李書迪， 齊和日瑪， 于景華， 郭慧卿， 王鑫晶， 成日青*

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059)

隨著人們生活習(xí)慣及飲食結(jié)構(gòu)的改變，心血管疾病在我國的發(fā)病率及死亡率逐年上升。據(jù)《中國心血管病報告2018》統(tǒng)計，我國心血管疾病死亡率居城鄉(xiāng)居民死亡原因首位，占死亡構(gòu)成的40%以上，已成為當今社會人群健康所面臨的重要公共衛(wèi)生問題[1]。

七味廣棗散為臨床常用的蒙古族驗方，由廣棗、丁香、肉豆蔻、沉香、木香、楓香脂、牦牛心7味藥材組成，具有養(yǎng)心益氣，安神之功效，用于防治胸悶疼痛、心悸氣短、心神不安、失眠健忘等癥。方中丁香、沉香、肉豆蔻、木香、楓香脂均富含揮發(fā)油成分，易透過血腦屏障，具有藥理活性豐富、起效靶點多、不良反應(yīng)較少等特點[2]，該類成分除了具有抗炎、抑菌、抗病毒活性外，還具有保護血管內(nèi)皮、抗氧化、改善心肌功能、調(diào)節(jié)心血管活性等多種對心血管有益的作用[3-7]。蒙醫(yī)藥在防治心血管疾病方面具有一定特色優(yōu)勢，有多種臨床常用、效果顯著的傳統(tǒng)方劑，如三味檀香散、肉豆蔻五味丸、阿敏·額爾敦、八味沉香散等，其組成均含揮發(fā)性藥味，如肉豆蔻、沉香、木香、丁香等，表明在抗心血管疾病類蒙藥處方中揮發(fā)油可能是一類重要的有效成分，但目前相關(guān)研究較少。因此，本研究通過GC-MS對七味廣棗散揮發(fā)油進行成分分析，并借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出防治心血管疾病的主要活性成分、關(guān)鍵靶點及潛在信號通路，從系統(tǒng)生物學(xué)角度探討其可能的作用機制。

1 材料

1.1 儀器 Trace DSQⅡ GC-MS儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；ZTB-A磁力加熱攪拌電熱套(山東鄄城華魯電熱儀器有限公司)；800Y型多功能粉碎機(永康市鉑歐五金制品有限公司)；10 mL揮發(fā)油提取器(安徽省天長市東亞玻璃儀器廠)。

1.2 藥材與試劑 廣棗(產(chǎn)地廣東，批號C17082902)、丁香(產(chǎn)地廣西，批號193090101)、木香(產(chǎn)地云南，批號1811001)、沉香(產(chǎn)地海南，批號181411001)、肉豆蔻(產(chǎn)地廣西，批號190920201)、牦牛心(產(chǎn)地西藏，批號170701)、楓香脂(產(chǎn)地福建，批號1811010589)均購自內(nèi)蒙古天康蒙中醫(yī)藥有限責任公司，經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)渠弼教授鑒定為正品。乙酸乙酯為分析純；水為超純水。

2 方法

2.1 揮發(fā)油提取 參照2015年版《中國藥典》四部通則中“2204揮發(fā)油測定法”項下“甲法”操作，稱取七味廣棗散120 g，加5倍量水回流提取6 h，得黃色澄明液體，即為揮發(fā)油。

2.2 GC-MS分析

2.2.1 GC條件 TR-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；程序升溫(初始溫度50 ℃，保持1 min，以5 ℃/min升溫至280 ℃，保持3 min)；進樣口溫度250 ℃；檢測器FID，溫度240 ℃；載氣氮氣，純度99.99%，體積流量1.0 mL/min；分流比50∶1；氫氣體積流量20 mL/min；空氣體積流量400 mL/min；進樣量2 μL。

2.2.2 MS條件 EI電離；離子源溫度250 ℃；接口溫度250 ℃；電子轟擊能量70 eV；溶劑延遲3 min；掃描范圍m/z50～650。

2.2.3 揮發(fā)油成分分析 取“2.1”項下?lián)]發(fā)油適量，乙酸乙酯溶解后在“2.2”項條件下進樣測定，質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)NIST 2.0質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索匹配后再與文獻[8-11]報道比對，確定各化學(xué)成分。

2.3 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

2.3.1 成分數(shù)據(jù)收集 以“2.2.3”項下鑒定出的成分為研究對象，在Pubchem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中以成分的CAS號為檢索詞，得到其分子結(jié)構(gòu)，并保存為Canonical SMILES格式。

2.3.2 成分靶點獲取 將“2.3.1”項下SMILES格式文件導(dǎo)入SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)、SuperPred 數(shù)據(jù)庫(http://prediction.charite.de/)中，選定研究物種為“Homosapiens”，得到成分的對應(yīng)靶點，保存數(shù)據(jù)，整合、去重后得到化合物的潛在作用靶點。

2.3.3 疾病靶點獲取 使用DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(https://www.disgenet.org/)，以心血管相關(guān)疾病為關(guān)鍵詞進行檢索，獲得作用靶點，將其導(dǎo)入Excel表格中，整合、去重后得到疾病的潛在作用靶點。

2.3.4 潛在作用靶點獲取 將化合物、疾病的靶點錄入Venny 2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)在線作圖工具平臺上，繪制韋恩圖，得到兩者交集(即共同靶標)，作為潛在作用靶點。

2.3.5 網(wǎng)絡(luò)模型構(gòu)建及分析 將“2.3.4”項下潛在作用靶點及其對應(yīng)成分分別導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0軟件，構(gòu)建“化學(xué)成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)，使用 Network Analyzer功能對網(wǎng)絡(luò)進行分析，根據(jù)節(jié)點Degree、Betweenness、Closeness篩選出七味廣棗散揮發(fā)油防治心血管疾病的主要活性成分。

2.3.6 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 將“2.3.4”項下篩選得到的交集靶點輸入STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)中，構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)模型，選擇物種為“Homosapiens”，設(shè)定最低相互作用閥值為“Highest confidence(0.9)”，其余參數(shù)保持默認設(shè)置，獲得蛋白相互作用信息，保留文件中的節(jié)點信息(node1、node2)并將其導(dǎo)入 Cytoscape 3.6.0軟件，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)并進行拓撲指標分析，篩選出關(guān)鍵靶點。

2.3.7 富集分析 將篩選得到的關(guān)鍵靶點輸入DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)中，進行GO富集分析(包括生物過程、細胞組分、分子功能)和KEGG信號通路分析。

2.3.8 分子對接 通過PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/)下載靶蛋白的3D結(jié)構(gòu)并保存為PDB格式，通過Pubchem數(shù)據(jù)庫下載成分的3D結(jié)構(gòu)并保存為SDF格式，將準備好的靶蛋白和化合物分子結(jié)構(gòu)導(dǎo)入Discovery Studio軟件，進行分子結(jié)構(gòu)常規(guī)預(yù)處理，再選擇Libdock模塊進行分子對接，分析其結(jié)合活性。

3 結(jié)果

3.1 揮發(fā)油成分鑒定 揮發(fā)油總離子流圖見圖1，通過質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索及文獻比對，共鑒定出35種成分，其中丁香酚含量最高，占總量的42.83%，其次是肉豆蔻醚，占總量的7.06%，見表1。

圖1 揮發(fā)油GC-MS總離子流圖

3.2 潛在靶點收集 將 Swiss、SuperPred數(shù)據(jù)庫中得到的預(yù)測靶點去重后，共得到成分靶點341個，通過DisGeNET數(shù)據(jù)庫得到疾病靶點2 943個，在Venny 2.1.0在線作圖工具平臺上輸入成分、疾病的靶點，繪制韋恩圖(圖2)，兩者取交集后得共同靶點188個。

圖2 成分、疾病靶點的韋恩圖

3.3 化學(xué)成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 將化學(xué)成分及188個潛在作用靶點導(dǎo)入Cytoscape軟件，繪制網(wǎng)絡(luò)圖(圖3)，并通過Network Analyzer 對網(wǎng)絡(luò)圖進行分析。結(jié)果顯示，丁香酚、黃樟醚、桉葉素、α-細辛醚、異丁香酚、α-松油醇、甲基丁香酚、杜松醇、肉豆蔻醚均能與25個以上靶點相連接，可能在防治心血管疾病過程中發(fā)揮重要作用，同時3-側(cè)柏烯、桉葉素、3-蒈烯、檀香醇、黃樟醚、杜松醇、丁香酚、甲基丁香酚、α-松油醇、苯甲醛又可共同作用于靶點ACHE，體現(xiàn)了揮發(fā)油多成分、多靶點的綜合調(diào)節(jié)特點。

表1 揮發(fā)油成分分析結(jié)果

圖3 化學(xué)成分-作用靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

3.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 在STRING數(shù)據(jù)庫中錄入188個潛在作用靶點，得到蛋白相互作用信息，使用Cytoscape軟件對上述數(shù)據(jù)進行可視化分析，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，并對網(wǎng)絡(luò)進行篩選，計算度值(Degree)、中介中心性(Betweeness)、接近中心性(Closeness)的中位數(shù)，以高于3者為標準，篩選出47個關(guān)鍵靶點，見表2，其中度值最高的為APP，能與35個蛋白發(fā)生相互作用，其次是PIK3CA、MAPK1、STAT3、SRC，分別能與29、28、27、27個蛋白發(fā)生相互作用。PPI網(wǎng)絡(luò)圖見圖4，節(jié)點越大，顏色越深，靶點度值越高；顏色越淺，節(jié)點越小，代表度值越低。

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

表2 關(guān)鍵靶點信息

3.5 靶點通路分析 將47個關(guān)鍵靶點通過DAVID數(shù)據(jù)庫進行GO功能富集分析，得到139個條目(P<0.001)，包括91個生物學(xué)過程(排名前20條目繪制柱狀圖，圖5A)、14個細胞組分(圖5B)、34個分子功能(排名前20條目繪制柱狀圖，圖5C)，提示生物過程(BP)顯著富集在RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、血小板活化、NO生物合成、凋亡過程的調(diào)控、細胞增殖的調(diào)控等；細胞組分(CC)主要涉及核染色質(zhì)、核漿等；分子功能(MF)主要集中在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、酶結(jié)合、激酶活性、蛋白質(zhì)磷酸酶結(jié)合等。

圖5 GO功能富集分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫對交集靶點進行KEGG通路分析，以P<0.001為條件，共篩選出67條信號通路，應(yīng)用Omicshare (http://www.omicshare.com/) 對前20條通路富集分析結(jié)果作氣泡圖，結(jié)果見圖6。由此可知，靶點數(shù)排名靠前的為胰腺癌通路(pancreatic cancer)、甲狀腺激素信號通路(thyroid hormone signaling pathway)、HIF-1信號通路(HIF-1 signaling pathway)、催乳素信號通路(prolactin signaling pathway)、乙型肝炎(hepatitis B)、前列腺癌(prostate cancer)、非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer)、VEGF信號通路(VEGF signaling pathway)、FoxO信號通路(FoxO signaling pathway)、cAMP信號通路(cAMP signaling pathway)等，表明揮發(fā)油可通過作用于不同的通路來防治心血管疾病。

圖6 KEGG通路富集分析

3.6 分子對接驗證 選擇PPI網(wǎng)絡(luò)中度值排名前五的關(guān)鍵靶點與其對應(yīng)的活性成分進行分子對接，結(jié)果見表3，得分越高，分子與受體結(jié)合越好。由此可知，APP與α-細辛醚、異丁香酚結(jié)合的可能性相對較高，PIK3CA與甲基丁香酚，SRC與丁香酚、異丁香酚的結(jié)合效果也相對較好。APP與α-細辛醚、SRC與丁香酚的分子對接模式見圖7。

表3 分子對接結(jié)果

圖7 APP與α-細辛醚、SRC與丁香酚分子對接模式圖(A、B)和細節(jié)2D展示圖(a、b)

4 討論

本研究通過對“化學(xué)成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)進行拓撲學(xué)分析，篩選出9種關(guān)鍵成分。其中，丁香酚在揮發(fā)油測定結(jié)果中峰面積占比最大，同時在拓撲學(xué)分析中Degree值最高?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，丁香酚除具有抑菌、抗炎、抗氧化、麻醉等藥理作用外，在心血管方面還表現(xiàn)出降壓、抗心律失常和保護心肌細胞等作用[12-13]。研究發(fā)現(xiàn)，丁香酚能提高Na2S2O4造成的缺氧/復(fù)氧損傷心肌細胞的存活率[14]，對H2O2誘導(dǎo)H9c2心肌細胞損傷也具有保護作用[15]。

通過Cytoscape對潛在作用靶點得到的蛋白互作信息進行拓撲學(xué)分析，篩選出關(guān)鍵靶點47個，靶點間通過769條相互作用協(xié)同影響疾病的防治。關(guān)鍵靶點和活性成分的對接結(jié)果顯示，除MAPK1與桉葉素、STAT3與異丁香酚結(jié)合效果不佳外，其余成分與靶點間均有較好的結(jié)合能力。

GO分析富集結(jié)果顯示，47個關(guān)鍵靶點主要分布在139個GO功能過程，其中包括91個生物過程，如轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)、血小板活化、NO生物合成、凋亡過程的調(diào)控、細胞增殖、細胞遷移等。這些生物過程貫穿于藥物治療疾病的整個作用機制中，表明七味廣棗散揮發(fā)油可通過調(diào)控多個生物學(xué)過程來發(fā)揮防治心血管疾病的作用。

KEGG富集結(jié)果表明，關(guān)鍵靶點主要富集于胰腺癌、甲狀腺激素、HIF-1等67條信號通路。其中，HIF-1信號通路、VEGF信號通路、cAMP信號通路在心血管疾病的防治過程中起重要作用。VEGF是目前所發(fā)現(xiàn)的唯一特異性地促進血管內(nèi)皮細胞有絲分裂的生長因子，具有促進血管新生和增加血管通透性等多種功能，通過降低或抑制VEGF的表達，可以減少血管新生，防治動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展[16]。心肌缺血及缺氧時，缺氧區(qū)域三磷酸腺苷(ATP)生成障礙，而在缺氧條件下缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)穩(wěn)定表達，可參與調(diào)控醛縮酶和丙酮酸激酶等改善能量代謝，調(diào)控缺氧適應(yīng)，也可誘導(dǎo)VEGF轉(zhuǎn)錄和表達從而促進血管新生，并影響炎癥發(fā)生等多種途徑[17-18]。cAMP是一種環(huán)狀核苷酸，可以使蛋白激酶A(PKA)激活，還使cAMP底物蛋白磷酸化，加速對鈣的攝取和轉(zhuǎn)運[19]，從而調(diào)節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)，心肌收縮，細胞命運和基因轉(zhuǎn)錄等。

綜上所述，本研究借助GC-MS技術(shù)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，初步探討了七味廣棗散揮發(fā)油防治心血管疾病的活性成分及可能作用機制，為后續(xù)進一步的實驗研究提供了思路及理論依據(jù)。