魏旭升，李小芳，黃 彪，王友華，陳先理

重慶市大足區(qū)人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，重慶 402360

膿毒癥大多因嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷、外科大手術(shù)、感染等因素所致，每年患病率以1.5%～8.0%速度增長(zhǎng)，病死率為30%～70%[1]。急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)是膿毒癥的一種常見(jiàn)并發(fā)癥，其發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，受損部位主要為肺實(shí)質(zhì)，急性發(fā)作表現(xiàn)包括雙肺炎癥、低氧血癥，隨著病情進(jìn)展可引起多臟器功能衰竭[2]。研究表明膿毒癥并發(fā)ARDS患者的病死率為50%～90%，預(yù)后非常差[3]。目前，我國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)取得了較大進(jìn)展，針對(duì)該病治療也提出了一些干預(yù)措施，雖然對(duì)控制病情有一定作用，但病死率仍居高不下[4]。因此，臨床需尋求新的治療靶點(diǎn)，為改善該病預(yù)后提供依據(jù)。近年來(lái)，有學(xué)者指出微小核糖核酸(microRNA，miR)在多種生物功能中均發(fā)揮了作用，與機(jī)體生理、病理改變有關(guān)，可能通過(guò)對(duì)膿毒癥發(fā)病信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)控，參與該病進(jìn)展[5]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-146b參與了多臟器損傷過(guò)程，例如肺、肝、腎等，但作用機(jī)制不明[6]。而膿毒癥并發(fā)ARDS可引起多臟器損傷，但現(xiàn)階段臨床尚未明確miR-146b與膿毒癥并發(fā)ARDS之間的關(guān)系，基于此，本研究旨在分析miR-146b對(duì)膿毒癥并發(fā)ARDS的預(yù)測(cè)價(jià)值及與預(yù)后的關(guān)系，為該病治療尋求新靶點(diǎn)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院2016年9月至2020年9月收治的膿毒癥患者272例作為膿毒癥組，納入同期于本院體檢的健康志愿者92例作為對(duì)照組。根據(jù)膿毒癥組是否發(fā)生ARDS分成ARDS組、非ARDS組。膿毒癥根據(jù)膿毒癥3.0標(biāo)準(zhǔn)[7]進(jìn)行診斷：(1)明確診斷為感染或疑似感染，同時(shí)序貫器官功能衰竭(SOFA)評(píng)分≥2分；(2)快速序貫器官功能衰竭(qSOFA)評(píng)分包括收縮壓低于100 mm Hg、呼吸頻率高于22次/分、意識(shí)改變3項(xiàng)內(nèi)容，滿足其中2項(xiàng)。ARDS診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]：(1)已明確臨床發(fā)病，或有新發(fā)呼吸癥狀，或加重7 d內(nèi)；(2)經(jīng)CT或X線片提示雙側(cè)肺透光度減低，無(wú)法通過(guò)腫瘤、肺不張、肺結(jié)節(jié)、胸腔積液等原因解釋?zhuān)?3)呼吸衰竭無(wú)法通過(guò)體液超負(fù)荷、心力衰竭等原因解釋?zhuān)魺o(wú)危險(xiǎn)因素，則經(jīng)超聲心動(dòng)圖將高靜水壓性肺水腫排除；(4)氧合指數(shù)低于300 mm Hg。膿毒癥組納入標(biāo)準(zhǔn)：滿足膿毒癥3.0標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于該病的診斷標(biāo)準(zhǔn)；入院后立即行血清miR-146b檢測(cè)；年齡≥18歲；入院前3個(gè)月內(nèi)無(wú)免疫抑制劑、激素等治療史。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：同期體檢的志愿者，身體健康狀況良好；在體檢當(dāng)日接受血清miR-146b檢測(cè)；年齡≥18歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：診斷前有心肺復(fù)蘇術(shù)、器官移植術(shù)史；合并肝硬化；患艾滋病、乙型肝炎等傳染性疾病；病史不詳；妊娠、哺乳期女性；既往有其他影響肺透光度的病史，如慢性阻塞性肺疾病。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象或其家屬自愿簽署知情同意書(shū)。兩組基線資料比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 兩組基線資料比較

1.2主要儀器與試劑 主要儀器：高速離心機(jī)(山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司生產(chǎn)，TGL-16M)、微量移液器(賽默飛世爾科技公司生產(chǎn)，賽默飛F3系列)、離心管(賽默飛世爾科技公司生產(chǎn)，509-GRD-Q)、熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)儀(杭州博日科技有限公司生產(chǎn)，F(xiàn)QD-48A)。主要試劑：蒸餾水、異丙醇、無(wú)水乙醇均由江蘇納科科技有限公司提供；miRNA檢測(cè)試劑、Trizol試劑、引物由賽默飛世爾科技公司提供。

1.3方法 兩組受試者均采集3 mL空腹靜脈血，3 000 r/min離心10 min，離心半徑8 cm，分離血清，存至-70 ℃環(huán)境待檢。利用實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)血清miR-146b，具體操作如下。(1)提取總RNA：取出血清后常規(guī)復(fù)溫，取400 μL血清放入無(wú)菌離心管(經(jīng)RNA酶滅活)，加入400 μL裂解液，混勻，在室溫下反應(yīng)5 min；在4 ℃環(huán)境下12 000 r/min離心10 min，取上清液于新離心管內(nèi)；加入400 μL氯仿，混勻30 s，在室溫下反應(yīng)5 min；在4 ℃下12 000 r/min離心15 min，取無(wú)色水相于無(wú)菌離心管內(nèi)，液體體積約600 μL；取無(wú)水乙醇200 μL加入，混勻，可見(jiàn)少量沉淀物，將沉淀物與液體移至吸附柱miRspin，室溫下反應(yīng)5 min，待吸附柱完全吸附混合液，在4 ℃環(huán)境下12 000 r/min離心30 s，棄吸附柱，留取流出液；取300 μL流出液備用，加無(wú)水乙醇200 μL，混勻，將混合液移至吸附柱內(nèi)，室溫下反應(yīng)2 min，使吸附柱完全吸附溶液，4 ℃下12 000 r/min離心30 s，棄流出液，此時(shí)miRNA留置于吸附柱內(nèi)。加入500 μL蛋白液，室溫下反應(yīng)2 min，在4 ℃下12 000 r/min離心30 s，取600 mL漂洗液加入，室溫下反應(yīng)2 min，在4 ℃下12 000 r/min離心30 s，棄流出液，重復(fù)上述操作，將miRNA以外的物質(zhì)洗脫。將裝有混合液的吸附柱置于新無(wú)菌離心管內(nèi)，在4 ℃下12 000 r/min離心1 min，棄流出液；再次將吸附柱轉(zhuǎn)入新無(wú)菌離心管內(nèi)，加入30 μL RNase-Free ddH2O，室溫下反應(yīng)2 min，在4 ℃下12 000 r/min離心2 min，留取流出液，即獲得總RNA，檢測(cè)RNA濃度、純度。(2)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性20 s，60 ℃退火、延伸34 s，45個(gè)循環(huán)。引物序列：miR-146b上游引物序列為5′-ACACTCCAGCTGGGTGAGAACTGAATTCCA-3′，下游引物序列為5′-TGTCGTGGAGTCGGCAATTC-3′；內(nèi)參引物U6上游引物序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATA CTA-3′，下游引物序列為5′-ACGAATTTGCGTGTCATCCTTGC-3′。經(jīng)2-ΔΔCt計(jì)算血清miR-146b相對(duì)表達(dá)水平。

1.4觀察指標(biāo) 比較各組血清miR-146b水平；收集ARDS組、非ARDS組其他資料,包括性別、年齡,是否合并高血壓、糖尿病,是否有吸煙史、飲酒史、泌尿系統(tǒng)感染、肺部感染、胰腺炎合并胰周感染、腹腔感染、感染性休克，以及SOFA評(píng)分[以均值(四舍五入)作為截?cái)嘀?，將患者分?6分組和≥6分組]、氧合指數(shù)(200～300 mm Hg為輕度，100～<200 mm Hg為中度，<100 mm Hg為重度[8])、miR-146b(水平是否大于均值)的情況，分析膿毒癥患者發(fā)生ARDS的危險(xiǎn)因素。

2 結(jié) 果

2.1膿毒癥組、對(duì)照組及ARDS組、非ARDS組血清miR-146b水平比較 膿毒癥組血清miR-146b水平為0.90±0.35，低于對(duì)照組的1.62±0.53，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=14.818，P<0.001)。在272例膿毒癥患者中，有82例(30.15%)發(fā)生ARDS，190例(69.85%)未發(fā)生ARDS，分別納入ARDS組、非ARDS組。ARDS組血清miR-146b水平為0.78±0.23，低于非ARDS組的0.95±0.30，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.581，P<0.001)。

2.2膿毒癥患者發(fā)生ARDS的單因素分析 單因素分析結(jié)果提示，ARDS組肺部感染、胰腺炎并胰周感染、SOFA評(píng)分≥6分、氧合指數(shù)<100 mm Hg、感染性休克、miR-146b<0.90的比例均高于非ARDS組(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 膿毒癥患者發(fā)生ARDS的單因素分析[ n(%)]

續(xù)表2 膿毒癥患者發(fā)生ARDS的單因素分析[ n(%)]

2.3膿毒癥患者發(fā)生ARDS的危險(xiǎn)因素多元回歸分析 經(jīng)Logistic多元回歸模型對(duì)相關(guān)變量行量化賦值，以表3中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量為自變量X，以是否發(fā)生ARDS為因變量Y(否=0，是=1)，結(jié)果提示肺部感染、胰腺炎合并胰周感染、SOFA評(píng)分≥6分、感染性休克是膿毒癥患者發(fā)生ARDS的危險(xiǎn)因素(P<0.05)，而氧合指數(shù)為200～300 mm Hg、血清miR-146b水平≥0.90是膿毒癥患者發(fā)生ARDS的保護(hù)因素(P<0.05),見(jiàn)表3。

表3 膿毒癥患者發(fā)生ARDS的危險(xiǎn)因素多元回歸分析

2.4血清miR-146b對(duì)膿毒癥并發(fā)ARDS風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估價(jià)值 血清miR-146b評(píng)估膿毒癥并發(fā)ARDS風(fēng)險(xiǎn)的AUC為0.793(95%CI：0.733～0.853，P<0.001，標(biāo)準(zhǔn)誤：0.030)，最佳臨界值為0.840，靈敏度為83.70%，特異度為70.00%。見(jiàn)圖1。

圖1 血清miR-146b評(píng)估膿毒癥并發(fā)ARDS風(fēng)險(xiǎn)的ROC曲線

2.5血清miR-146b與膿毒癥并發(fā)ARDS患者預(yù)后的關(guān)系分析 膿毒癥并發(fā)ARDS患者血清miR-146b水平為0.78±0.23，以均值為界分成高水平組(miR-146b水平≥0.78,n=44)、低水平組(miR-146b水平<0.78，n=38)。高水平組2周內(nèi)病死率為9.09%(4/44)，生存率為90.91%(40/44)。低水平組2周內(nèi)病死率為42.11%(16/38)，生存率為57.89%(22/38)。2周內(nèi)，miR-146b高水平組的生存率高于miR-146b低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log-rankχ2=12.051，P=0.001)，見(jiàn)圖2。

圖2 不同血清miR-146b表達(dá)患者的生存函數(shù)圖

3 討 論

膿毒癥是比較常見(jiàn)的急危重癥，治療難度非常大，病死率高，ARDS是膿毒癥的一種嚴(yán)重并發(fā)癥，它可增加膿毒性患者感染性休克的發(fā)生率與病死率。ARDS的發(fā)病機(jī)制可能如下：(1)機(jī)體發(fā)生感染后，可導(dǎo)致中性粒細(xì)胞在肺部大量聚集，促進(jìn)炎癥介質(zhì)釋放，致肺損傷加重，一旦炎癥、毒素侵害肺泡巨噬細(xì)胞，則會(huì)進(jìn)一步釋放氧自由基，加重炎癥，從而誘發(fā)ARDS；(2)機(jī)體發(fā)生感染后，大量白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子等釋放，對(duì)炎性反應(yīng)有誘導(dǎo)作用，導(dǎo)致抗炎、促炎介質(zhì)處于失衡狀態(tài)，炎癥細(xì)胞的激活過(guò)度能誘發(fā)全身炎性反應(yīng)，參與ARDS的發(fā)生過(guò)程[9]。膿毒癥所致的ARDS已成為重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)病死率增加的重要因素，既往大多給予機(jī)械通氣、控制感染、維護(hù)臟器功能等干預(yù)，但病死率未得到良好控制，因此，臨床需積極尋求新的治療靶點(diǎn)，探索新的治療思路。研究表明miR-146b在臟器功能損害過(guò)程中可能發(fā)揮了一定作用，其可能通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)的信號(hào)通路，參與臟器病變進(jìn)展過(guò)程[10]。因此，本研究考慮分析miR-146b在膿毒癥并發(fā)ARDS中的作用機(jī)制，更深入了解該病的潛在機(jī)制，以便改善預(yù)后。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者的血清miR-146b水平低于健康者，且ARDS患者的血清miR-146b水平低于非ARDS患者。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在激活、上調(diào)人單核細(xì)胞后，miR-146b水平會(huì)迅速增高，且能靶向作用于腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF6)，負(fù)反饋調(diào)節(jié)炎癥通路，具有抑炎作用[11]。膿毒癥及ARDS的發(fā)生過(guò)程則均有炎癥介質(zhì)參與，例如彭婷婷等[12]指出膿毒癥的發(fā)生及嚴(yán)重程度與炎癥因子水平有關(guān)，王川江等[13]則認(rèn)為ARDS患者可能存在失控性炎癥。在本研究中，膿毒癥及膿毒癥并發(fā)ARDS患者的血清miR-146b水平相對(duì)較低，這可能是因?yàn)榛颊邫C(jī)體存在炎性反應(yīng)所致，血清miR-146b水平下調(diào)提示抗炎作用削弱，導(dǎo)致病情進(jìn)展。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提示，miR-146b-3p上調(diào)能對(duì)磷脂酰肌醇3激酶/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶信號(hào)通路介導(dǎo)的炎癥進(jìn)行抑制，從而改善膿毒癥小鼠的ARDS癥狀，這也表明miR-146b水平與膿毒癥并發(fā)ARDS有關(guān)[14]。

本研究結(jié)果顯示，膿毒癥患者發(fā)生ARDS可能與肺部感染、胰腺炎并胰周感染、SOFA評(píng)分、感染性休克、氧合指數(shù)有關(guān)，這些均為常見(jiàn)因素，與既往研究[15]結(jié)果一致。此外，本研究證實(shí)膿毒癥患者發(fā)生ARDS還與miR-146b水平有關(guān)，且血清miR-146b水平對(duì)ARDS的發(fā)生存在預(yù)測(cè)價(jià)值。miR-146b可能通過(guò)負(fù)性調(diào)節(jié)炎癥通路參與ARDS的發(fā)生，其水平越高，則對(duì)機(jī)體炎癥的抑制作用越好，而水平越低則會(huì)加重炎癥，增加發(fā)生ARDS的風(fēng)險(xiǎn)。本研究證實(shí)血清miR-146b與膿毒癥并發(fā)ARDS患者預(yù)后相關(guān)，其水平≥0.90的患者生存率更高。李林成等[16]發(fā)現(xiàn)，miR-146b轉(zhuǎn)染之后能提升膿毒癥小鼠的miR-146b水平，抑制炎癥介質(zhì)生成，使臟器受損程度減輕，表明miR-146b對(duì)臟器功能有保護(hù)作用，也更加論證了本研究結(jié)論的可靠性。在以后的膿毒癥并發(fā)ARDS治療中，miR-146b有望成為新的治療靶點(diǎn)。

綜上所述，miR-146b在膿毒癥并發(fā)ARDS患者血清中的表達(dá)明顯下降，其對(duì)膿毒癥患者并發(fā)ARDS的風(fēng)險(xiǎn)及預(yù)后均有一定評(píng)估價(jià)值。本研究局限性為收集的影響ARDS發(fā)生的單因素較少，且膿毒癥并發(fā)ARDS的病例數(shù)偏少，未來(lái)還需進(jìn)一步完善臨床資料的收集，并擴(kuò)大樣本量進(jìn)行深入探討。