章 涵， 趙玉霞， 楊惠然， 董 雪

(河南省信陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，信陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院附屬醫(yī)院，河南 信陽 464000)

肝癌已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)影響人類生命健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)展速度快、惡性程度高，很多肝癌患者在確診時已經(jīng)發(fā)生了遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，手術(shù)切除、放療等是目前肝癌治療的常見手段，這些技術(shù)手段雖然已經(jīng)取得了明顯的成效，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足需求[1]。近些年來，隨著人們對腫瘤分子發(fā)生機制的不斷研究發(fā)現(xiàn)，基因靶向治療具有準(zhǔn)確性高、副作用小等特點，已經(jīng)成為腫瘤研究中的熱點[2]。中草藥提取物來源廣泛、不良反應(yīng)較小，也是抗腫瘤中的研究重點，芒柄花黃素是從豆科植物紅色車軸草中提取的一種雌激素，有抗炎、降血壓等功效[3]。芒柄花黃素有抗腫瘤作用，其可以降低膀胱癌、卵巢癌等腫瘤細(xì)胞惡性生長能力[4-5]。miRNA在人體內(nèi)有多種生物學(xué)作用，廣泛參與細(xì)胞生長、運動、代謝等過程[6]，還與腫瘤的關(guān)系密切，可能是腫瘤治療的分子靶點[7]。既往的研究表明，miR-4326在肺癌進展中發(fā)揮促進作用，下調(diào)其表達可以抑制肺癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力[8]?，F(xiàn)階段對于miR-4326和芒柄花黃素在肝癌進展中的作用尚不明確，本實驗探討下調(diào)miR-4326聯(lián)合芒柄花黃素干預(yù)對肝癌細(xì)胞生長、侵襲和遷移的影響和機制，為提高肝癌患者生存時間的用藥提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 細(xì)胞 肝癌細(xì)胞HuH-7、SNU-449、HCCLM3購自上海賽默飛生物科技有限公司；正常肝細(xì)胞HL7702購自北京晶萊華科生物技術(shù)有限公司。

1.2 試劑與藥物 芒柄花黃素對照品(純度>98%，批號MB1978)購自大連美侖生物技術(shù)有限公司。E-cadherin抗體購自武漢艾美捷科技有限公司；β-catenin抗體、c-Myc抗體購自美國Santa Cruz公司；miR-4326抑制物、抑制物陰性對照購自蘇州吉瑪基因股份有限公司；Vimentin抗體購自上海研晶生物技術(shù)有限公司；miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司。

2 方法

2.1 RT-qPCR檢測肝癌細(xì)胞中miR-4326表達 用Trizol試劑提取肝癌細(xì)胞HuH-7、SNU-449、HCCLM3和正常肝細(xì)胞HL7702中總RNA，紫外分光光度計測定A260/A280在1.8～2.0之間。根據(jù)miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒合成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為0.5 μL Quant RTase、2 μL RT primer、1 μL Super pure dNTPs、2 μL Poly(A)反應(yīng)溶液、1 μL RNasin、2 μL RT Buffer，用RNase-free ddH2O補充至總體積為20 μL，充分混合以后，于37 ℃孵育結(jié)合60 min，將合成的cDNA置于-20 ℃條件下保存。取cDNA，放在冰上配制PCR反應(yīng)體系，1 μL cDNA、10 μL miRcure miRNA premix、0.4 μL 正向引物、0.4 μL反向引物，用RNase-free ddH2O補充至總體積為20 μL，94 ℃ 2 min；94 ℃ 20 s，60 ℃ 34 s，共40個循環(huán)。以2-△△CT法計算miR-4326表達，內(nèi)參為U6。引物序列為miR-4326正向5′-GCCCGCTGTTCCTCTGTCTCCC-3′，反向5′-GTGCAGGGTCC GAGGT-3′。

2.2 MTT法檢測細(xì)胞增殖 將HCCLM3細(xì)胞密度調(diào)整為4×105/mL，吸取100 μL細(xì)胞懸液接種到96孔板，在細(xì)胞中加入含濃度為0、15、30、60、120 μmol/L芒柄花黃素的細(xì)胞培養(yǎng)液，將培養(yǎng)板置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入10 μL MTT溶液，置于37 ℃環(huán)境中反應(yīng)4 h，棄上清，每孔加入150 μL DMSO，反應(yīng)10 min，采用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處吸光度值(A)，以A值表示細(xì)胞增殖能力。

2.3 細(xì)胞分組及處理 HCCLM3細(xì)胞分成對照組(不作處理)、anti-miR-NC組(轉(zhuǎn)染抑制物陰性對照)、anti-miR-4326組(轉(zhuǎn)染miR-4326抑制物)、anti-miR-NC+芒柄花黃素組(轉(zhuǎn)染抑制物陰性對照+30 μmol/L芒柄花黃素)、anti-miR-4326+芒柄花黃素組(轉(zhuǎn)染miR-4326抑制物+30 μmol/L芒柄花黃素)。對照組、anti-miR-NC組、anti-miR-4326組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，RT-qPCR法檢測miR-4326表達；對照組、anti-miR-NC組、anti-miR-4326組、anti-miR-NC+芒柄花黃素組、anti-miR-4326+芒柄花黃素組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，MTT法檢測細(xì)胞增殖。轉(zhuǎn)染試劑為 Lipofectamine 2000，按照轉(zhuǎn)染試劑操作說明進行轉(zhuǎn)染。

2.4 Transwell小室檢測細(xì)胞侵襲和遷移 各組細(xì)胞分別懸浮在不含胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)，細(xì)胞密度為1×105/mL。侵襲實驗前在Transwell小室內(nèi)加入Matrigel將小室濕化2 h，接著取200 μL上述細(xì)胞懸液至Transwell小室的上室，同時在下室內(nèi)加入500 μL含胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，放在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，取出小室，用棉簽將沒有穿膜的細(xì)胞擦掉，多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下觀察細(xì)胞穿膜數(shù)目，隨機選擇6個視野，計數(shù)分析。

2.5 Western blot檢測細(xì)胞中E-cadherin、Vimentin、β-catenin、c-Myc蛋白表達 收集培養(yǎng)24 h的各組細(xì)胞，預(yù)冷的PBS溶液重復(fù)洗滌細(xì)胞2次，加入細(xì)胞裂解液，置于冰上裂解30 min，12 000×g離心20 min，吸取上清，即為總蛋白，蛋白定量后和上樣緩沖液均勻混合，煮沸5 min進行變性，于-80 ℃保存。常規(guī)方法分別制備10%分離膠、5%濃縮膠，吸取蛋白樣品加入到上樣孔內(nèi)，每孔30 μg蛋白樣品，設(shè)置電壓80 V、100 V，半干式方法進行轉(zhuǎn)膜，設(shè)置2.5 mA/cm2恒定電流冰浴轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1.5 h，置于一抗溶液(E-cadherin、Vimentin、c-Myc均以1∶1 000稀釋)中結(jié)合反應(yīng)2 h，然后放在二抗溶液(1∶4 000稀釋)中結(jié)合反應(yīng)2 h，ECL顯色試劑盒顯色，用Image J軟件分析條帶A值，GAPDH為內(nèi)參蛋白，計算目蛋白的相對表達。

2.6 Wnt/β-catenin信號通路激活劑對HCCLM3細(xì)胞增殖、遷移、侵襲影響 取轉(zhuǎn)染miR-4326抑制物后的HCCLM3細(xì)胞，用含有30 μmol/L芒柄花黃素和30 mmol/L Wnt/β-catenin信號通路激活劑LiCl的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，命名為anti-miR-4326+芒柄花黃素+LiCl組。以anti-miR-4326+芒柄花黃素組為參照，MTT檢測細(xì)胞增殖，Transwell小室檢測細(xì)胞侵襲和遷移，Western blot檢測E-cadherin、Vimentin、β-catenin、c-Myc蛋白表達。

3 結(jié)果

3.1miR-4326在肝癌細(xì)胞中表達上調(diào) 如表1所示，肝癌細(xì)胞HuH-7、SNU-449、HCCLM3中miR-4326表達高于正常肝細(xì)胞HL7702(P<0.05)。本研究選擇miR-4326相對表達最高的肝癌細(xì)胞HCCLM3進行后續(xù)實驗。

表1 miR-4326在肝癌細(xì)胞HuH-7、SNU-449、HCCLM3和正常肝細(xì)胞HL7702中的表達

3.2 芒柄花黃素對HCCLM3細(xì)胞增殖的影響 如表2所示，與對照組(0 μmol/L芒柄花黃素)比較，芒柄花黃素干預(yù)后，HCCLM3細(xì)胞增殖活性降低(P<0.05)，30 μmol/L芒柄花黃素干預(yù)后，肝癌細(xì)胞存活率接近50%，選用30 μmol/L芒柄花黃素進行后續(xù)實驗。

表2 芒柄花黃素處理后HCCLM3細(xì)胞增殖活性比較

3.3 miR-4326抑制物對HCCLM3細(xì)胞中miR-4326表達的影響 如表3所示，與anti-miR-NC組比較，轉(zhuǎn)染miR-4326抑制物后，HCCLM3細(xì)胞中miR-4326表達降低(P<0.05)。提示，miR-4326抑制物能下調(diào)HCCLM3細(xì)胞中miR-4326表達。

表3 miR-4326抑制物轉(zhuǎn)染后HCCLM3細(xì)胞中miR-4326表達比較

3.4 芒柄花黃素聯(lián)合下調(diào)miR-4326對HCCLM3細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響 如圖1、表4所示，與anti-miR-NC組比較，下調(diào)miR-4326或芒柄花黃素處理后，HCCLM3細(xì)胞增殖活性、侵襲數(shù)目、遷移數(shù)目均降低(P<0.05)，細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達升高(P<0.05)，Vimentin蛋白表達降低(P<0.05)；與anti-miR-4326組或anti-miR-NC+芒柄花黃素組比較，芒柄花黃素聯(lián)合下調(diào)miR-4326能夠協(xié)同降低肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力(P<0.05)，提高細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(P<0.05)，降低細(xì)胞中Vimentin蛋白表達(P<0.05)。

注：a～e分別為對照組、anti-miR-NC組、anti-miR-4326組、anti-miR-NC+芒柄花黃素組、anti-miR-NC+芒柄花黃素組。圖1 各組HCCLM3細(xì)胞侵襲、遷移能力(A)和E-cadherin、Vimentin蛋白表達(B)

表4 芒柄花黃素聯(lián)合下調(diào)miR-4326對HCCLM3細(xì)胞的影響

3.5 芒柄花黃素聯(lián)合下調(diào)miR-4326對HCCLM3細(xì)胞Wnt/β-catenin信號通路激活的影響 如圖2、表5所示，與anti-miR-NC組比較，下調(diào)miR-4326或芒柄花黃素干預(yù)后，HCCLM3細(xì)胞中β-catenin、c-Myc蛋白表達降低(P<0.05)；與anti-miR-4326組或anti-miR-NC+芒柄花黃素組比較，芒柄花黃素聯(lián)合下調(diào)miR-4326能夠協(xié)同降低HCCLM3細(xì)胞中β-catenin、c-Myc蛋白表達(P<0.05)。提示，芒柄花黃素聯(lián)合下調(diào)miR-4326能抑制HCCLM3細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號通路的激活。

注：a～e分別為對照組、anti-miR-NC組、anti-miR-4326組、anti-miR-NC+芒柄花黃素組、anti-miR-NC+芒柄花黃素組。圖2 各組HCCLM3細(xì)胞中β-catenin、c-Myc蛋白表達

表5 芒柄花黃素聯(lián)合下調(diào)miR-4326對HCCLM3細(xì)胞β-catenin、c-Myc蛋白表達的影響

3.6 Wnt/β-catenin信號通路激活劑對HCCLM3細(xì)胞增殖、侵襲、遷移及相關(guān)蛋白的影響 如圖3、表6所示，與未經(jīng)LiCl處理的細(xì)胞比較，LiCl處理提高了芒柄花黃素聯(lián)合下調(diào)miR-4326處理的HCCLM3細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力(P<0.05)，提高了細(xì)胞中β-catenin、c-Myc、Vimentin蛋白表達(P<0.05)，降低了細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(P<0.05)。

表6 Wnt/β-catenin信號通路激活劑對HCCLM3細(xì)胞的影響

注：a為anti-miR-4326+芒柄花黃素組，b為anti-miR-4326+芒柄花黃素+LiCl組。圖3 各組HCCLM3細(xì)胞侵襲、遷移(A)和Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白表達(B)

4 討論

芒柄花黃素又名刺芒柄花素，是我國傳統(tǒng)中藥黃芪的主要活性成分之一，有調(diào)節(jié)免疫、改善炎癥等作用[9]，還具有抗腫瘤作用，可以抑制宮頸癌、結(jié)直腸癌、胃癌等腫瘤細(xì)胞的惡性生長和轉(zhuǎn)移[10-12]。本實驗結(jié)果顯示，芒柄花黃素處理后，HCCLM3肝癌細(xì)胞增殖能力降低，細(xì)胞侵襲和遷移能力降低，提示芒柄花黃素抑制HCCLM3細(xì)胞生長、侵襲和遷移。

miRNA是一類沒有編碼能力的小分子RNA，在自然界的真核生物體內(nèi)存在，參與調(diào)控細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育、能量代謝等過程。miRNA與人類多種疾病有關(guān)，參與疾病的病理進展，可能是疾病治療的靶向調(diào)節(jié)分子[13]。miR-4326是近些年來發(fā)現(xiàn)的與腫瘤有關(guān)的miRNA，在肺癌、多發(fā)性骨髓瘤等腫瘤中表達上調(diào)，并且下調(diào)miR-4326表達可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長、遷移、侵襲[8,14]。本實驗結(jié)果表明，miR-4326在肝癌細(xì)胞中的表達高于正常肝細(xì)胞，下調(diào)miR-4326可以降低肝癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力，提示miR-4326在肝癌進展中可能扮演類似癌基因的作用，靶向抑制miR-4326可能是肝癌治療的有效途徑。

腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的過程，不僅與腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移能力等有關(guān)，還與腫瘤細(xì)胞EMT有關(guān)[15]。研究表明，發(fā)生EMT的腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移能力明顯增加，EMT被認(rèn)為是腫瘤轉(zhuǎn)移的早期標(biāo)志[16]。Vimentin是間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白，E-cadherin是上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白，二者的表達是EMT水平的標(biāo)志[17]。本實驗結(jié)果顯示，下調(diào)miR-4326和芒柄花黃素均可降低HCCLM3細(xì)胞中Vimentin表達，提高E-cadherin表達，并且二者聯(lián)合作用效果更好，提示芒柄花黃素聯(lián)合下調(diào)miR-4326抑制HCCLM3細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移潛能。

Wnt/β-catenin是經(jīng)典Wnt信號通路，在人體組織中廣泛表達，參與多種病理和生理過程[18]。Wnt/β-catenin影響細(xì)胞生長、代謝等過程，與動脈粥樣硬化、關(guān)節(jié)炎等疾病有關(guān)[19-20]。Wnt/β-catenin在腫瘤進展中過度激活，其活化后誘導(dǎo)腫瘤轉(zhuǎn)移和生長，抑制其激活具有抵抗腫瘤細(xì)胞增殖、遷移的作用[21]。β-catenin是Wnt/β-catenin信號通路的關(guān)鍵蛋白，c-Myc是Wnt/β-catenin信號通路的下游靶點[22]。以往研究發(fā)現(xiàn)，芒柄花黃素調(diào)控腫瘤細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號通路[23]。本實驗結(jié)果顯示，芒柄花黃素和下調(diào)miR-4326后，HCCLM3細(xì)胞中β-catenin、c-Myc蛋白表達均降低，并且激活Wnt/β-catenin通路可以逆轉(zhuǎn)芒柄花黃素聯(lián)合下調(diào)miR-4326對HCCLM3細(xì)胞的抑制作用，這提示芒柄花黃素聯(lián)合下調(diào)miR-4326通過Wnt/β-catenin影響HCCLM3細(xì)胞生長、侵襲和遷移。

綜上所述，芒柄花黃素聯(lián)合下調(diào)miR-4326可能是肝癌治療的途徑之一，可以抑制HCCLM3細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移和EMT，其機制可能與抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活有關(guān)。這為臨床上提高肝癌患者生活質(zhì)量提供了參考，為研究芒柄花黃素和下調(diào)miR-4326抗腫瘤機制提供了實驗基礎(chǔ)。