謝雯雯， 何志凌， 招煦杰， 羅 銳

(廣州中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院，廣東 廣州 510000)

糖尿病腎病是臨床常見的一種慢性腎臟疾病，我國糖尿病腎病發(fā)病率逐年上升，其發(fā)展為終末期腎衰竭的病理基礎主要為腎小管間質(zhì)纖維化，目前糖尿病腎病發(fā)病機制尚未闡明，炎癥反應、細胞凋亡及氧化應激等是誘發(fā)糖尿病腎病的重要原因[1]。中藥活性成分具有抗氧化、抗炎等作用，并可減輕糖尿病腎病等引發(fā)的腎損傷[2-3]。姜黃是姜科姜黃屬植物，姜黃素是從姜黃中提取的物質(zhì)，為黃色酸性酚類物質(zhì)，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤的作用，還可抑制軟骨細胞凋亡從而減輕細胞損傷[4]，但姜黃素對糖尿病腎病的影響及其可能作用機制尚未闡明。長鏈非編碼RNA(lncRNA)在腎損傷中發(fā)揮重要調(diào)控作用[5]，長鏈非編碼RNA TUG1(lncRNA TUG1)在糖尿病心肌病中表達降低，并可能參與糖尿病心肌病發(fā)生及發(fā)展過程[6]，但TUG1是否介導姜黃素影響糖尿病腎病發(fā)生過程尚未可知。因此，本研究以大鼠近端腎小管上皮細胞NRK-52E為研究對象，采用高糖誘導NRK-52E細胞建立細胞損傷模型，探討姜黃素對高糖誘導NRK-52E細胞增殖及凋亡的影響。

1 材料

1.1 細胞 大鼠近端腎小管上皮細胞NRK-52E，購自上海弘順生物科技有限公司。

1.2 試劑與藥物 姜黃素對照品(純度≥95%，上海信裕生物科技有限公司)；葡萄糖(華仁藥業(yè)股份有限公司)；DMEM培養(yǎng)液(上海鈺森生物技術有限公司)；胎牛血清(杭州亦博生物科技有限公司)；MTT試劑(上海歌凡生物科技有限公司)；細胞凋亡檢測試劑盒(上海瓦蘭生物科技有限公司)；Lipofectamine2000(上海信帆生物科技有限公司)；Trziol、反轉錄、RT-qPCR試劑[天根生化科技(北京)有限公司]；pcDNA、pcDNA-TUG1(上海索寶生物科技有限公司)；si-NC、si-TUG1(廣州銳博生物科技有限公司)；caspase-3、Bax、Bcl-2抗體(美國Santa Cruz公司)；HRP標記的山羊抗兔IgG二抗(武漢艾美捷科技有限公司)。

2 方法

2.1 分組及干預 模型組加入30 mmol/L葡萄糖[7]；對照組加入5.5 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)；低、中、高劑量姜黃素組分別加入20、40、80 μmol/L姜黃素和30 mmol/L葡萄糖[8]，培養(yǎng)24 h。后續(xù)實驗分別將pcDNA、pcDNA-TUG1轉染至NRK-52E細胞，并加入30 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)24 h，分別記作pcDNA組、pcDNA-TUG1組；分別將si-NC、si-TUG1轉染至NRK-52E細胞，加入80 μmol/L姜黃素與30 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)24 h，分別記作高劑量姜黃素+si-NC組、高劑量姜黃素+si-TUG1組。

2.2 MTT檢測細胞存活率 調(diào)整NRK-52E細胞密度為3×105/mL，每孔100 μL接種于96孔板，按“2.1”項下分組培養(yǎng)24 h，加入20 μL MTT溶液，室溫孵育4 h，棄上清，加入150 μL DMSO，室溫振蕩孵育10 min，采用酶標儀檢測490 nm波長處各孔光密度值(OD)，并計算細胞存活率。

2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡率 NRK-52E細胞接種于6孔板，每孔3×104個細胞，按“2.1”項下分組培養(yǎng)24 h，收集各組NRK-52E細胞，按照凋亡檢測試劑盒說明書檢測細胞凋亡率。

2.4 RT-qPCR檢測細胞中TUG1表達 收集各組細胞，采用Trizol法提取各組NRK-52E細胞中的總RNA。參照反轉錄試劑盒將RNA反轉錄合成cDNA，以cDNA為模板進行RT-qPCR反應，采用2-ΔΔCT法計算TUG1相對表達量。

2.5 Western blot檢測細胞中caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達 收集各組細胞，加入400 μL RIPA裂解液提取細胞總蛋白，采用BCA法檢測蛋白濃度，取40 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳反應，轉膜，封閉，加入一抗稀釋液(1∶1 000)，4 ℃孵育24 h，使用TBST洗滌，加入二抗稀釋液(1∶2 000)，室溫孵育1 h，使用TBST洗滌，暗室內(nèi)曝光顯影，采用Image J軟件分析各條帶灰度值。

3 結果

3.1 姜黃素對高糖誘導NRK-52E細胞活力的影響 與對照組比較，模型組細胞存活率降低(P<0.05)；與模型組比較，各劑量姜黃素組存活率均升高(P<0.05)，且呈劑量依賴性，見表1。

表1 姜黃素對高糖誘導NRK-52E細胞存活率的影響

3.2 姜黃素對高糖誘導NRK-52E細胞凋亡的影響 與對照組比較，模型組細胞凋亡率和caspase-3、Bax蛋白表達升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達降低(P<0.05)；與模型組比較，各劑量姜黃素組細胞凋亡率和caspase-3、Bax蛋白表達降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達升高(P<0.05)，且呈劑量依賴性，見圖1、表2。

圖1 姜黃素對高糖誘導NRK-52E細胞凋亡率(A)及凋亡相關蛋白表達(B)的影響

表2 姜黃素對高糖誘導NRK-52E細胞凋亡的影響

3.3 姜黃素對高糖誘導NRK-52E細胞中TUG1表達的影響 與對照組比較，模型組細胞中TUG1的表達降低(P<0.05)；與模型組比較，各劑量姜黃素組細胞中TUG1的表達升高(P<0.05)，且呈劑量依賴性，見表3。

表3 姜黃素對高糖誘導NRK-52E細胞中TUG1表達的影響

3.4 過表達lncRNA TUG1對高糖誘導NRK-52E細胞活力的影響 與pcDNA組比較，pcDNA-TUG1組細胞存活率升高(P<0.05)，見表4。

表4 過表達lncRNA TUG1對高糖誘導NRK-52E細胞活力的影響

3.5 過表達lncRNA TUG1對高糖誘導NRK-52E細胞凋亡的影響 與pcDNA組比較，pcDNA-TUG1組細胞凋亡率和caspase-3、Bax蛋白表達降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達升高(P<0.05)，見圖2、表5。

圖2 過表達lncRNA TUG1對NRK-52E細胞凋亡率(A)及凋亡相關蛋白表達(B)的影響

表5 過表達lncRNA TUG1對高糖誘導NRK-52E細胞凋亡的影響

3.6 干擾lncRNA TUG1能逆轉姜黃素對高糖誘導NRK-52E細胞活力和凋亡的影響 與高劑量姜黃素+si-NC組比較，高劑量姜黃素+si-TUG1組細胞存活率和Bcl-2蛋白表達降低(P<0.05)，細胞凋亡率和caspase-3、Bax蛋白表達升高(P<0.05)，見表6～7、圖3。

表6 干擾lncRNA TUG1能逆轉姜黃素對高糖誘導NRK-52E細胞活力的影響

表7 干擾lncRNA TUG1能逆轉姜黃素對高糖誘導NRK-52E細胞凋亡的影響

圖3 干擾lncRNA TUG1對NRK-52E細胞凋亡率(A)及凋亡相關蛋白表達(B)的影響

4 討論

姜黃素屬于酚類物質(zhì)，其具有抗炎、抗氧化及抗腫瘤等作用，研究表明姜黃素可抑制氧化應激從而減輕神經(jīng)細胞損傷[9]；還可抑制NF-κB信號通路從而減輕心肌細胞氧化應激損傷及缺血再灌注損傷[10]；可通過清除氧自由基而抑制潰瘍性結腸炎的發(fā)展[11]。本研究結果顯示高糖誘導的NRK-52E細胞存活率降低，不同劑量姜黃素處理后可提高細胞存活率，提示姜黃素可促進高糖誘導的NRK-52E細胞增殖。細胞凋亡與Bcl-2/Bax比值失衡有關，Bcl-2表達下調(diào)與Bax表達上調(diào)可促進細胞凋亡[12]。本研究結果顯示高糖誘導后NRK-52E細胞凋亡率、caspase-3、Bax蛋白表達升高，而Bcl-2蛋白表達降低，姜黃素可減弱細胞凋亡能力，提示姜黃素可明顯抑制高糖誘導的NRK-52E細胞凋亡進而減輕細胞損傷。

TUG1在腎損傷中表達降低，上調(diào)其表達可減輕腎損傷[13]。黃芪甲苷可通過上調(diào)TUG1的表達而抑制糖尿病腎病大鼠足細胞凋亡[14]。TUG1表達上調(diào)可通過抑制miR-21而促進TIMP3表達進而改善糖尿病腎病[15]。本研究結果顯示高糖誘導的NRK-52E細胞中TUG1的表達降低，而姜黃素可促進TUG1表達，進一步研究顯示TUG1過表達可提高高糖誘導的NRK-52E細胞增殖，降低細胞凋亡率。同時本研究進一步證實抑制TUG1表達可明顯逆轉姜黃素對高糖誘導的NRK-52E細胞增殖及凋亡的作用，首次證實姜黃素調(diào)控高糖誘導的NRK-52E細胞增殖及凋亡的過程中TUG1發(fā)揮的重要作用。

綜上所述，姜黃素可促進高糖誘導的NRK-52E細胞增殖及抑制細胞凋亡進而減輕細胞損傷，其作用機制與上調(diào)TUG1的表達有關，但關于其具體作用機制仍需深入研究。