肖艷平， 付久園， 王曉華， 葛永梅， 朱艷菊

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北 承德 067000)

子癇前期是妊娠相關(guān)綜合征，其特征在于妊娠20周后出現(xiàn)高血壓和蛋白尿，影響約4%的妊娠，占全世界孕產(chǎn)婦死亡率的15%以上[1]。人胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞的正常增殖和遷移對(duì)于維持胎盤的正常功能極為重要[2]。研究發(fā)現(xiàn)，滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤和遷移不足會(huì)導(dǎo)致血管重塑受損和胎盤早期循環(huán)減少，從而導(dǎo)致妊娠20周后引起胎盤缺血，促進(jìn)子癇前期的發(fā)生和進(jìn)展[3]。因此，有效抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖、遷移和侵襲對(duì)子癇前期的臨床治療具有重要意義。目前治療子癇前期的主要方法包括解痙、鎮(zhèn)靜，有指征的降壓、利尿[4]。鉤藤是茜草科鉤藤屬植物，以帶鉤的莖枝入藥，具有清熱、定驚和降壓的功效，常用于治療頭痛眩暈、驚癇抽搐、妊娠子癇等[5-6]。目前研究顯示，鉤藤在重度子癇前期的臨床治療中能夠明顯減輕患者的癥狀，且療效確切[7]。因此，本實(shí)驗(yàn)探究鉤藤中有效活性成分鉤藤堿對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo購自美國模式培養(yǎng)物集存庫。

1.2 試劑與藥物 鉤藤堿對(duì)照品(純度≥98%，批號(hào)A0318)購自成都曼思特生物科技有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；青霉素、鏈霉素購自美國Sigma公司；胎牛血清購自美國HyClone公司；CCK-8檢測(cè)試劑購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；孔徑為8 μm的Transwell小室購自美國Corning公司；Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；SYBR Premix Ex Taq試劑盒購自日本TaKaRa公司；NF-κB p65、IκBα、p-IκBα抗體和HRP標(biāo)記的二抗購自美國CST公司；BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；實(shí)驗(yàn)所用引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和分組 HTR-8/SVneo細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清及100 U/mL青-鏈霉素雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2、飽和濕度，及時(shí)觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，每2 d換液1次，細(xì)胞呈單層融合時(shí)，使用0.25%胰蛋白酶消化傳代。對(duì)數(shù)期的HTR-8/SVneo細(xì)胞分為空白對(duì)照組、鉤藤堿低劑量組和鉤藤堿高劑量組，其中鉤藤堿低、高劑量組分別加入100、400 μmol/L的鉤藤堿(根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇加藥標(biāo)準(zhǔn)濃度)，空白對(duì)照組HTR-8/SVneo細(xì)胞不做處理。

1.4 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖率 對(duì)數(shù)期的HTR-8/SVneo細(xì)胞接種于96孔板中，每孔2×104個(gè)細(xì)胞，于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細(xì)胞單層融合度至50%時(shí)，按照“1.3”項(xiàng)下分組和處理，分別在24、48、72 h時(shí)向每孔細(xì)胞中加入20 μL CCK-8溶液，繼續(xù)孵育4 h，使用多功能酶標(biāo)儀在450 nm波長處檢測(cè)光密度值(OD)，并計(jì)算細(xì)胞增殖率。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 對(duì)數(shù)期的HTR-8/SVneo細(xì)胞接種于96孔板中，按照“1.3”項(xiàng)下分組和處理，48 h后收集各組HTR-8/SVneo細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次，加入70%乙醇固定細(xì)胞，隨后用PI染色液在37 ℃下避光染色30 min，通過流式細(xì)胞儀分析染色細(xì)胞的細(xì)胞周期分布情況。

1.6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移率 對(duì)數(shù)期的HTR-8/SVneo細(xì)胞接種于6孔板中，按照“1.3”項(xiàng)下分組和處理，待細(xì)胞呈單層匯合時(shí)，使用滅菌的槍頭進(jìn)行劃痕，用PBS洗去細(xì)胞及碎片，放置在37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h，分別在0、48 h獲取圖像，計(jì)算各組HTR-8/SVneo細(xì)胞遷移率。

1.7 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 對(duì)數(shù)期的HTR-8/SVneo細(xì)胞按照“1.3”項(xiàng)下分組和處理，將細(xì)胞懸浮于含1%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，將細(xì)胞懸液加入孔徑為8 μm的Transwell小室上室(上室經(jīng)Matrigel基質(zhì)膠包被)，在下室加入500 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，在37 ℃培養(yǎng)箱孵育24 h，細(xì)胞穿膜至Transwell小室的下層，以多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，通過倒置顯微鏡觀察并統(tǒng)計(jì)，每個(gè)小室隨機(jī)選擇5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.8 RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá) 對(duì)數(shù)期的HTR-8/SVneo細(xì)胞按照“1.3”項(xiàng)下分組和處理48 h后，收集各組細(xì)胞并采用Trizol試劑抽提總RNA，經(jīng)超微量核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)RNA的純度和濃度，選取合格的RNA作模板，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用SYBR Premix Ex Taq試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，分別獲取目的基因和內(nèi)參基因的CT值，以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。Vimentin正向引物序列5′-AGTCCACTGAGTACCGGAGAC-3′，反向引物序列5′-CATTTCACGCATCTGGCGTTC-3′；E-cadherin正向引物序列5′-CTGCCAATCCCGATGAAATTG-3′，反向引物序列5′-TCCTTCATAGTCAAACACGAGC-3′；N-cadherin正向引物序列5′-TGGGAATCCGACGAATGG-3′，反向引物序列5′-GCAGATCGGACCGGATACTG-3′；GAPDH正向引物序列5′-CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC-3′，反向引物序列5′-ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC-3′。

1.9 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞目的蛋白的表達(dá) 對(duì)數(shù)期的HTR-8/SVneo細(xì)胞按照“1.3”項(xiàng)下分組和處理48 h后，收集各組細(xì)胞，加入適量RIPA細(xì)胞裂解液，于冰上裂解細(xì)胞，離心收集蛋白樣品，使用BCA檢測(cè)試劑盒對(duì)蛋白進(jìn)行定量，制備10%的SDS-PAGE凝膠，取等量蛋白樣品上樣，電泳分離蛋白，采用濕轉(zhuǎn)法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，將膜放置在含5%胎牛血清的封閉液中孵育1 h，加入相應(yīng)一抗，4 ℃孵育過夜，次日用TBST洗膜，再加入相應(yīng)二抗(1∶2 000)孵育，采用ECL化學(xué)發(fā)光顯影，以β-actin為內(nèi)參蛋白，采集圖像，采用Image J軟件計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 鉤藤堿促進(jìn)HTR-8/SVneo細(xì)胞增殖 如表1所示，與空白對(duì)照組比較，鉤藤堿低劑量組細(xì)胞在48、72 h時(shí)增殖率均升高(P<0.01)，鉤藤堿高劑量組細(xì)胞在24、48、72 h時(shí)增殖率均升高(P<0.01)；與鉤藤堿低劑量組比較，鉤藤堿高劑量組細(xì)胞在48、72 h時(shí)增殖率升高(P<0.01)。

表1 鉤藤堿對(duì)HTR-8/SVneo細(xì)胞增殖率的影響

2.2 鉤藤堿促進(jìn)HTR-8/SVneo細(xì)胞周期進(jìn)程 如表2、圖1所示，與空白對(duì)照組比較，鉤藤堿各劑量組G0/G1期細(xì)胞比例減少(P<0.01)，S期細(xì)胞比例增加(P<0.01)；與鉤藤堿低劑量組比較，鉤藤堿高劑量組G0/G1期細(xì)胞比例減少(P<0.01)，S期細(xì)胞比例增加(P<0.01)。

表2 鉤藤堿對(duì)HTR-8/SVneo細(xì)胞周期的影響

2.3 鉤藤堿增強(qiáng)HTR-8/SVneo細(xì)胞遷移能力 如表3、圖2所示，與空白對(duì)照組比較，鉤藤堿各劑量組細(xì)胞遷移率均升高(P<0.01)；與鉤藤堿低劑量組比較，鉤藤堿高劑量組細(xì)胞遷移率升高(P<0.01)。

圖1 各組HTR-8/SVneo細(xì)胞周期細(xì)胞比例

圖2 各組HTR-8/SVneo細(xì)胞遷移能力

表3 鉤藤堿對(duì)HTR-8/SVneo細(xì)胞遷移能力的影響

2.4 鉤藤堿增強(qiáng)HTR-8/SVneo細(xì)胞侵襲能力 如圖3、表4所示，與空白對(duì)照組比較，鉤藤堿各劑量組侵襲細(xì)胞數(shù)增加(P<0.01)；與鉤藤堿低劑量組比較，鉤藤堿高劑量組侵襲細(xì)胞數(shù)增加(P<0.01)。

圖3 各組HTR-8/SVneo細(xì)胞侵襲能力

表4 鉤藤堿對(duì)HTR-8/SVneo細(xì)胞侵襲能力的影響

2.5 鉤藤堿誘導(dǎo)HTR-8/SVneo細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 如圖4、表5所示，與空白對(duì)照組比較，鉤藤堿各劑量組細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)降低(P<0.01)，N-cadherin、Vimentin表達(dá)升高(P<0.01)；與鉤藤堿低劑量組比較，鉤藤堿高劑量組細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)降低(P<0.01)，N-cadherin、Vimentin表達(dá)升高(P<0.01)。

圖4 各組HTR-8/SVneo細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)

2.6 鉤藤堿激活HTR-8/SVneo細(xì)胞中NF-κB信號(hào)通路 如圖5、表6所示，與空白對(duì)照組比較，鉤藤堿各劑量組細(xì)胞中NF-κB p65和IκBα磷酸化表達(dá)均升高(P<0.01)，IκBα表達(dá)降低(P<0.01)；與鉤藤堿低劑量組比較，鉤藤堿高劑量組細(xì)胞中NF-κB p65和IκBα磷酸化表達(dá)均升高(P<0.01)，IκBα表達(dá)降低(P<0.01)。

表5 鉤藤堿對(duì)HTR-8/SVneo細(xì)胞EMT標(biāo)志分子表達(dá)量的影響

圖5 各組HTR-8/SVneo細(xì)胞中NF-κB p65、IκBα和p-IκBα蛋白表達(dá)

表6 鉤藤堿對(duì)HTR-8/SVneo細(xì)胞中NF-κB p65、IκBα和p-IκBα蛋白表達(dá)的影響

3 討論

子癇前期是一種妊娠并發(fā)癥，是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦和胎兒死亡率增加的主要原因之一[8]，是由遺傳和環(huán)境因素共同作用引起的疾病[9]。目前關(guān)于子癇前期的發(fā)病機(jī)制尚不明確，有學(xué)者認(rèn)為，胎盤中滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖和侵襲能力不足與該病發(fā)病有關(guān)[10]。滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖對(duì)于維持胎盤正常功能具有至關(guān)重要的作用，研究顯示，子癇前期伴隨滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖能力明顯降低[11]。本實(shí)驗(yàn)采用低、高劑量鉤藤堿干預(yù)人滋養(yǎng)層HTR-8/SVneo細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鉤藤堿能促進(jìn)HTR-8/Svneo細(xì)胞增殖，且高劑量效果優(yōu)于低劑量。此外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，鉤藤堿可促進(jìn)G0/G1期細(xì)胞向S期轉(zhuǎn)化，表明鉤藤堿能夠促進(jìn)HTR-8/Svneo細(xì)胞周期進(jìn)程。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，鉤藤堿能夠增強(qiáng)滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖活力，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，對(duì)子癇前期的發(fā)病可能具有抑制作用。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)分子如E-cadherin、N-cadherin和Vimentin，與滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力密切相關(guān)[12-13]，研究表明EMT在子癇前期胎盤中被抑制[14]。在絨毛頂端或附近的絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞失去上皮表型，并獲得間充質(zhì)表型，從而賦予了細(xì)胞遷移和侵襲的能力[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，鉤藤堿干預(yù)后HTR-8/Svneo細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)降低，而N-cadherin和Vimentin表達(dá)升高，表明鉤藤堿可促進(jìn)EMT過程的發(fā)生。鉤藤堿處理HTR-8/Svneo細(xì)胞后，細(xì)胞遷移和侵襲能力均升高，表明鉤藤堿能夠促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲和遷移。滋養(yǎng)層細(xì)胞在女性懷孕期間生理上侵入子宮，并且滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲與腫瘤細(xì)胞的侵襲行為相似[16]。以上結(jié)果表明，鉤藤堿可能通過促進(jìn)EMT的發(fā)生促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和遷移。多項(xiàng)研究表明，NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與了滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲和遷移[17-19]。在本實(shí)驗(yàn)中，鉤藤堿處理后，滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/Svneo中IκBα的磷酸化和NF-κB信號(hào)亞基p65的表達(dá)均升高，提示鉤藤堿能夠促進(jìn)NF-κB信號(hào)通路的激活。此外，研究還發(fā)現(xiàn)NF-κB信號(hào)通路調(diào)節(jié)EMT過程。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明NF-κB信號(hào)可能參與了鉤藤堿對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲和遷移的促進(jìn)作用。

綜上所述，低、高劑量鉤藤堿均可促進(jìn)滋養(yǎng)層HTR-8/Svneo細(xì)胞的增殖，并且能夠促進(jìn)細(xì)胞從G0/G1期細(xì)胞向S期轉(zhuǎn)化，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程；此外，鉤藤堿還可促進(jìn)EMT發(fā)生，促進(jìn)HTR-8/Svneo細(xì)胞遷移和侵襲，其作用機(jī)制可能與促進(jìn)NF-κB信號(hào)通路激活有關(guān)。