張菲菲， 成 芳， 馬紅芬， 康利娜， 賈碧紅， 安 紅

(邢臺(tái)市人民醫(yī)院，河北 邢臺(tái) 054000)

川崎病是兒童時(shí)期常見(jiàn)的一種急性自限性血管炎，一般指黏膜皮膚淋巴結(jié)綜合癥，常見(jiàn)臨床表現(xiàn)有發(fā)熱、皮疹、眼結(jié)合膜充血、頸部非膿性淋巴結(jié)腫大等。調(diào)查顯示，我國(guó)川崎病的發(fā)病率約為51/100 000，主要發(fā)生于5歲以?xún)?nèi)嬰幼兒[1]，大多呈自限性，但仍有20%～25%可并發(fā)嚴(yán)重的心血管病，甚至引發(fā)心力衰竭[2]。因此，降低川崎病患兒冠脈并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)，保護(hù)其冠脈組織意義重大。

丙種球蛋白(IVIG)是川崎病常用的治療藥物，效果確切，并對(duì)冠脈損傷有一定的保護(hù)作用，但在并發(fā)冠脈損傷的川崎病患兒中IVIG的效果不理想[3]。黃芪甲苷可保護(hù)大鼠冠脈組織，減輕炎癥浸潤(rùn)[4]，但各成分是否可減輕川崎病患者的冠脈損傷尚不明確。白介素-35(IL-35)可調(diào)控Janus激酶1(JAK1)/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子1(STAT1)通路參與川崎病所致的冠脈損傷，它屬于免疫負(fù)調(diào)控分子，可增加JAK1、STAT1及其磷酸化表達(dá)，參與炎癥反應(yīng)，誘發(fā)冠脈組織炎癥浸潤(rùn)[5-7]。因此，本研究建立C57BL/6小鼠川崎病冠脈損傷模型，探討黃芪甲苷是否通過(guò)調(diào)控該信號(hào)通路來(lái)減輕川崎病所致的冠脈損傷。

1 材料

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)C57BL/6小鼠58只，雌雄各半，4～6周齡，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(滬)2020-0002。

1.2 試劑與藥物 干酪乳桿菌細(xì)胞壁提取物(湖南朗林生物資源股份有限公司，批號(hào)R1912105)；黃芪甲苷對(duì)照品(純度≥99.6%，成都科程生物科技開(kāi)發(fā)有限公司，批號(hào)201910145)；IVIG(成都蓉生藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)201908A103)。鼠IL-35、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑盒(上海信帆生物科技公司，批號(hào)RS1811102、RS1905137、R1904126)；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司，批號(hào)201907A)；原位末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)試劑盒(瑞士Roche公司，批號(hào)AR1904135007)；Trizol溶液(美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào)1907125003)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(德國(guó)Qiagen公司，批號(hào)R1812102C)；細(xì)胞裂解液(上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)CL18350)；蛋白質(zhì)提取試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)有限公司，批號(hào)P190115)；十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠(上海聯(lián)邁生物工程有限公司，批號(hào)1910117)；兔單克隆抗體IL-35、JAK1、STAT1、p-STAT1，酶標(biāo)記的羊多克隆抗體IL-35、JAK1、STAT1、p-STAT1[艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司，批號(hào)R19101、R19072、R19038、R19041、R19117、R19091、R19108、R19026]。

1.3 儀器 FA-1 A型勻漿機(jī)(江蘇盛藍(lán)儀器制造有限公司)；TG22-WS型醫(yī)用離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘銳離心機(jī)有限公司)；JB-5C型光學(xué)顯微鏡(上海光學(xué)儀器廠(chǎng))；SP-723型分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司)；9700型聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀(美國(guó)ABI公司)；SE 600X Chroma型電泳儀(美國(guó)Hofer公司)；170-3940型轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；FluorChem R型號(hào)凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó)ProteinSimple公司)。

2 方法

2.1 建模、分組及給藥 參照川崎病冠脈損傷建模操作規(guī)程[8]，50只C57BL/6小鼠單次腹腔注射0.5 mg干酪乳桿菌細(xì)胞壁提取物，第5天按照文獻(xiàn)[8]標(biāo)準(zhǔn)判斷是否建模成功。將建模成功的小鼠隨機(jī)分為模型組、IVIG組及黃芪甲苷低、中、高劑量，另取8只小鼠作為對(duì)照組，IVIG組腹腔注射2 mg/g IVIG(臨床等效劑量)，黃芪甲苷低、中、高劑量組分別腹腔注射0.25、0.5、1.0 mg/kg黃芪甲苷(分別為臨床等效劑量的1/2、臨床等效劑量、臨床等效劑量的2倍)，對(duì)照組、模型組均腹腔注射等容量生理鹽水，于建模成功并分組后當(dāng)天開(kāi)始給藥，每天1次，連續(xù)1周。

2.2 ELISA法檢測(cè)血清及心臟組織IL-35、TNF-α、IL-6水平 小鼠斷頭取血，3 000 r/min離心15 min(離心半徑8 cm)，取上清，即得血清；迅速剝離心臟，洗凈后取心臟組織進(jìn)行勻漿，12 000 r/min離心10 min(離心半徑10 cm)，取上清液，即得心臟組織勻漿液，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)小鼠血清和心臟組織IL-35、TNF-α、IL-6水平。

2.3 HE染色觀(guān)察冠脈病變情況 取小鼠冠脈組織，經(jīng)固定、沖洗、脫水、包埋、切片、攤片、烤片、脫蠟后采用蘇木素染色10 min，鹽酸乙醇分化3～5 s，飽和碳酸鋰返藍(lán)，伊紅復(fù)染，最后中性樹(shù)膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察。

2.4 TUNEL法檢測(cè)冠脈組織細(xì)胞凋亡率 按“2.3”項(xiàng)下方法制作組織切片，于脫蠟后加入蛋白酶K工作液，在37 ℃下反應(yīng)30 min，室溫固定30 min，按照TUNEL試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，棕黃色染色的細(xì)胞為冠脈組織凋亡細(xì)胞，隨機(jī)選取5個(gè)不重復(fù)視野計(jì)算凋亡細(xì)胞占比，即為冠脈組織細(xì)胞凋亡率。

2.5 RT-qPCR法檢測(cè)冠脈組織IL-35、JAK1、STAT1 mRNA表達(dá) 小鼠冠脈組織液氮研磨后按Trizol法提取總RNA，分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度，鑒定純度，以1.8～2.0為合格，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR反應(yīng)體系為95 ℃ 30 s，95 ℃ 60 s，74 ℃ 90 s，70 ℃ 20 s，共35個(gè)循環(huán)，最后52 ℃ 10 min。以β-actin為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量，參照NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)設(shè)計(jì)引物序列，IL-35正向5′-TCGTATAGGCTTATAGCTATG-3′，反向5′-AGGCTAGAGGGAGAGCTTAG-3′，預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度240 bp；JAK1正向5′-CTGAGATTGAGAGGAGGTTA-3′，反向5′-GAGATC TCGAGAGGAGGCTATAGCTAG-3′，預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度320 bp；STAT1正向5′-CGCGATATATGCG GCGCGATATGC-3′，反向5′-GAGAGCTTAGGAGAG CTAG-3′，預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度256 bp；β-actin正向5′-AGGACTCTTAGAGCTAG-3′，反向5′-TAGAGC TTTCTAGAGCTAG-3′，預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度180 bp，委托寶生物工程(大連)有限公司合成。

2.6 Western blot法檢測(cè)冠脈組織IL-35、JAK1、STAT1、p-STAT1蛋白表達(dá) 小鼠冠脈組織液氮研磨后用磷酸鹽緩沖液沖洗，2 000 r/min離心10 min(離心半徑8 cm)，沉淀物中加入裂解液提取蛋白，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉，加入兔抗IL-35、JAK1、STAT1、p-STAT1單克隆抗體(1∶2 000、1∶1 000、1∶2 000、1∶2 000)，在4 ℃下孵育過(guò)夜，TBST緩沖液洗滌，加入酶標(biāo)記的羊抗IL-35、JAK1、STAT1、p-STAT1多克隆抗體(稀釋倍數(shù)1∶5 000、1∶10 000、1∶5 000、1∶5 000)，室溫靜置2 h，洗膜，加入化學(xué)發(fā)光液曝光顯影，采用凝膠成像分析系統(tǒng)計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)。

3 結(jié)果

3.1 造模情況 50只小鼠中48只建模成功，成功率為96.00%，分別為模型組9只、IVIG組10只、黃芪甲苷低劑量組10只、黃芪甲苷中劑量組10只、黃芪甲苷高劑量組9只，給藥期間各組小鼠均無(wú)脫落。

3.2 黃芪甲苷對(duì)小鼠血清及心臟組織IL-35、TNF-α、IL-6水平的影響 如表1所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清及心臟組織IL-35水平均降低(P<0.05)；與模型組比較，IVIG組和黃芪甲苷各劑量組血清及心臟組織IL-35水平均升高(P<0.05)，并呈劑量依賴(lài)性(P<0.05)；黃芪甲苷高劑量組小鼠血清及心臟組織IL-35水平高于IVIG組(P<0.05)。與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清及心臟組織TNF-α、IL-6水平均升高(P<0.05)；與模型組比較，IVIG組和黃芪甲苷各劑量組血清及心臟組織TNF-α、IL-6水平均降低(P<0.05)，并呈劑量依賴(lài)性(P<0.05)；黃芪甲苷高劑量組小鼠血清及心臟組織TNF-α、IL-6水平低于IVIG組(P<0.05)。

3.3 黃芪甲苷對(duì)小鼠冠脈病理變化的影響 如圖1所示，對(duì)照組小鼠冠脈組織細(xì)胞排列致密、規(guī)整，血管內(nèi)壁光滑，未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組小鼠冠脈組織細(xì)胞排列嚴(yán)重紊亂，血管內(nèi)壁極度不光滑，可見(jiàn)較多炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；黃芪甲苷低劑量組小鼠冠脈組織細(xì)胞排列明顯紊亂，血管內(nèi)壁明顯不光滑，可見(jiàn)部分炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；黃芪甲苷中劑量組和IVIG組冠脈組織細(xì)胞排列紊亂，血管內(nèi)壁不光滑，可見(jiàn)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；黃芪甲苷高劑量組冠脈組織細(xì)胞排列稍有紊亂，血管內(nèi)壁欠光滑，可見(jiàn)較少炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

3.4 黃芪甲苷對(duì)小鼠冠脈組織細(xì)胞凋亡率的影響 如表2、圖2所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠冠脈組織細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)；與模型組比較，IVIG組和黃芪甲苷各劑量組小鼠冠脈組織細(xì)胞凋亡率均降低(P<0.05)，并呈劑量依賴(lài)性；黃芪甲苷高劑量組小鼠冠脈組織細(xì)胞凋亡率低于IVIG組(P<0.05)。

表1 各組小鼠血清及心臟組織IL-35、TNF-α、IL-6水平

圖1 各組小鼠冠脈病變(HE染色，×400，50 μm)Fig.1 Mouse coronary artery lesions in each group (HE staining, ×400, 50 μm)

表2 各組小鼠冠脈組織細(xì)胞凋亡率

圖2 各組小鼠冠脈組織TUNEL染色(×400，50 μm)Fig.2 TUNEL staining of mouse coronary tissues in each group(×400, 50 μm)

3.5 黃芪甲苷對(duì)小鼠冠脈組織IL-35、JAK1、STAT1 mRNA表達(dá)的影響 如表3所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠冠脈組織IL-35 mRNA表達(dá)降低(P<0.05)；與模型組比較，IVIG組和黃芪甲苷各劑量組小鼠冠脈組織IL-35 mRNA表達(dá)均升高(P<0.05)，并呈劑量依賴(lài)性；黃芪甲苷高劑量組小鼠冠脈組織IL-35 mRNA表達(dá)高于IVIG組(P<0.05)。與對(duì)照組比較，模型組小鼠冠脈組織JAK1、STAT1 mRNA表達(dá)均升高(P<0.05)；與模型組比較，IVIG組和黃芪甲苷各劑量組小鼠冠脈組織JAK1、STAT1 mRNA表達(dá)均降低(P<0.05)，并呈劑量依賴(lài)性；黃芪甲苷高劑量組小鼠冠脈組織JAK1、STAT1 mRNA表達(dá)均低于IVIG組(P<0.05)。

3.6 黃芪甲苷對(duì)小鼠冠脈組織IL-35、JAK1、STAT1、p-STAT1蛋白表達(dá)的影響 如表4所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠冠脈組織IL-35蛋白表達(dá)降低(P<0.05)；與模型組比較，IVIG組和黃芪甲苷各劑量組小鼠冠脈組織IL-35蛋白表達(dá)均升高(P<0.05)，并呈劑量依賴(lài)性；黃芪甲苷高劑量組小鼠冠脈組織IL-35蛋白表達(dá)高于IVIG組(P<0.05)。與對(duì)照組比較，模型組小鼠冠脈組織JAK1、STAT1、p-STAT1蛋白表達(dá)均升高(P<0.05)；與模型組比較，IVIG組和黃芪甲苷各劑量組小鼠冠脈組織JAK1、STAT1、p-STAT1蛋白表達(dá)均降低(P<0.05)，并呈劑量依賴(lài)性；黃芪甲苷高劑量組小鼠冠脈組織JAK1、STAT1、p-STAT1蛋白表達(dá)高于IVIG組(P<0.05)。

表3 各組小鼠冠脈組織IL-35、JAK1、STAT1 mRNA表達(dá)

表4 各組小鼠冠脈組織IL-35、JAK1、STAT1、p-STAT1蛋白表達(dá)

4 討論

川崎病冠脈損傷的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制復(fù)雜，急性炎癥、免疫失衡、氧化應(yīng)激損傷等均可能參與川崎病并發(fā)心血管病的進(jìn)程[9-10]。在川崎病患兒急性期和亞急性期，外周血T淋巴細(xì)胞處于異常免疫激活狀態(tài)，以T細(xì)胞亞群失衡為主要表現(xiàn)，而T細(xì)胞異常激活可導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子合成和分泌紊亂，其中IL-35水平下降，TNF-α與IL-6水平則升高[11-13]。黃芪具有補(bǔ)氣固表、養(yǎng)血補(bǔ)氣、補(bǔ)中益氣等功效，具有抗氧化、減輕炎癥反應(yīng)和保護(hù)心肌組織的作用，黃芪甲苷是黃芪的主要成分，且在既往報(bào)道中發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷還可增強(qiáng)機(jī)體免疫力，調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞亞群的水平和生物學(xué)活性[14-15]。因此，本研究探討了黃芪甲苷防治川崎病冠脈損傷的作用。

IVIG屬于一種重要的免疫調(diào)節(jié)劑，可增強(qiáng)免疫力，調(diào)節(jié)免疫平衡，IVIG靜脈注射治療川崎病患兒療效確切[16]，且對(duì)冠脈損傷也有一定的防治作用，故本研究選用IVIG作為陽(yáng)性對(duì)照藥物。此外，本研究采用干酪乳桿菌細(xì)胞壁提取物腹腔注射建立川崎病冠脈損傷小鼠模型，成功率達(dá)96.00%[17]，證實(shí)采用該方法可支撐完成本次實(shí)驗(yàn)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清及心臟組織IL-35水平降低，TNF-α、IL-6水平及冠脈組織細(xì)胞凋亡率均升高，冠脈組織呈嚴(yán)重病理改變；而給予IVIG和黃芪甲苷干預(yù)后，以上指標(biāo)均有改善。提示，黃芪甲苷和IVIG均可減輕小鼠川崎病炎癥反應(yīng)和冠脈組織損傷，減少冠脈組織細(xì)胞凋亡，且高劑量黃芪甲苷的效果優(yōu)于低、中劑量黃芪甲苷和IVIG。

川崎病所致的冠脈損傷與炎癥反應(yīng)有著密切關(guān)系。IL-35屬于白介素-12家族的重要成員，可由調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞等產(chǎn)生和分泌，可抑制炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)免疫平衡，在多種炎癥與自身免疫性疾病中其水平均下降。血清IL-35水平下降很可能是癥狀性冠脈疾病的預(yù)測(cè)因子，也是冠脈心肌功能的關(guān)鍵因素[18]。在川崎病早期，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞活性下降，IL-35減少，是引發(fā)炎癥反應(yīng)、導(dǎo)致冠脈損傷的重要病因[19]。一方面，IL-35水平下降可激活JAK1/STAT1通路，增加STAT1磷酸化表達(dá)，JAK1和STAT1均有促凋亡、促炎癥作用，在冠脈炎癥損傷、冠脈細(xì)胞缺血缺氧性變性及凋亡等病理改變中均積極參與且均有較強(qiáng)的活性[20-21]。另一方面，IL-35可負(fù)向調(diào)控效應(yīng)T細(xì)胞，其水平下降可使得分泌TNF-α、IL-6等因子的免疫細(xì)胞活性增加，共同參與川崎病所致的冠脈炎及組織炎癥浸潤(rùn)[22]。本研究中顯示，模型組小鼠冠脈組織IL-35 mRNA和蛋白表達(dá)均低于對(duì)照組，p-STAT1蛋白表達(dá)及JAK1、STAT1 mRNA和蛋白表達(dá)均高于對(duì)照組；黃芪甲苷各劑量和IVIG干預(yù)后，以上指標(biāo)均有改善。提示，黃芪甲苷能夠是通過(guò)上調(diào)IL-35表達(dá)，抑制JAK1/STAT1信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，下調(diào)JAK1、STAT1、p-STAT1表達(dá)，發(fā)揮對(duì)小鼠川崎病冠脈損傷的保護(hù)作用。黃芪甲苷的作用呈劑量依賴(lài)性，且高劑量黃芪甲苷效果更優(yōu)，提示黃芪甲苷在川崎病冠脈病變防治方面有良好的價(jià)值。

綜上所述，黃芪甲苷和IVIG均可增加血清及心臟組織IL-35水平，降低TNF-α、IL-6水平，減輕炎癥反應(yīng)和冠脈組織病理改變，減少冠脈組織細(xì)胞凋亡，呈劑量依賴(lài)性，且高劑量黃芪甲苷的效果更優(yōu)。黃芪甲苷可能是通過(guò)上調(diào)IL-35表達(dá)，抑制JAK1/STAT1信號(hào)通路，下調(diào)JAK1、STAT1、p-STAT1表達(dá)，實(shí)現(xiàn)對(duì)小鼠川崎病冠脈損傷的保護(hù)作用。