楊福紅， 趙 鑫， 王 盼， 劉 東， 陳紅剛， 王惠珍， 杜 弢*

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)和政藥用植物園，甘肅 和政 731200；2.平?jīng)鍪修r(nóng)業(yè)科學(xué)院，甘肅 平?jīng)?744000；3.西北中藏藥協(xié)同創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730000)

菘藍IsatisindigoticaFort.是十字花科菘藍屬兩年生草本植物，野生種質(zhì)資源難以找到，故對各地栽培種群的保護利用尤為重要[1]。目前，有關(guān)菘藍種質(zhì)資源、板藍根質(zhì)量評價方面的研究較多，前者主要采用農(nóng)學(xué)、分子生物學(xué)、中藥化學(xué)等方法[2-5]，而后者包括傳統(tǒng)鑒別法、顯微鑒別法、藥用成分含量比較法、指紋圖譜法、重金屬、農(nóng)藥殘留等多種手段[4-8]，但均存在一定的片面性，難以全面客觀地進行綜合評價。

近年來，灰色關(guān)聯(lián)度分析、DTOPSIS法廣泛應(yīng)用于作物品種、種質(zhì)資源評價[9-18]，前者能從事物發(fā)展趨勢的整體進行分析，將影響結(jié)果的各評價指標合一后進行評價，可更客觀確定其權(quán)重，也更接近真實情況[9-12]；后者依據(jù)評價對象最優(yōu)解與最劣解的距離進行排序，即最接近最優(yōu)解的最優(yōu)，最接近最劣解的最差，但缺點是各性狀指標權(quán)重受主觀因素影響太大，兩者聯(lián)用可同時綜合農(nóng)學(xué)、藥學(xué)多種指標，更全面有效地評價種質(zhì)資源[13-17]。本實驗測定菘藍農(nóng)學(xué)性狀和板藍根中主要成分含量，并聯(lián)合應(yīng)用灰色關(guān)聯(lián)度分析與DTOPSIS法對該種質(zhì)資源進行綜合評價，以期為構(gòu)建中藥材種質(zhì)資源綜合評價模型提供參考依據(jù)。

1 材料

27份菘藍種質(zhì)資源由平?jīng)鍪修r(nóng)科院提供，經(jīng)專家鑒定為正品，具體見表1。

表1 種質(zhì)資源信息

2 方法

2.1 農(nóng)藝指標測定 采用隨機區(qū)組設(shè)計，無重復(fù)，每份資源種植1個小區(qū)，小區(qū)面積為3.5 m2(長3.5 m，寬1 m)，于2019年4月24日播種，播種量為10 g，行距30 cm，10月下旬對27份種質(zhì)資源進行農(nóng)藝性狀的調(diào)查和產(chǎn)量測定，每份選取10株，指標包括株高、株幅、葉片大小、葉片數(shù)、單株葉重、根長、根粗、單株根重、側(cè)根數(shù)、側(cè)根重，收獲后測量葉、根產(chǎn)量。

2.2 含量測定 參照柴俊雯[7]、張劍光[8]等報道加以完善，采用HPLC法測定板藍根中尿苷、鳥苷、(R,S)-告依春、腺苷含量。

2.2.1 色譜條件 Agilent C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動相水(A)-甲醇(B)，梯度洗脫(0～10 min, 10%B; 10～15 min, 17%B; 15～20 min, 20%B; 20～25 min, 20%B; 25～30 min, 25%B; 30～35 min, 30%B; 35～37 min, 35%B; 37～45 min, 30%B; 45～50 min, 10%B; 50～60 min, 10%B)；體積流量1.0 mL/min；檢測波長254 nm；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。色譜圖見圖1。

1.尿苷 2.鳥苷 3.(R,S)-告伊春 4.腺苷1.uridine 2.guanosine 3.(R,S)-goitrin 4.adenosine圖1 各成分HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取尿苷、鳥苷、(R,S)-告依春、腺苷對照品適量，加水定容至10 mL棕色量瓶中，超聲處理5 min，制成質(zhì)量濃度分別為0.072 4、0.069 0、0.206 0、0.035 95 mg/mL的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液制備 將板藍根粉碎后過3號篩，精密稱取1 g，加50 mL水至150 mL具塞錐形瓶中，稱定質(zhì)量，超聲處理50 min，加水補足減失的質(zhì)量，取上清液，0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2.4 方法學(xué)考察 線性關(guān)系考察結(jié)果見表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。取同一對照品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定6次，測得尿苷、鳥苷、(R,S)-告依春、腺苷峰面積RSD分別為0.42%、0.44%、0.39%、0.47%，表明儀器精密度良好。取同一份供試品溶液，于0、2、4、8、12、24、36 h在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定7次，測得尿苷、鳥苷、(R,S)-告依春、腺苷峰面積RSD分別為1.04%、1.33%、2.89%、1.13%，表明溶液在36 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。取同一批樣品1 g，共5份，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，測得尿苷、鳥苷、(R,S)-告依春、腺苷峰面積RSD分別為1.29%、0.77%、2.52%、0.81%，表明該方法重復(fù)性良好。精密稱取各成分含量已知的同一批樣品9份，分別按80%、100%、120%水平精密加入對照品溶液，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，測得尿苷、鳥苷、(R,S)-告依春、腺苷平均加樣回收率分別為97.00%、98.32%、97.59%、96.84%，RSD分別為2.06%、3.50%、1.85%、2.20%。

表2 各成分線性關(guān)系

3 結(jié)果

結(jié)果，各性狀指標的權(quán)重依次為鳥苷含量>尿苷含量>根長>側(cè)根高>葉長>株幅>葉片數(shù)>根粗>株高>(R,S)-告依春含量>葉產(chǎn)量>腺苷含量>側(cè)根數(shù)>根產(chǎn)量>單株根重>葉寬>單株葉重>側(cè)根重，見表4。

表3 各種質(zhì)資源性狀指標

表4 性狀指標灰色關(guān)聯(lián)度及關(guān)聯(lián)序

表5 DTOPSIS法結(jié)果

由此可知，Ci值前五位的為河北2018-1、2008-11、2008-6-2、隆德菘藍、張掖菘藍；加權(quán)關(guān)聯(lián)度值排名前五位的為2008-6-2、河北2018-1、2008-11、2015-2-3、楊凌菘藍；板藍根產(chǎn)量排名前五位的為2008-11、楊凌菘藍、河北菘藍、2008-6-2、張掖菘藍；(R,S)-告依春含量排名前五位的為2008-6-6-1-1、 2008-11、楊凌誘變1、2008-10、2015-2-3，表明依據(jù)加權(quán)關(guān)聯(lián)度、Ci值的排列順序在整體上變化不大，而依據(jù)板藍根產(chǎn)量或(R,S)-告依春含量時變化較大，故灰色關(guān)聯(lián)度分析結(jié)合DTOPSIS法的評價效果比僅依靠產(chǎn)量或藥用成分更全面可靠。另外，河北2018-1、2008-11、2008-6-2 3種種質(zhì)資源的綜合表現(xiàn)較好，可作為育種材料或優(yōu)良品系。

3.3 聚類分析 采用DPS軟件對27份種質(zhì)資源的Ci值、加權(quán)關(guān)聯(lián)度進行聚類分析，結(jié)果見圖2～3，發(fā)現(xiàn)均可分為4類，并且除河北菘藍外聚類情況一致，但排列順序有變化，綜合表現(xiàn)依次為A類>B類>C類>D類。

圖2 Ci值聚類分析Fig.2 Cluster analysis for Ci values

4 討論

單獨應(yīng)用灰色關(guān)聯(lián)度分析或DTOPSIS法在農(nóng)作物的種質(zhì)資源評價和品種比較中應(yīng)用較多[15-24]，單獨利用DTOPSIS法在評價種質(zhì)資源或品種時，在確定各性狀的權(quán)重時常依靠經(jīng)驗進行人為的賦值權(quán)重，造成評價結(jié)果受主觀因素影響較大[12-15]?；疑P(guān)聯(lián)度分析能夠從整體出發(fā)，通過對數(shù)據(jù)的標準化處理和構(gòu)建理想品種，從而確定各性狀的權(quán)重，克服了人為因素的影響。近年來，結(jié)合兩種方法在農(nóng)作物種質(zhì)資源評價和品種比較中應(yīng)用提高了分析結(jié)果的可靠性和全面性[18-24]。本試驗利用灰色關(guān)聯(lián)度和DTOPSIS法對27份菘藍種質(zhì)資源進行綜合評價，克服了單一依靠產(chǎn)量，或某一種或幾種藥用成分含量作為評價指標單一性、片面性和主觀性，其評價結(jié)果更加客觀公正。為菘藍種質(zhì)資源的綜合評價提供了一種新的思路和方法。通過對27份菘藍種質(zhì)資源的綜合評價，篩選出優(yōu)質(zhì)育種材料河北2018-1、2008-11和2008-6-2，可作為育種材料或優(yōu)良品系生產(chǎn)上使用，同時為中藥材種質(zhì)資源綜合評價提供新的思路和方法。因試驗對種質(zhì)資源的指標測定不夠全面，特別是對抗病性、生育期、抗凍性等指標未測定，對試驗結(jié)果有一定程度的影響，在以后的試驗中進一步完善，為育種提供更加可靠的評價依據(jù)。