歐 芹， 張鵬霞， 范慧晗， 劉泰佐

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

社會人口老齡化的進(jìn)程促使對延緩衰老、提高老年人群生存質(zhì)量的研究不斷進(jìn)行。對衰老相關(guān)基因研究發(fā)現(xiàn)，Klotho基因突變導(dǎo)致多個(gè)早衰樣表型出現(xiàn)，包括短壽命、動脈硬化等；而過表達(dá)可對小鼠壽命有明顯的延長[1-2]。盡管Klotho的遺傳突變導(dǎo)致多種衰老相關(guān)疾病[3-5]，但相關(guān)的研究都明確地顯示Klotho基因只在小鼠、大鼠和人類的有限組織中表達(dá)。Klotho的表達(dá)可受許多因素的調(diào)節(jié)，表達(dá)后在維持細(xì)胞代謝平衡等方面發(fā)揮作用。山茱萸多糖(cornel polysaccharid，COP)可顯著提高小鼠抗氧化能力、免疫力、增強(qiáng)細(xì)胞活力、影響細(xì)胞周期調(diào)控因子作用；還可改善衰老腦組織老化程度以及抗休克的作用[5-6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，含山茱萸多糖血清可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期運(yùn)行，發(fā)揮抗人二倍體成纖維細(xì)胞衰老作用；水煎劑和山茱萸多糖均可通過抗氧化、提高衰老大鼠學(xué)習(xí)記憶能力[7]。本實(shí)驗(yàn)主要探究山茱萸多糖提高腦老化模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力是否與調(diào)節(jié)Klotho及其下游底物Akt、FoxO3a、Mn-SOD的表達(dá)有關(guān)，為腦老化的干預(yù)提供一個(gè)新的靶點(diǎn)和新的藥物。

1 材料與方法

1.1 動物 Wistar大鼠60只，清潔級，雌雄各半，體質(zhì)量220～240 g，購自佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號SCXK(黑)2013004。所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑與藥物 山茱萸多糖(寧波德康生物制品有限公司，批號20120110)，硫酸-苯酚法測定多糖含量為75.8%。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；Klotho抗體、Mn-SOD抗體(武漢博士德生物工程有限公司)；β-半乳糖苷酶活性試劑盒(上海潤裕生物科技有限公司)；D-半乳糖(上海澄紹生物科技公司)；Trizol、DEPC、RT-PCR試劑盒、DNA maker[寶生物工程 (大連) 有限公司]。

1.3 造模及分組 大鼠隨機(jī)分為2組，正常組10只，腦老化造模組50只，造模大鼠腹腔注射60 mg/kg 5%D-半乳糖氯化鈉溶液，連續(xù)6周，進(jìn)行Y迷宮篩查，檢測15次，較正常組正確次數(shù)下降15%～30%的大鼠為造模成功。將造模成功的48只腦老化模型大鼠隨機(jī)分為4組，即模型組及山茱萸多糖低、中、高劑量組。

1.4 給藥 從第7周起，山茱萸多糖低、中、高劑量組分別灌胃給予山茱萸多糖水溶液50、100、200 mg/kg，正常組和模型組灌胃給予等容量蒸餾水，連續(xù)6周。

1.5 樣本采集 最后1次給藥后，次日用Morris水迷宮檢測大鼠定位航行和空間探索能力，結(jié)束后，乙醚麻醉后斷頭處死，取腦組織并分離海馬，用于檢測Klotho、Mn-SOD、Akt、FoxO3a表達(dá)；剩余腦組織制備成10%勻漿液，用于檢測β-半乳糖苷酶活性。

1.6 Morris水迷宮法檢測大鼠學(xué)習(xí)記憶能力 參考文獻(xiàn)[8]報(bào)道，第1～5天，Morris水迷宮水下1 cm放置圓形平臺，從遠(yuǎn)離平臺象限處放下大鼠，記錄大鼠到達(dá)平臺時(shí)間，為逃避潛伏期。如果大鼠2 min沒有到達(dá)平臺，需放置于平臺30 s，系統(tǒng)自動跟蹤記錄大鼠活動軌跡，每天進(jìn)行1次。第6天，進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，撤除平臺，記錄120 s大鼠穿過原平臺的次數(shù)、原平臺象限游泳的時(shí)間和距離，反映記憶能力。

1.7 RT-PCR法檢測Klotho、Akt、FoxO3a、Mn-SODmRNA表達(dá) 根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作，使用凝膠圖像成像系統(tǒng)(Tanon-2500R)分析mRNA表達(dá)，GAPDH作為內(nèi)參，以目的基因與內(nèi)參基因比值表示目的基因相對表達(dá)量。

1.8 免疫組化法檢測Klotho、Mn-SOD蛋白表達(dá) 海馬組織切片脫蠟至水，雙氧水處理阻斷內(nèi)源性過氧化物酶后，微波熱修復(fù)，山羊血清封閉，加入一抗、二抗，DAB顯色，棕黃色為陽性表達(dá)。采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析陽性染色區(qū)域光密度值。

1.9 鄰硝基苯法檢測β-半乳糖苷酶活性 根據(jù)試劑盒說明書檢測β-半乳糖苷酶活性，總蛋白質(zhì)檢測采用考馬斯亮藍(lán)法。

2 結(jié)果

2.1 山茱萸多糖對腦老化大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響 與正常組比較，模型組和山茱萸多糖各劑量組大鼠學(xué)習(xí)第1天，逃避潛伏期延長(P<0.01)，隨著學(xué)習(xí)天數(shù)增加，大鼠逃避潛伏期縮短，但與正常組比較仍有顯著差異(P<0.05)；山茱萸多糖中、高劑量組大鼠逃避潛伏時(shí)間短于模型組(P<0.01)和低劑量組(P<0.05)，見圖1。給藥結(jié)束后，檢測各組大鼠的空間探索能力，以跨越平臺區(qū)次數(shù)、有效象限游泳時(shí)間比和有效象限游泳路程比代表空間探索能力，結(jié)果見表1，模型組大鼠空間探索能力低于正常組(P<0.01)；而各劑量山茱萸多糖均能提高腦老化大鼠空間探索能力(P<0.05，P<0.01)，中、高劑量效果優(yōu)于低劑量(P<0.05)。

表1 山茱萸多糖對腦老化大鼠空間探索能力的影響

2.2 山茱萸多糖對腦老化大鼠腦組織β-半乳糖苷酶活性的影響 與正常組比較，模型組大鼠腦組織β-半乳糖苷酶活性升高(P<0.01)；與模型組比較，山茱萸多糖各劑量組大鼠腦組織β-半乳糖苷酶活性均降低(P<0.05,P<0.01)，且中、高劑量效果優(yōu)于低劑量組(P<0.01)，見表2。

表2 山茱萸多糖對腦老化大鼠β-半乳糖苷酶活性的影響

2.3 山茱萸多糖對腦老化大鼠海馬Klotho、Akt、FoxO3a、Mn-SODmRNA表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組大鼠海馬Klotho、FoxO3a、Mn-SODmRNA表達(dá)降低(P<0.01)，AktmRNA表達(dá)升高(P<0.01)；與模型組比較，山茱萸多糖各劑量組大鼠海馬Klotho、FoxO3a、Mn-SODmRNA表達(dá)均升高(P<0.01)，山茱萸多糖中、高劑量組大鼠海馬AktmRNA表達(dá)降低(P<0.01)，且中、高劑量效果優(yōu)于低劑量(P<0.05，P<0.01)，見圖2、表3。

2.4 山茱萸多糖對腦老化大鼠海馬組織中Klotho、Mn-SOD蛋白表達(dá)的影響 如圖3、表4所示，與正常組比較，模型組大鼠海馬組織Klotho、Mn-SOD蛋白表達(dá)降低(P<0.01)；與模型組比較，山茱萸多糖各劑量組大鼠海馬組織Klotho、Mn-SOD蛋白表達(dá)升高(P<0.05，P<0.01)。

3 討論

腦功能的退行性改變是衰老的最重要變化之一，由于海馬與學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān), 可作為衰老時(shí)腦功能退行性改變研究的較理想靶區(qū)。本研究中發(fā)現(xiàn)，腦老化模型大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂、細(xì)胞密度減少，細(xì)胞出現(xiàn)空泡等，模型大鼠出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶能力下降和衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶活性增強(qiáng)，模擬了腦老化的典型變化。Klotho在調(diào)控衰老及年齡相關(guān)性疾病的發(fā)展中有非常關(guān)鍵的作用，最近的研究已經(jīng)確定FoxO3a在腦、心臟、腎臟和脾臟中的水平尤為豐富，在調(diào)節(jié)機(jī)體衰老中發(fā)揮作用[9-10]。本研究結(jié)果表明，山茱萸多糖通過上調(diào)Klotho下游分子Mn-SOD的表達(dá)，改善腦細(xì)胞的功能。這種作用可能是腦衰老時(shí)，海馬組織中Klotho的表達(dá)減少，降低了其對Akt表達(dá)、FoxO3a磷酸化的抑制作用，而使衰老大鼠胞質(zhì)中的FoxO3a增多，影響了FoxO3a從細(xì)胞質(zhì)向胞核的轉(zhuǎn)位，從而使Mn-SOD表達(dá)降低，最終使過氧化產(chǎn)物增多并累積，導(dǎo)致腦功能紊亂和減退。雖然Klotho抑制衰老的具體機(jī)制目前尚不明確，但從INS/IGF-1通路的一系列關(guān)鍵下游靶點(diǎn)Akt、FoxO3a和Mn-SOD的表達(dá)結(jié)果來分析，衰老大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力的減退與INS/IGF-1下游的Klotho、Akt、Fox3a和Mn-SOD的調(diào)節(jié)有關(guān)[11-12]。

圖2 各組大鼠海馬Klotho、Akt、FoxO3a、Mn-SOD mRNA的表達(dá)

表3 山茱萸多糖對腦老化大鼠海馬Klotho、Akt、FoxO3a、Mn-SOD mRNA表達(dá)的影響

表4 山茱萸多糖對腦老化大鼠海馬組織中Klotho、Mn-SOD蛋白表達(dá)的影響

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，山茱萸多糖能夠改善衰老大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，而且這種改善與其對Klotho及其下游信號分子的調(diào)節(jié)有關(guān)。山茱萸多糖可通過上調(diào)Klotho的表達(dá)，增加其對Akt的抑制作用，減少FoxO3a的磷酸化，促使FoxO3a進(jìn)入細(xì)胞核結(jié)合在SOD順式調(diào)節(jié)元件上，進(jìn)而促進(jìn)Mn-SOD的表達(dá)，提高超氧陰離子自由基的清除，使自由基及其連鎖反應(yīng)產(chǎn)物造成的組織損傷降低，而改善腦老化造成的細(xì)胞功能障礙。但是，Klotho的作用只是衰老時(shí)學(xué)習(xí)記憶的減退機(jī)制的其中之一，山茱萸多糖改善學(xué)習(xí)記憶能力的其他途徑和機(jī)制還有待于不斷的完善和進(jìn)一步的研究。