薛慶麗，李延玲，郭瑞霞

河北省邯鄲市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，河北邯鄲 056601

肺癌是成人中最常見的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤，據(jù)中國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)(CSCO) 2020年統(tǒng)計(jì)，肺癌新增病例數(shù)和死亡人數(shù)仍然是處于高速增長(zhǎng)狀態(tài)[1]。非小細(xì)胞肺癌是肺癌的主要類型，約占肺癌總數(shù)的85%。大多數(shù)肺癌患者在首次確診時(shí)已經(jīng)處于疾病晚期，失去手術(shù)的機(jī)會(huì)[2]。早發(fā)現(xiàn)、早治療仍然是提高肺癌患者遠(yuǎn)期生存的關(guān)鍵。黃祥奇等[3]研究得出，循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)在非小細(xì)胞肺癌中的檢出率較高，并且與臨床病理有一定關(guān)系，可為非小細(xì)胞肺癌篩查提供一種參考手段，也可作為臨床分期的一個(gè)潛在附加指標(biāo)。CTC是指自發(fā)地或因醫(yī)源性原因存在于外周血液中的腫瘤細(xì)胞[4]。朱洪斌等[5]研究結(jié)果顯示，上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化序列2(ECT2)通過(guò)改變組織架構(gòu)激活腫瘤通道和DNA損壞參與腫瘤進(jìn)程。ECT2已被證實(shí)在多種惡性腫瘤中表達(dá)異常，如胃癌、乳腺癌、骨癌等，但是，其在肺癌患者血液中的表達(dá)情況及與患者臨床病理資料之間的關(guān)系尚未闡明。ECT2主要參與鳥嘌呤核苷酸交換，誘導(dǎo)細(xì)胞有絲分裂和增殖[6]。謝景臣等[7]研究表明，微小核糖核酸-411(miR-411)表達(dá)在肺癌中顯著上調(diào)，通過(guò)生存分析，他們發(fā)現(xiàn)具有較高miR-411表達(dá)水平的患者與較差的總體存活率相關(guān)。此外，姜貽乾等[8]研究表明，miR-411的表達(dá)通過(guò)靶向腫瘤抑制基因FOXOI促進(jìn)肺癌的細(xì)胞增殖。目前臨床中鮮見CTC、ECT2、miR-411聯(lián)合檢測(cè)診斷非小細(xì)胞肺癌的相關(guān)研究，所以本研究旨在探討非小細(xì)胞肺癌患者CTC及肺癌組織中ECT2、miR-411的表達(dá)及各指標(biāo)的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2020年2月至2021年2月在本院進(jìn)行肺切除術(shù)的非小細(xì)胞肺癌患者53例。53例非小細(xì)胞肺癌患者中男28例， 女25例；年齡22～79歲，平均(49.89±9.70)歲；有吸煙史33例，無(wú)吸煙史20例；病程0.8～3.0年；體質(zhì)量指數(shù)(BMI)19～27 kg/m2；病理分期:按國(guó)際TNM分期Ⅰ期21例，Ⅱ期19例，Ⅲ期13例；腫瘤最大徑：≤ 2 cm 28例，>2 cm 25例；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 32例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21 例。全部非小細(xì)胞肺癌患者病例均經(jīng)病理證實(shí)，并且有細(xì)胞學(xué)診斷和影像學(xué)診斷證明。選擇同期在本院進(jìn)行氣管鏡活檢或者CT引導(dǎo)穿刺術(shù)診斷為肺良性病變的患者52例。52例肺良性病變患者中男 29例， 女23例；年齡23～80歲，平均(52.57±12.20)歲；病程0.7～3.0年；BMI 20～27 kg/m2；有吸煙史33例，無(wú)吸煙史19例；結(jié)核瘤29例，炎性假瘤17例，機(jī)化肺炎6例。非小細(xì)胞肺癌和肺良性病變患者的性別、年齡、病程、BMI、吸煙情況差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，有可比性。本研究所有患者及其家屬均知情同意。本研究經(jīng)過(guò)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)非小細(xì)胞肺癌符合《NCCN非小細(xì)胞肺癌臨床實(shí)踐指南》[9]中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)，且病理及臨床診斷為非小細(xì)胞肺癌；(2)肺良性病變通過(guò)氣管鏡活檢或CT引導(dǎo)穿刺術(shù)等病理及臨床診斷排除惡性腫瘤；(3)氣管鏡活檢、CT引導(dǎo)穿刺術(shù)或者手術(shù)前未接受任何放射治療和化學(xué)治療。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他惡性腫瘤；(2)精神異常；(3)妊娠期、哺乳期女性；(4)進(jìn)行肺癌切除手術(shù)前接受放射治療、化學(xué)治療以及生物學(xué)療法。

1.2方法

1.2.1采集肺組織 非小細(xì)胞肺癌患者均接受肺癌切除術(shù)治療，術(shù)中標(biāo)本離體后，橫切腫瘤組織，分別取 1 cm×1 cm× 1 cm 的癌中心組織，以及距離腫瘤邊緣 5 cm 以上的離體癌旁正常肺組織(1 cm×1 cm×1 cm)。組織切取后放入液氮中冷凍并一直保存在液氮中待用。肺良性病變患者通過(guò)氣管鏡活檢，CT引導(dǎo)穿刺術(shù)取的標(biāo)本后也放入液氮中冷凍并一直保存在液氮中待用。

1.2.2熒光定量PCR檢測(cè)miR-411表達(dá)量 分別取0.1 cm×0.1 cm非小細(xì)胞肺癌組織標(biāo)本及其配對(duì)的癌旁組織和肺良性病變肺組織在組織勻漿器研碎后，利用Trizol提取RNA的方法分別提取3種組織標(biāo)本的總RNA，利用酶標(biāo)儀(Beckman公司生產(chǎn))測(cè)定其水平。將總RNA按反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京全式金生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn))說(shuō)明書反轉(zhuǎn)為 cDNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：30 ℃ 20 min，35 ℃ 30 min，75 ℃ 10 min。使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物。正向引物序列為5′-UAGUAGACCGUAUAGCGUACG-3′，反向引物序列為5′-GAACTGCGTGGAGCTCCACCTT-3′，內(nèi)參為U6序列。利用熒光定量PCR儀(杭州晶格科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn))，設(shè)置擴(kuò)增條件:95 ℃ 30 s、85 ℃ 35 s、75 ℃ 20 s,40個(gè)循環(huán)，分析各樣品的循環(huán)閾值(Ct值)；其余步驟按試劑盒說(shuō)明書[miRcute 增強(qiáng)型miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)]進(jìn)行操作。采用2-ΔΔCt方法計(jì)算miR-411的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3免疫印跡技術(shù)檢測(cè)ECT2表達(dá)量 分別取非小細(xì)胞肺癌組織及其配對(duì)的癌旁組織和肺良性病變組織在勻漿器研碎，利用蛋白提取試劑盒(Solarbio)提取各個(gè)組織的總蛋白，并將總蛋白溶于SDS凝膠加樣緩沖液，4 ℃，13 000×g離心15 min，取上清液作為上樣樣品，同時(shí)以β-actin作為內(nèi)參樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。電泳結(jié)束后，取出凝膠并用轉(zhuǎn)膜緩沖液平衡3次。通過(guò)轉(zhuǎn)膜儀將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到NC膜上，轉(zhuǎn)染完成后將NC膜放入膜染色液中50 s后，在50%甲醇中脫色，然后用雙蒸水洗，保存，與顯色結(jié)果作對(duì)比。被轉(zhuǎn)印到膜上的靶抗原與抗體反應(yīng)、與酶標(biāo)第二抗體反應(yīng)，用酶相應(yīng)的蛋白信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，具體步驟按照說(shuō)明書進(jìn)行操作。然后分析ECT2在各肺組織中的表達(dá)量。

1.2.4CTC測(cè)定 分別采集非小細(xì)胞肺癌患者和肺良性病變患者的外周血 10 mL，將其置于專門的CTC采集管中，并進(jìn)行標(biāo)記。將 7.5 mL血液標(biāo)本加入 Cell Tracks Auto Prep 錐形管當(dāng)中，繼續(xù)加入 6.5 mL 稀釋的1×hCTC緩沖液，均勻搖晃后進(jìn)行離心操作。CTC檢測(cè)試劑盒購(gòu)自賽特公司，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)CTC。

2 結(jié) 果

2.1miR-411、ECT2在不同肺組織中表達(dá)水平的比較 非小細(xì)胞肺癌組織miR-411、ECT2表達(dá)水平均高于癌旁組織、肺良性病變肺組織(P<0.05)。癌旁組織miR-411、ECT2表達(dá)水平均低于肺良性病變肺組織(P<0.05)。見表1。

表1 miR-411、ECT2在不同肺組織中表達(dá)水平的比較

2.2CTC在非小細(xì)胞肺癌患者和肺良性病變患者血液中的數(shù)量 53例非小細(xì)胞肺癌患者每7.5 mL血液CTC數(shù)量為(7.90±0.64)個(gè)，明顯高于肺良性病變患者的(1.00±0.73)個(gè),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3CTC及肺組織miR-411、ECT2水平在不同臨床病理特征的非小細(xì)胞肺癌患者中的差異 不同性別、年齡(≤50、>50歲)、腫瘤最大徑(≤2 cm、>2 cm)的非小細(xì)胞肺癌患者CTC數(shù)量及肺癌組織miR-411、ECT2表達(dá)水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。臨床分期Ⅲ期的非小細(xì)胞肺癌患者CTC數(shù)量及肺癌組織miR-411、ECT2表達(dá)水平均高于臨床分期Ⅰ～Ⅱ期的患者(P<0.05)；低分化非小細(xì)胞肺癌患者CTC數(shù)量及肺癌組織miR-411、ECT2表達(dá)水平均低于高分化患者(P<0.05)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的非小細(xì)胞肺癌患者CTC數(shù)量及肺癌組織miR-411、ECT2表達(dá)水平均高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的非小細(xì)胞肺癌患者(P<0.05)。見表2。

2.4miR-411、ECT2、CTC對(duì)非小細(xì)胞肺癌的診斷價(jià)值 ROC曲線分析顯示，CTC、ECT2、miR-411單項(xiàng)及聯(lián)合檢測(cè)診斷非小細(xì)胞肺癌的曲線下面積(AUC)分別為0.542、0.531、0.589、0.748。見表3。

表2 miR-411、ECT2及CTC在不同臨床病理特征的非小細(xì)胞肺癌患者中的表達(dá)

續(xù)表2 miR-411、ECT2及CTC在不同臨床病理特征的非小細(xì)胞肺癌患者中的表達(dá)

表3 miR-411、ECT2、CTC診斷非小細(xì)胞肺癌的效能分析

2.5非小細(xì)胞肺癌患者CTC與肺癌組織miR-411、ECT2水平的相關(guān)性分析 結(jié)果顯示，CTC與肺癌組織ECT2水平呈正相關(guān)(r=0.773，P=0.001)；肺癌組織miR-411與ECT2水平呈正相關(guān)(r=0.779，P=0.001)；CTC與肺癌組織miR-411水平呈正相關(guān)(r=0.667，P=0.001)。

3 討 論

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一,已成為我國(guó)城市人口惡性腫瘤死亡原因的第1位[10]。引起非小細(xì)胞肺癌的主要因素有吸煙(最重要的高危因素)、職業(yè)環(huán)境(長(zhǎng)期處在工業(yè)廢氣中易引起)、電離輻射、既往肺部慢性感染(如肺結(jié)核、支氣管擴(kuò)張，但是較為少見)、遺傳因素(家族聚集、遺傳易感性以及免疫功能降低，代謝、內(nèi)分泌失調(diào)等均有可能)、大氣污染(石油、煤、內(nèi)燃機(jī)等燃燒產(chǎn)生的有毒物質(zhì))[11]。非小細(xì)胞肺癌是肺癌的主要類型，按照組織病理學(xué)分型主要為腺癌和鱗癌，但是患者在確診的時(shí)候大多已經(jīng)是晚期，失去了手術(shù)的最佳時(shí)期[12]。

CTC是從腫瘤組織中脫離出來(lái)的腫瘤細(xì)胞，通過(guò)血管內(nèi)壁進(jìn)入血液循環(huán)，進(jìn)行遠(yuǎn)處播散和轉(zhuǎn)移[13]。近年的多項(xiàng)研究表明，干細(xì)胞特性的CTC具有上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的能力，是肝癌、乳腺癌、結(jié)直腸、肺癌等惡性腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的主要始動(dòng)因素，在臨床分期中具有潛在應(yīng)用價(jià)值，可預(yù)測(cè)多種實(shí)體瘤的預(yù)后[14-15]。本研究顯示，非小細(xì)胞肺癌患者CTC數(shù)量明顯高于肺良性病變患者。非小細(xì)胞肺癌患者CTC數(shù)量與患者的臨床分期、分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)。臨床分期高、分化程度低的非小細(xì)胞肺癌患者CTC數(shù)量高于臨床分期低、分化程度高的患者，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的非小細(xì)胞肺癌患者CTC數(shù)量高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，CTC診斷非小細(xì)胞肺癌的AUC為0.589，可以作為診斷非小細(xì)胞肺癌的指標(biāo)。

ECT2蛋白C端含有2個(gè)結(jié)構(gòu)域，即具有催化活性的DH結(jié)構(gòu)域和行使功能的PH結(jié)構(gòu)域[16]。研究表明，ECT2是一種鳥嘌呤核苷酸解離交換因子(RhoGEF)，能促進(jìn)結(jié)合狀態(tài)的GDP解離以及GTP對(duì)CDP的替換，從而激活細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的Ras相似物CTP酶，影響惡性轉(zhuǎn)型以及腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移等方面[17-18]。本研究結(jié)果顯示，非小細(xì)胞肺癌患者肺癌組織中ECT2水平高于其配對(duì)的癌旁組織和肺良性病變肺組織中的ECT2水平。ECT2水平與非小細(xì)胞肺癌患者臨床分期有關(guān)，臨床分期高的患者ECT2水平高于臨床分期低的患者。同樣，ECT2在非小細(xì)胞肺癌組織中的水平在不同分化程度、淋巴是否轉(zhuǎn)移的非小細(xì)胞肺癌患者中有差異。分化程度低、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的非小細(xì)胞肺癌患者肺癌組織 ECT2表達(dá)水平高于分化程度高、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者。

miRNA在細(xì)胞發(fā)育、分化、增殖和凋亡起著重要作用，miRNA可作為腫瘤抑癌基因，亦可作為腫瘤啟動(dòng)子[19]。本研究結(jié)果顯示，非小細(xì)胞肺癌組織中miR-411水平高于其配對(duì)癌旁組織和肺良性病變肺組織，在不同臨床分期、不同分化程度、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的非小細(xì)胞肺癌患者中存在差異。ROC曲線分析顯示，miR-411 可用于非小細(xì)胞肺癌的診斷。miR-411參與了非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，可以作為臨床血清腫瘤標(biāo)志物[20]。

綜上所述，miR-411、ECT2在非小細(xì)胞肺癌組織中的水平均高于其配對(duì)癌旁組織和肺良性病變肺組織，非小細(xì)胞肺癌患者CTC數(shù)量明顯高于肺良性病變患者，CTC及非小細(xì)胞肺癌組織中miR-411、ECT2水平在不同臨床分期、不同分化程度、是否淋巴轉(zhuǎn)移的患者中有差異，本研究為臨床非小細(xì)胞肺癌早期診斷提供臨床依據(jù)。但是本研究樣本量較少，還需進(jìn)一步研究。