李善斌， 黃四新， 牟俊飛， 羅 琴， 梁成欽， 周先麗*

(1.桂林醫(yī)學(xué)院生物技術(shù)學(xué)院，廣西 桂林 541004；2.桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣西 桂林 541004)

隨著人們生活水平的提高，糖尿病患者迅速增加，特別是廣大發(fā)展中國(guó)家[1]。在已知的疾病中糖尿病死亡率高居第3位，僅次于腫瘤和心腦血管疾病[2]。全球約有4.25億糖尿病患者，而我國(guó)擁有數(shù)量世界第二的糖尿病患者[3-4]，大多數(shù)為2型糖尿病。對(duì)于2型糖尿病患者，控制餐后血糖可以有效的防止一系列糖尿病癥的發(fā)生[5]。

葡萄糖苷酶在生物體內(nèi)主要是通過水解糖類中的葡萄糖苷鍵生成葡萄糖，葡萄糖苷酶對(duì)于調(diào)節(jié)餐后血糖具有決定性作用，按照其功能分為α-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶[6]。目前臨床上常用的α-葡萄糖苷酶抑制劑(AGIs)，例如阿卡波糖、米格列醇等[7]，AGIs本身存在一定毒副作用，因此，從天然植物中開發(fā)新型、高效、低毒的AGIs對(duì)于2型糖尿病的防治具有重要意義[8]。

江南星蕨Microsorumfortunei為水龍骨科植物，用于疔毒、蛇蟲咬傷、燒傷等癥[9-10]，江南星蕨含有糖、酚酸、黃酮等多種活性成分[11]，同時(shí)還具有較強(qiáng)的抗菌和抗氧化活性[12-14]，但目前對(duì)于其中α-葡萄糖苷酶抑制活性的報(bào)道較少。本研究對(duì)該藥材中原兒茶酸、5-羥甲基-2-呋喃甲醛對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性進(jìn)行研究，以期為其進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材與試劑 江南星蕨采于廣西資源縣，經(jīng)桂林醫(yī)學(xué)院李云秋教授鑒定為正品。阿卡波糖(上海梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司)；二甲基亞砜(西隴科學(xué)股份有限公司，批號(hào)1709101)；α-葡萄糖苷酶、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(美國(guó)Sigma公司)。

1.2 儀器 酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Teck公司)；FE28 PH計(jì)、電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；微量移液器(德國(guó)Eppendorf公司)。

2 方法

2.1 化合物提取分離 參照文獻(xiàn)[3]報(bào)道，江南星蕨干燥粉碎后用75%乙醇提取1 h，重復(fù)2次，乙酸乙酯萃取后正丁醇萃取，得到2個(gè)組分，經(jīng)硅膠柱層析，分別得到組分Fr.A～Fr.F、Fr.I～Fr.Ⅵ。Fr.B經(jīng)MCI柱，90%甲醇洗脫，Sephadex LH-20柱分離，得到組分Fr.B.1～Fr.B.5，F(xiàn)r.B.4經(jīng)中壓反相硅膠柱色譜分離，10%～100%甲醇洗脫，得到原兒茶酸。再采用MCI柱分離Fr.Ⅱ組分，甲醇洗脫，得到組分Fr.Ⅱ.1～Fr.Ⅱ.4，F(xiàn)r.Ⅱ.1經(jīng)反相硅膠柱、RP-HPLC制備色譜分離，得到5-羥甲基-2-呋喃甲醛。

2.2 α-葡萄糖苷酶抑制活性的測(cè)定 反應(yīng)體系參照文獻(xiàn)[15]，以阿卡波糖為陽(yáng)性對(duì)照，2個(gè)化合物用DMSO溶解后以pH 6.9的磷酸鹽緩沖液稀釋至0.001、0.010、0.050、0.100、0.200、0.500 mg/mL，分別取50 μL至96孔板中，加入100 μL 0.5 U/mL α-葡萄糖苷酶混勻，置于25 ℃孵育箱中15 min，加入50 μL 5 mmol/L pNPG，在25 ℃下孵育10 min，在405 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A)，計(jì)算酶活性抑制率，公式為抑制率=[(A0-A1)/A0]×100%，其中A0為空白組吸光度，A1為樣品組吸光度。

2.3 酶抑制動(dòng)力學(xué)研究 參考文獻(xiàn)[16]報(bào)道，設(shè)置化合物質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL，測(cè)定在反應(yīng)時(shí)間1、5、10、15、20 min時(shí)化合物在反應(yīng)時(shí)間對(duì)酶活性的影響。在化合物質(zhì)量濃度分別為0、0.5 mg/mL時(shí)，改變?chǔ)?葡萄糖苷酶濃度為0.24、0.36、0.48、0.60 U/mL，測(cè)定α-葡萄糖苷酶抑制活性，并判斷其抑制作用的可逆性[17]。取0.5、1、1.7、2 mmol/L pNPG與不同質(zhì)量濃度2個(gè)化合物，測(cè)定反應(yīng)速率，繪制化合物的Lineweaver Burk酶抑制動(dòng)力學(xué)曲線，確定抑制作用類型[18]。

3 結(jié)果

3.1 化合物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用 由圖1可知，原兒茶酸、5-羥甲基-2-呋喃甲醛有較強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶抑制活性，抑制率與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，兩者和阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率分別為55.46%、68.77%、91.72%，其IC50值分別為(0.090±0.029)、(0.002±0)、(0.105±0.013)mg/mL。

圖1 各化合物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制率

圖2 各化合物反應(yīng)時(shí)間-酶活性曲線

3.2 酶抑制動(dòng)力學(xué) 由圖2可知，2個(gè)化合物質(zhì)量濃度在0.5 mg/mL時(shí)，酶活性抑制率在1 min內(nèi)達(dá)到峰值，隨后下降。由圖3～5可知，隨著抑制濃度增加，2個(gè)化合物、阿卡波糖直線斜率逐漸減小，表明酶活力降低是由于酶活力受到影響，與酶量減少無關(guān)，即三者均為可逆性抑制。由圖6～8可知，反應(yīng)體系中改變抑制劑濃度基本上沒有改變Vmax，表明2個(gè)化合物、阿卡波糖對(duì)酶均呈現(xiàn)競(jìng)爭(zhēng)性抑制。

圖3 原兒茶酸酶量-反應(yīng)速率曲線

圖4 5-羥甲基-2-呋喃甲醛酶量-反應(yīng)速率曲線

圖5 阿卡波糖酶量-反應(yīng)速率曲線

圖6 原兒茶酸酶動(dòng)力學(xué)抑制曲線

圖7 5-羥甲基-2-呋喃甲醛酶動(dòng)力學(xué)抑制曲線

圖8 阿卡波糖酶動(dòng)力學(xué)抑制曲線

4 討論

本實(shí)驗(yàn)采用體外α-葡萄糖苷酶抑制試驗(yàn)對(duì)江南星蕨中原兒茶酸、5-羥甲基-2-呋喃甲醛進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明這2種化合物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制具有較好的功效，且抑制率隨質(zhì)量濃度的增加而逐漸增大，呈濃度依賴性。通過酶動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，其作用機(jī)制與阿卡波糖相似，都呈可逆競(jìng)爭(zhēng)性抑制。

目前臨床應(yīng)用人工合成的AGIs藥物大多存在一定的腎毒性，因此，從天然產(chǎn)物中篩選更安全、有效的AGIs對(duì)糖尿病新藥的研發(fā)具有重要的價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)江南星蕨中原兒茶酸、5-羥甲基-2-呋喃甲醛具有降低α-葡萄糖苷酶活性的作用，為江南星蕨進(jìn)一步的研究與開發(fā)提供驗(yàn)依據(jù)。