例，女17例；年齡35～65歲，平均(54.39±3.19)歲；BMI 18～25 kg/m2，平均(21.41±1.05)kg/m2；病程1～13年，平均(6.35±2.12)年；有糖尿病史22例，吸煙史23例，飲酒史25例。3組年齡、性別、病程、既往病史等基線資料差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。將COPD患者依據(jù)臨床資料中的高分辨CT氣道重塑檢查結(jié)果劃分氣道重塑程度，選擇支氣管外徑大小1～5 mm為對(duì)象，計(jì)算氣道壁面積占總橫截面積比[WA%=(氣道總面積-氣道管腔面積)/氣道總面積]，采用WA%作為評(píng)估患者氣道重塑情況的指標(biāo)，按照<60%、≥60%～85%、>85%劃分為無(wú)氣道重塑組、輕中度組、重度組，分別為30例、30例、20例。所有研究對(duì)象及其家屬均詳細(xì)了解研究?jī)?nèi)容，在個(gè)人意愿下表示愿意參與并簽訂知情同意書。本研究已通過(guò)本院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

COPD納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者癥狀及肺功能指標(biāo)水平變化符合《慢性阻塞性肺疾病診療指南》[6]中COPD診斷標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)病理學(xué)等一系列檢查以及專家診斷，確診為COPD；(2)語(yǔ)言表達(dá)能力正常，可進(jìn)行無(wú)障礙溝通，可對(duì)自身疾病癥狀情況進(jìn)行有效反饋描述，并可以對(duì)自身的生活質(zhì)量、滿意度等進(jìn)行合理評(píng)價(jià)；(3)臨床資料完整，包含氣道重塑、肺功能等檢查項(xiàng)目；(4)合并肺腫瘤行肺葉切除術(shù)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并肺氣腫、慢性支氣管炎和支氣管哮喘疾?。?2)除本研究外還參與其他研究、試驗(yàn)的患者；(3)臨床資料不完整；(4)智力低下或患有精神疾病導(dǎo)致認(rèn)知障礙，無(wú)法溝通、反饋以及配合研究。

1.2方法 采用Western blotting法[7]檢測(cè)肺組織SIRT1、ATF4、KL-6蛋白水平。肺葉切除術(shù)組織蠟塊標(biāo)本切片脫蠟研磨后，加入200 μL裂解緩沖液并充分混勻，冰浴30 min，細(xì)胞充分裂解后在4 ℃條件下，按照1 300 r/min離心10 min。提取上清液分裝于容器中，在-20 ℃環(huán)境中保存?zhèn)溆?。蛋白濃度使用BCA分析試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后將蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)移至PVDF膜并進(jìn)行標(biāo)記，使用TBST進(jìn)行重復(fù)洗膜，至少3次，每次持續(xù)10 min。將5%濃度的脫脂奶粉加入進(jìn)行封閉處理，持續(xù)2 h，加入一抗溶劑在37 ℃環(huán)境中進(jìn)行搖床，振蕩混勻后進(jìn)行孵育，過(guò)夜。使用TBST進(jìn)行清洗，重復(fù)清洗3次，每次持續(xù)10 min。加入二抗試劑在室溫環(huán)境中持續(xù)反應(yīng)2 h，使用TBST進(jìn)行清洗，重復(fù)清洗3次，每次持續(xù)5～10 min。在ECL化學(xué)發(fā)光液暗盒中進(jìn)行曝光。將獲得的結(jié)果應(yīng)用Gel-Pro32軟件進(jìn)行灰度分析，以2-ΔΔCt計(jì)算SIRT1、ATF4、KL-6蛋白的表達(dá)情況。

1.3觀察指標(biāo) (1)對(duì)比3組肺組織SIRT1、ATF4、KL-6蛋白水平；(2)繪制受試者工作特征(ROC)曲線分析肺組織SIRT1、ATF4、KL-6蛋白檢測(cè)在COPD診斷中的應(yīng)用價(jià)值，包括靈敏度、特異度、曲線下面積(AUC)；(3)分析無(wú)氣道重塑組、輕中度組、重度組的肺組織SIRT1、ATF4、KL-6蛋白表達(dá)與COPD患者氣道重塑的相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1比較3組肺組織SIRT1、ATF4、KL-6蛋白水平差異 與對(duì)照組相比，急性期組、穩(wěn)定期組的肺組織SIRT1蛋白水平明顯降低(P<0.05)，肺組織ATF4、KL-6蛋白水平明顯升高(P<0.05)；且與穩(wěn)定期組相比，急性期組的肺組織SIRT1蛋白水平明顯降低(P<0.05)，肺組織ATF4、KL-6蛋白水平明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)表1、圖1～3。

表1 各組肺組織SIRT1、ATF4、KL-6蛋白水平比較

圖1 各組SIRT1蛋白免疫組化結(jié)果(×200)

圖2 各組ATF4蛋白免疫組化結(jié)果(×200)

圖3 各組KL-6蛋白免疫組化結(jié)果(×200)

2.2肺組織SIRT1、ATF4、KL-6蛋白檢測(cè)診斷COPD的效能分析 肺組織SIRT1、ATF4、KL-6蛋白檢測(cè)診斷COPD的靈敏度、特異度均在70.00%以上，AUC均在0.740以上。見(jiàn)表2、圖4。

表2 肺組織SIRT1、ATF4、KL-6蛋白檢測(cè)對(duì)COPD的診斷效能

圖4 肺組織SIRT1、ATF4、KL-6蛋白診斷COPD的ROC曲線

2.3不同氣道重塑程度COPD患者肺組織SIRT1、ATF4、KL-6蛋白水平差異及其相關(guān)性 與無(wú)氣道重塑組相比，重度組、輕中度組的肺組織SIRT1蛋白水平明顯降低(P<0.05)，肺組織ATF4、KL-6蛋白水平明顯升高(P<0.05)；重度組的SIRT1蛋白水平與輕中度組相比明顯降低(P<0.05)，ATF4、KL-6蛋白水平明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 不同氣道重塑程度COPD患者肺組織SIRT1、ATF4、KL-6蛋白表達(dá)差異

COPD患者氣道重塑WA%與肺組織SIRT1蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.635，P<0.001)，與肺組織ATF4、KL-6蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.768、0.892，P<0.001)。見(jiàn)圖5～7。

圖5 氣道重塑WA%與肺組織SIRT1蛋白相關(guān)性

圖6 氣道重塑WA%與肺組織ATF4蛋白相關(guān)性

圖7 氣道重塑WA%與肺組織KL-6蛋白相關(guān)性

3 討 論

絕大多數(shù)COPD患者死亡歸因于吸煙，吸煙是導(dǎo)致COPD患者病情急性發(fā)作、癥狀加重的主要原因。COPD急性加重主要特征為呼吸癥狀加重，其表現(xiàn)為呼吸困難加重、咳嗽次數(shù)和咳痰量增加以及氣道受阻。已有數(shù)據(jù)表明COPD患者的致死率隨著氣道重塑加重而相應(yīng)升高[8]。

SIRT1是Sirtuins中的重要組成成員，Sirtuins可通過(guò)多種途徑參與COPD疾病進(jìn)展，并發(fā)揮一定的調(diào)控作用[9]。COPD小鼠的炎性反應(yīng)以及免疫抑制誘發(fā)巨噬細(xì)胞大量聚集，進(jìn)而引起p65乙?；鰪?qiáng)，促使SIRT1大量轉(zhuǎn)化且活性降低，最終導(dǎo)致SIRT1在COPD小鼠肺組織中低表達(dá)，而上調(diào)SIRT1水平可能是后續(xù)COPD治療的一個(gè)新方向[10]。分析WA%與SIRT1蛋白水平呈負(fù)相關(guān)的作用機(jī)制如下：基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)與氣道重塑存在密切聯(lián)系，對(duì)多糖以外的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分降解具有明顯的調(diào)控作用，ECM降解以及過(guò)度沉積會(huì)造成氣道壁結(jié)構(gòu)異常、氣道重塑[11]。郭國(guó)華等[12]研究提出SIRT1低表達(dá)可促進(jìn)MMP-9高表達(dá)，進(jìn)而參與COPD患者的氣道重塑發(fā)生與發(fā)展過(guò)程并發(fā)揮一定的調(diào)控作用。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，COPD患者肺組織的SIRT1蛋白水平明顯降低，COPD患者的氣道重塑評(píng)估指標(biāo)WA%與SIRT1蛋白水平呈負(fù)相關(guān)，SIRT1診斷COPD的靈敏度、特異度均>75.00%，AUC>0.740，與以上機(jī)制及研究結(jié)論相符，提示COPD患者肺組織SIRT1蛋白參與COPD的發(fā)生、發(fā)展及患者的氣道重塑過(guò)程，SIRT1的異常變化可準(zhǔn)確診斷COPD。

氧化物會(huì)破壞蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子結(jié)構(gòu)，造成細(xì)胞凋亡，進(jìn)而促使COPD發(fā)生與病情進(jìn)展，而作為轉(zhuǎn)錄活性因子之一的ATF4對(duì)抗氧化劑表達(dá)具有一定的調(diào)控作用。在氧化及抗氧化過(guò)程中可發(fā)揮重要作用，而COPD患者多具有嚴(yán)重的氧化應(yīng)激反應(yīng)，在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，ATF4呈高水平表達(dá)[13]。劉娜等[14]研究報(bào)道，呼吸道感染等刺激引起中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞聚集，導(dǎo)致活性氧大量釋放，刺激氣道上皮細(xì)胞分泌高分子復(fù)合糖，破壞黏膜屏障，使血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性提升，進(jìn)而導(dǎo)致氣道損傷加重，而氧化應(yīng)激會(huì)誘發(fā)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，促使平滑肌收縮以及肥大細(xì)胞激活，氣道分泌物也會(huì)異常增加，最終造成氣道重塑。ATF4作為應(yīng)激反應(yīng)早期應(yīng)答因子表達(dá)明顯上調(diào)，影響抗氧化酶γ-GCS的表達(dá)，從而對(duì)細(xì)胞氧化還原能力、氧化應(yīng)激反應(yīng)起到一定的調(diào)控作用，推測(cè)AFT4通過(guò)調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)參與氣道重塑。本研究結(jié)果中COPD患者肺組織ATF4蛋白明顯高于對(duì)照組，COPD患者的氣道重塑評(píng)估指標(biāo)WA%與COPD患者的ATF4蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，與以上機(jī)制及研究結(jié)論相符。另外，本研究結(jié)果顯示ATF4蛋白診斷COPD的靈敏度、特異度均>78.00%，AUC>0.850，提示COPD患者肺組織ATF4蛋白在COPD病情發(fā)生、發(fā)展、氣道重塑過(guò)程中有所參與并發(fā)生明顯變化，ATF4蛋白在診斷COPD中具備良好的診斷效能。

KL-6存在于Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞表面，可以通過(guò)細(xì)胞脫落進(jìn)入血液、肺泡腔。NAKAMURA等[15]研究顯示，KL-6可促使纖維細(xì)胞分泌膠原蛋白，同時(shí)誘導(dǎo)膠原蛋白分化為肌成纖維細(xì)胞，最終造成肺組織出現(xiàn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變及細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積。COPD患者KL-6高表達(dá)的主要原因可能是COPD患者伴隨一定肺損傷，患者體內(nèi)的巨噬細(xì)胞大量分泌炎癥細(xì)胞因子引發(fā)嚴(yán)重的肺泡炎性反應(yīng)，炎性反應(yīng)使KL-6從肺泡內(nèi)滲透到血液中，進(jìn)而導(dǎo)致KL-6高水平表達(dá)。彭偉等[16]多因素Logistic回歸分析顯示KL-6升高是肺癌患者發(fā)生放射性肺炎的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，KL-6高表達(dá)會(huì)引發(fā)嚴(yán)重的炎性反應(yīng)。而腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等炎癥因子具有促進(jìn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、活化的作用，在炎性反應(yīng)狀態(tài)下TNF-α呈高表達(dá)，TNF-α可刺激氣道平滑肌細(xì)胞分泌內(nèi)皮素1(ET-1)促使氣道平滑肌收縮，進(jìn)而導(dǎo)致氣道細(xì)胞異常增殖，最終導(dǎo)致氣道重塑。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，COPD組肺組織KL-6蛋白明顯升高，COPD患者的氣道重塑評(píng)估指標(biāo)WA%與KL-6蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，與以上文獻(xiàn)數(shù)據(jù)、結(jié)論相符。另外，本研究結(jié)果顯示，KL-6蛋白在COPD診斷中的靈敏度、特異度均>70.00%，AUC>0.810，提示KL-6蛋白在COPD發(fā)生、發(fā)展及患者的氣道重塑過(guò)程中均有參與并發(fā)揮一定的調(diào)控作用，KL-6蛋白在COPD臨床診斷中有良好的診斷效能。

本研究仍存在一定不足，例如研究樣本量相對(duì)較少，并且WA%不是氣道重塑的唯一評(píng)估指標(biāo)，雖獲得的數(shù)據(jù)、結(jié)論具有臨床文獻(xiàn)支持，但研究設(shè)計(jì)思路仍有進(jìn)一步完善的空間，為提高數(shù)據(jù)、結(jié)論的可信度應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，對(duì)本研究數(shù)據(jù)、結(jié)論進(jìn)行深入研究驗(yàn)證。

總之，COPD患者肺組織中SIRT1蛋白呈低表達(dá)，ATF4、KL-6蛋白均呈高表達(dá)，在COPD病情發(fā)展、氣道重塑中SIRT1、ATF4、KL-6蛋白均有參與，在COPD臨床診斷中具有良好的診斷效能，可作為COPD診斷及氣道重塑后續(xù)臨床治療的新研究方向。