裴文濤， 侯 靜

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000)

銀屑病是一種常見(jiàn)的慢性炎癥性皮膚病，世界發(fā)病率約為2%[1]，我國(guó)約為0.5%[2]，臨床分型以尋常型為主，約占90%[3]，主要特征為白色鱗片覆蓋的紅斑斑塊、皮損、瘙癢[4]，病因主要包括遺傳、感染、免疫異常、內(nèi)分泌因素[5]。本病屬于慢性復(fù)發(fā)性疾病，需長(zhǎng)期治療，相關(guān)藥物包括甲氨蝶呤、環(huán)孢素A、阿維A、生物制劑、類(lèi)固醇等[6]，但均存在顯著的骨髓抑制、肝功能異常、代謝紊亂等嚴(yán)重不良反應(yīng)，從而限制了其臨床應(yīng)用[5]。因此，挖掘不良反應(yīng)較少的新型藥物對(duì)于銀屑病的治療意義深遠(yuǎn)。

Th17/Treg平衡在銀屑病的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，常作為本病治療靶點(diǎn)[7]。射干麻黃湯可通過(guò)下調(diào)Th2/Th17細(xì)胞，上調(diào)CD4+FoxP3+Tregs，改善哮喘氣道高反應(yīng)[8]，但對(duì)銀屑病的治療作用尚不清楚。射干苷是一種提取自射干的異黃酮類(lèi)衍生物，具有多種生物活性，對(duì)哮喘、扁桃體炎、其他炎癥性疾病均具有較好療效[9]，表現(xiàn)出顯著的抗炎和抗氧化活性[10-12]，本研究將對(duì)該成分干預(yù)銀屑病的藥效和分子機(jī)制進(jìn)行探索，以期為挖掘相關(guān)有效藥物提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 50只SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量(180±10)g，購(gòu)自蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(甘)2018-0002，飼養(yǎng)于SPF及環(huán)境，溫度控制在25 ℃，晝夜周期12 h/12 h，自由飲食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑與藥物 5%咪喹莫特乳膏(珠海聯(lián)邦制藥股份有限公司，批號(hào)8020750)；甲氨蝶呤(上海上藥信誼藥廠有限公司，批號(hào)036170804)。射干苷對(duì)照品(純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)B21608)。HE染色試劑盒、RIPA裂解液、5×上樣緩沖液、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)分別為G1120、R0010、P1040、P1200、PC0020)；小鼠Th17/Treg檢測(cè)試劑盒(美國(guó)BD公司，批號(hào)560767)；小鼠TNF-α、IL-6、IL-10 ELISA檢測(cè)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號(hào)ml002095、ml063159、ml037873)；SP免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)SP9001)；RNAiso plus、Mir-X miRNA qRT-PCR TB Green? Kit、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(日本TaKaRa公司，批號(hào)分別為9108、638314、RR047A、RR420Q)；JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(英國(guó)Abcam公司，批號(hào)分別為ab158096、ab235946、ab32101、ab76315、ab194583、ab7090、ab97040)；鼠抗Bax多克隆抗體(杭州華安生物技術(shù)有限公司，批號(hào)ER0907)。

2 方法

2.1 分組與造模 50只小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、甲氨蝶呤組及低、高劑量射干苷組，每組10只，脫去2 cm×2 cm背部毛，正常組于脫毛處涂抹凡士林，其余各組涂抹咪喹莫特乳膏，每次10 mg，每天2次，連續(xù)14 d。

2.2 給藥方法 造模成功后，甲氨蝶呤組小鼠灌胃2.5 mg/kg甲氨蝶呤，高、低劑量射干苷組小鼠分別灌胃10、2.5 mg/kg射干苷，正常組、模型組小鼠均灌胃等容量生理鹽水，連續(xù)30 d。

2.3 皮損程度評(píng)估 參考文獻(xiàn)[13]報(bào)道，于造模第0、3、7、10、14天及干預(yù)第0、5、10、15、20、25、30天對(duì)小鼠紅斑、鱗屑、浸潤(rùn)增厚程度(紅斑向周?chē)?rùn)，皮膚增厚)進(jìn)行評(píng)分，三者總和即為小鼠皮損嚴(yán)重程度評(píng)分，標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1 皮損程度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

2.4 樣本收集 小鼠皮下注射2.5%戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，心臟取血，每組取5只小鼠血液，采用EDTA抗凝管收集，用于外周血Th17、Treg細(xì)胞比例的檢測(cè)；另取5只小鼠血液，采用普通采血管收集，離心后得血清，用于TNF-α、IL-6、IL-10水平的檢測(cè)。采血完成后，頸椎脫臼處死小鼠，取下皮損區(qū)皮膚，分成若干等份，一份置于4%多聚甲醛進(jìn)行固定，其余液氮中速凍后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱中保存。

2.5 HE染色觀察皮膚組織病理變化 取4%多聚甲醛固定的小鼠皮膚組織，石蠟包埋、切片，依次進(jìn)行二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，蘇木素染色5 min，水洗10 min，1%鹽酸乙醇分化30 s，水洗30 s，伊紅染色2 min，水洗后梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察。

2.6 免疫組化法檢測(cè)皮膚組織中Bax、Bcl-2和Ki67蛋白表達(dá) 取“2.5”項(xiàng)下小鼠皮膚組織切片，脫蠟水化后微波-酸修復(fù)抗原，隨后H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，山羊血清封閉，一抗4 ℃孵育過(guò)夜，生物素標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，HRP標(biāo)記的鏈霉素37 ℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木素染色，鹽酸乙醇分化，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，在顯微鏡下觀察。

2.7 ELISA法檢測(cè)血清TNF-α、IL-6、IL-10水平 從-80 ℃冰箱中取出小鼠血清，室溫融化后按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)TNF-α、IL-6、IL-10水平。

2.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血中Th17/Treg細(xì)胞比例 取“2.4”項(xiàng)下小鼠全血，加入紅細(xì)胞裂解液，按照小鼠Th17/Treg檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)Th17/Treg細(xì)胞比例。

2.9 RT-qPCR法檢測(cè)皮膚組織中miRNA-204-5p、JAK2、STAT3 mRNA表達(dá) 取“2.4”項(xiàng)下保存于-80 ℃的小鼠皮膚組織，加入液氮，置于研缽中充分研碎，采用Trizol法提取總RNA，其中JAK2、STAT3 mRNA表達(dá)的檢測(cè)按照常規(guī)操作進(jìn)行，總RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后，所得cDNA按照熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)；miRNA-204-5p的檢測(cè)按照加尾法進(jìn)行，2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)。引物序列見(jiàn)表2。

表2 引物序列

2.10 Western blot法檢測(cè)皮膚組織中Bax、Bcl-2、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá) 取“2.9”項(xiàng)下研碎的小鼠皮膚組織，加入RIPA裂解液(含1 mmol/L PMSF)，轉(zhuǎn)移至勻漿器中，繼續(xù)在冰上充分研磨裂解20 min，轉(zhuǎn)移至EP管中，10 000×g離心15 min，取上清，即得總蛋白，取20 μL蛋白樣本用于BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，其余樣本加入5×上樣緩沖液，煮沸5 min變性，SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，封閉，孵育一抗、二抗，ECL發(fā)光液顯影，自動(dòng)曝光儀曝光，采集圖片，分析灰度值。

3 結(jié)果

3.1 造模及射干苷干預(yù)對(duì)銀屑病小鼠皮損程度的影響 如圖1A所示，隨著造模天數(shù)的增加，正常組小鼠皮損程度無(wú)明顯變化，均處于正常水平；模型組小鼠皮損程度逐漸增加，至造模結(jié)束后皮膚損傷均已達(dá)到相關(guān)要求。如圖1B所示，隨著干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)，正常組小鼠皮損程度無(wú)明顯變化，均處于正常水平；模型組小鼠皮損程度逐漸有略微恢復(fù)趨勢(shì)，但直至干預(yù)結(jié)束均處于高損傷狀態(tài)；低、高劑量射干苷組及甲氨蝶呤組均可對(duì)銀屑病模型小鼠皮損有治療作用，皮膚損傷逐漸恢復(fù)，治療效果依次為甲氨蝶呤>高劑量射干苷>低劑量射干苷。

3.2 射干苷改善銀屑病小鼠皮膚病理?yè)p傷 如圖2所示，正常組小鼠皮膚結(jié)構(gòu)完整，表皮未見(jiàn)角化過(guò)度和角化不全，表皮顆粒層清晰，真皮周?chē)鸁o(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；與正常組比較，模型組小鼠表皮層不同程度角化過(guò)度，棘層肥厚，真皮層內(nèi)血管擴(kuò)張充血、新生血管增多、水腫伴炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；射干苷干預(yù)后，銀屑病小鼠皮膚組織過(guò)度角化或角化不足被校正，角質(zhì)層破損程度減輕，棘層增厚被緩解，真皮內(nèi)新生血管和浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞數(shù)量減少，炎癥反應(yīng)緩解，并呈劑量依賴性；高劑量射干苷組與甲氨蝶呤組的效果幾乎一致。

圖1 造模及射干苷干預(yù)對(duì)銀屑病小鼠皮損程度評(píng)分的影響Fig.1 Effects of modeling and tectoridin intervention on the scores of skin lesions in mice with psoriasis

圖2 射干苷對(duì)銀屑病小鼠皮膚病理?yè)p傷的影響(×200)Fig.2 Effects of tectoridin on skin pathological injury in mice with psoriasis(×200)

注：A為Bax、Bcl-2、Ki67蛋白免疫組化染色圖(×200)，B～D分別為Bax、Bcl-2、Ki67蛋白免疫組化灰度值半定量分析。與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01。圖3 射干苷對(duì)銀屑病小鼠皮損區(qū)皮膚基底層和棘層細(xì)胞增殖的影響Fig.3 Effects of tectoridin on cell proliferation of basal layer and spinous layer in psoriatic skin lesions of

3.3 射干苷對(duì)銀屑病小鼠皮損區(qū)皮膚基底層和棘層細(xì)胞增殖的影響 如圖3所示，與正常組比較，模型組小鼠皮損區(qū)表皮層細(xì)胞Bax表達(dá)降低(P<0.01)，Bcl-2、Ki67表達(dá)升高(P<0.01)；與模型組比較，甲氨蝶呤組和各劑量射干苷組小鼠皮損區(qū)表皮層細(xì)胞Bax表達(dá)升高(P<0.01)，Bcl-2、Ki67表達(dá)降低(P<0.01)，并呈劑量依賴性。

3.4 射干苷減輕銀屑病小鼠炎癥反應(yīng)

3.4.1 血清TNF-α、IL-6、IL-17A水平 如圖4所示，與正常組比較，模型組小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-17A水平均升高(P<0.01)；與模型組比較，甲氨蝶呤組、各劑量射干苷組小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-17A水平均降低(P<0.01)，并呈劑量依賴性。

注：與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01。圖4 射干苷對(duì)銀屑病小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-17A水平的影響Fig.4 Effects of tectoridin on serum TNF-α, IL-6 and IL-17A levels in mice with

注：A為流式檢測(cè)結(jié)果圖，B～D分別為T(mén)reg、Th17、Th17/Treg細(xì)胞比例統(tǒng)計(jì)圖。與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01。圖5 射干苷對(duì)銀屑病小鼠外周血Th17/Treg比例的影響Fig.5 Effects of tectoridin on ratios of Th17/Treg in peripheral blood of mice with psoriasis

3.4.2 外周血Th17/Treg比例 如圖5所示，與正常組比較，模型組小鼠外周血Th17細(xì)胞及Th17/Treg比例升高(P<0.01)，Treg細(xì)胞比例降低(P<0.01)；與模型組比較，甲氨蝶呤組、各劑量射干苷組小鼠外周血Th17細(xì)胞及Th17/Treg比例降低(P<0.01)，Treg細(xì)胞比例升高(P<0.01)，并呈劑量依賴性。

3.5 射干苷促進(jìn)銀屑病小鼠皮膚組織中miRNA-204-5p表達(dá)并抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路的激活

3.5.1miRNA-204-5p、JAK2、STAT3 mRNA表達(dá)

如圖6所示，與正常組比較，模型組小鼠皮膚組織中miRNA-204-5p表達(dá)降低(P<0.01)，JAK2、STAT3 mRNA表達(dá)升高(P<0.01)；與模型組比較，甲氨蝶呤組、各劑量射干苷組小鼠皮膚組織中miRNA-204-5p表達(dá)升高(P<0.01)，JAK2、STAT3 mRNA表達(dá)降低(P<0.01)，并呈劑量依賴性。

注：與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01。圖6 射干苷對(duì)銀屑病小鼠皮膚組織中miRNA-204-5p、JAK2、STAT3 mRNA表達(dá)的影響Fig.6 Effects of tectoridin on mRNA expressions of miRNA-204-5p,JAK2 and STAT3 in skin tissues of mice with psoriasis

注：A為蛋白條帶圖，B為蛋白相對(duì)表達(dá)統(tǒng)計(jì)圖。與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01。圖7 射干苷對(duì)銀屑病小鼠皮膚組織中JAK2/STAT3通路蛋白表達(dá)的影響Fig.7 Effects of tectoridin on protein expressions of JAK2/STAT3 pathway in skin tissues of mice with psoriasis

3.5.2 JAK2/STAT3通路蛋白表達(dá) 如圖7所示，與正常組比較，模型組小鼠皮損區(qū)皮膚組織中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)升高(P<0.01)；與模型組比較，甲氨蝶呤組、各劑量射干苷組小鼠皮損區(qū)皮膚組織中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)降低(P<0.01)，并呈劑量依賴性。

4 討論

本研究發(fā)現(xiàn)射干苷可改善銀屑病小鼠的皮損區(qū)皮膚損傷癥狀，抑制皮損區(qū)炎癥，校正紊亂的皮膚結(jié)構(gòu)；可抑制銀屑病小鼠皮損區(qū)生發(fā)層細(xì)胞中Ki67及Bcl-2蛋白的高表達(dá)，提高Bax蛋白的低表達(dá)。Ki67是一種增殖細(xì)胞的相關(guān)抗原，可作為細(xì)胞增殖的標(biāo)志物，已有研究發(fā)現(xiàn)在銀屑病皮損區(qū)角質(zhì)層細(xì)胞和生發(fā)層細(xì)胞中Ki67異常高表達(dá)[14-15]，可作為銀屑病表皮細(xì)胞增殖的標(biāo)志物。Bcl-2/Bax比例變化直接影響線粒體膜的通透性，進(jìn)而決定細(xì)胞的凋亡，Bcl-2/Bax比例降低，通透性升高，促進(jìn)凋亡[16-17]。本研究結(jié)果提示射干苷可抑制生發(fā)層細(xì)胞異常增殖，改善生發(fā)層細(xì)胞增殖與凋亡之間的平衡，使細(xì)胞增殖回歸正常，進(jìn)而改善銀屑病。

目前，研究發(fā)現(xiàn)在銀屑病中，角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖異常與其所處免疫微環(huán)境中免疫異常密切相關(guān)[18]，TNF-α、IL-6、IL-17A異常高表達(dá)，可激活角質(zhì)形成細(xì)胞中與增殖、分化、凋亡以及炎癥反應(yīng)相關(guān)的信號(hào)通路[19-22]，而這些通路的激活又進(jìn)一步促進(jìn)炎癥因子的釋放以及T淋巴細(xì)胞的激活，形成惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞增殖異常，形成銀屑病[18, 23]。本研究發(fā)現(xiàn)射干苷可降低銀屑病小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-17A水平，改善銀屑病小鼠皮損區(qū)皮膚免疫微環(huán)境。在銀屑病皮膚中，IL-17A導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，改變其分化[23]；IL-6和TNF-α表達(dá)的升高誘導(dǎo)T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化，改變Th17/Treg平衡，進(jìn)一步促進(jìn)IL-17A的表達(dá)[24]。本研究發(fā)現(xiàn)射干苷可降低Th17/Treg比例，抑制銀屑病小鼠皮損區(qū)炎癥反應(yīng)，對(duì)銀屑病小鼠具有治療作用。

JAK2/STAT3信號(hào)通路在角質(zhì)形成細(xì)胞中異常激活，促進(jìn)相關(guān)炎癥因子的產(chǎn)生，調(diào)控T細(xì)胞功能分化[25]；同時(shí)CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化過(guò)程中，IL-6和IL-21通過(guò)激活T細(xì)胞中JAK2/STAT3信號(hào)通路促進(jìn)該分化過(guò)程[20]。本研究發(fā)現(xiàn)射干苷可抑制銀屑病小鼠皮損區(qū)皮膚組織中JAK2和STAT3的表達(dá)，同時(shí)抑制二者蛋白的磷酸化水平，通過(guò)抑制銀屑病中JAK2/STAT3信號(hào)通路的異常激活，使炎癥反應(yīng)回歸正常。本課題組前期實(shí)驗(yàn)通過(guò)TargetScan軟件發(fā)現(xiàn)miRNA-204-5p可靶向JAK2 mRNA的3′-UTR，形成8mer聚合物，誘導(dǎo)JAK2 mRNA翻譯中止和降解。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)射干苷可促進(jìn)銀屑病小鼠皮損區(qū)皮膚組織中miRNA-204-5p表達(dá)的上調(diào)。

綜上所述，射干苷可提高銀屑病小鼠皮損區(qū)皮膚組織中miRNA-204-5p表達(dá)，抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路的異?；罨瑴p輕炎癥反應(yīng)，進(jìn)而通過(guò)平衡角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖與凋亡，改善銀屑病小鼠皮膚癥狀。本研究為射干苷在臨床治療銀屑病的應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)。