陳年杰，洪裕程，沈 悅，王進(jìn)濤，鐘良軍，△

(1.杭州師范大學(xué)醫(yī)學(xué)部口腔醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 311121；2.杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)中心，浙江 杭州 310015)

缺氧是一種常見(jiàn)的致傷因素，對(duì)機(jī)體炎癥性疾病的發(fā)生、發(fā)展具有重要的調(diào)節(jié)作用。機(jī)體對(duì)炎癥組織中缺氧的適應(yīng)性反應(yīng)是通過(guò)激活和積累缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)來(lái)進(jìn)行。HIF-1α是一種異源二分轉(zhuǎn)錄因子，是在缺氧條件下可發(fā)揮生物活性的唯一一種特異性轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)控基因表達(dá)以維持氧穩(wěn)態(tài)方面起著重要作用[1]。常氧條件下，HIF-1α亞基通過(guò)細(xì)胞內(nèi)氧依賴性泛素蛋白酶快速降解。然而，在低氧條件下，HIF-1α亞基的降解被抑制，并與HIF-1β形成異源二聚體，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中調(diào)節(jié)多種基因的轉(zhuǎn)錄[2]。HIF-1α被認(rèn)為是許多疾病的影響因素，可以調(diào)節(jié)促炎基因的表達(dá)，HIF-1α蛋白在牙周炎患者牙齦組織中的表達(dá)已被證實(shí)[3]。HIF-1α與心血管疾病也有密切關(guān)系。有研究發(fā)現(xiàn)[4],HIF-1α通過(guò)使血管增生參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展，后繼研究發(fā)現(xiàn)斑塊內(nèi)新生血管生成與斑塊內(nèi)出血、破裂和炎性浸潤(rùn)密切相關(guān)。

簇狀規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列(CRISPR)/Cas9是細(xì)菌和古細(xì)菌形成的一種適應(yīng)性免疫防御，可用來(lái)對(duì)抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR/Cas9是繼鋅指核酸酶(ZFNs)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(TALENs)等基因編輯技術(shù)推出后的第三代基因編輯技術(shù)，在短短數(shù)年內(nèi)便風(fēng)靡全球,成為現(xiàn)有基因編輯和基因修飾里效率最高、最簡(jiǎn)便、成本最低、最容易上手的技術(shù)之一，也是當(dāng)今最主流的基因編輯系統(tǒng)。人胚胎腎細(xì)胞293(HEK-293細(xì)胞)具有轉(zhuǎn)染高效性、易于培養(yǎng)等特點(diǎn)，是一種常用的表達(dá)研究外源基因的細(xì)胞株。本實(shí)驗(yàn)擬利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建質(zhì)粒并敲除HEK-293細(xì)胞的HIF-1α基因，為進(jìn)一步探索和證實(shí)HIF-1α功能及后續(xù)研究打下基礎(chǔ)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料 HEK-293細(xì)胞株(CRL-1573)購(gòu)于美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)；Stbl3感受態(tài)細(xì)胞、LentiCRISPR V2質(zhì)粒(ZK611)購(gòu)于北京莊盟生物基因科技有限公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000、Opti-MEM培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)賽默飛世爾科技公司；DMEM高塘培養(yǎng)液購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；胎牛血清購(gòu)于杭州四季青生物工程材料有限公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、細(xì)胞DNA提取試劑盒購(gòu)于北京天根生化科技有限公司;BsmBI限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA Ligase、T7E1核酸內(nèi)切酶購(gòu)于美國(guó)New England Biolabs公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) mix、嘌呤霉素、Western blotting套裝、qPCR套裝購(gòu)于上海碧云天公司；HIF-1α抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶抗體購(gòu)于英國(guó)Abcam公司；引物合成委托南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行。

1.2方法

1.2.1sgRNA設(shè)計(jì)和載體構(gòu)建 利用張峰實(shí)驗(yàn)室提供的sgRNA設(shè)計(jì)網(wǎng)站(http://crispor.tefor.net/)，根據(jù)CRISPR/Cas9靶點(diǎn)設(shè)計(jì)原則，選擇符合實(shí)驗(yàn)要求的sgRNA。在正義鏈模板的5′端添加CACCG;反義鏈模板的5′端添加AAAC及3′端添加C，以便與BsmBI酶切后的線性CRISPR/Cas9質(zhì)粒載體黏性末端互補(bǔ)。根據(jù)HIF-1α蛋白的結(jié)構(gòu)域功能，設(shè)計(jì)靶向HIF-1α-Exon3的1個(gè)sgRNA(表1)，將其命名為HIF-1α-sgRNA。本研究中所設(shè)計(jì)的sgRNA序列如下。HIF-1α-sgRNA F：5′-CCA CCG TTC TTT ACT TCG CCG AGA TC-3′；HIF-1α-sgRNA R：5′-AAA CGA TCT CGG CAG AAG TAA AGA AC-3′。將序列送生物公司合成單鏈寡聚核苷酸片段(oligos)，經(jīng)退火形成雙鏈結(jié)構(gòu)片段。BsmBI限制性核酸內(nèi)切酶酶切LentiCRISPR V2載體產(chǎn)生2個(gè)末端，瓊脂糖凝膠電泳，按照瓊脂糖DNA回收試劑盒說(shuō)明回收大片段。用T4連接酶將oligos和酶切回收的線性LentiCRISPR V2載體連接，連接產(chǎn)物加入Stbl3感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)轉(zhuǎn)化、涂含氨芐抗性的平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)過(guò)夜。16 h后，挑取3個(gè)菌落進(jìn)行單克隆，置37 ℃恒溫?fù)u床擴(kuò)增。再次經(jīng)過(guò)16 h后，送部分菌液至生物公司測(cè)序驗(yàn)證，剩余菌液用質(zhì)?；厥赵噭┖刑崛【嘿|(zhì)粒。將重組質(zhì)粒命名為L(zhǎng)entiCRISPR V2-HIF-1α。

1.2.2細(xì)胞嘌呤霉素篩選濃度確定 從恒溫培養(yǎng)箱中取出融合度為70%的HEK-293細(xì)胞,沖洗,消化,離心,加入10 mL完全培養(yǎng)基重懸,細(xì)胞計(jì)數(shù)。取1塊干凈無(wú)菌的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔添加104個(gè)細(xì)胞,添加6孔，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板鋪勻細(xì)胞,然后放回細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h。第2天,配置不同濃度(0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、8.0 μg/mL)嘌呤霉素的新鮮完全培養(yǎng)基。取出培養(yǎng)24 h后的細(xì)胞,棄去原培養(yǎng)基,更換含不同濃度嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基,每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)副孔。培養(yǎng)基更換完成后將24孔板放回恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng),每天觀察,選取48 h后完全殺死HEK-293正常細(xì)胞的濃度作為嘌呤霉素篩選的最佳濃度。

表1 引物信息

圖1 sgRNA設(shè)計(jì)示意圖

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將質(zhì)粒重組LentiCRISPR V2-HIF-1α(5 μg)加入Opti-MEM培養(yǎng)基，再加入P3000試劑配置為質(zhì)?；旌弦?，最終體積為250 μL。用240 μL Opti-MEM稀釋10 μL Lipofectamine 3000，制備成Lipofectamine 3000-Opti-MEM稀釋液。將質(zhì)?；旌弦汉蚅ipofectamine 3000-Opti-MEM稀釋液充分混合，室溫下孵育5 min。隨后將轉(zhuǎn)染體系緩慢逐滴加入生長(zhǎng)狀態(tài)良好、細(xì)胞匯合度為70%～80%的HEK-293細(xì)胞中，輕輕晃動(dòng)混勻，放回二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)18 h。18 h后吸凈原培養(yǎng)基，加入DMEM完全培養(yǎng)基，繼續(xù)在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，更換含2 μg/mL puromycin的完全培養(yǎng)基，待對(duì)照組細(xì)胞完全死亡后，更換含1 μg/mL puromycin的完全培養(yǎng)基，將實(shí)驗(yàn)組陽(yáng)性細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2.4DNA提取和T7E1酶切實(shí)驗(yàn) 按照細(xì)胞DNA提取試劑盒的使用說(shuō)明提取細(xì)胞DNA，使用設(shè)計(jì)好的引物(表1)對(duì)目的片段進(jìn)行擴(kuò)增，采用瓊脂糖凝膠對(duì)擴(kuò)增的目的片段進(jìn)行回收。取PCR產(chǎn)物5 μL(300 ng)、蒸餾水3 μL、10× T7 buffer 1 μL共9 μL體系，按照95 ℃ 5 min、每秒降低2 ℃到85 ℃、每秒降低0.5 ℃到16 ℃進(jìn)行退火程序。退火完成后向退火產(chǎn)物中加入1 μL T7E1酶，混勻后37 ℃反應(yīng)20 min進(jìn)行酶切反應(yīng)，反應(yīng)完成后加入1.5 μL的0.25 mol/L乙二胺四乙酸(EDTA)終止酶切反應(yīng)。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)切割效果。利用ImageJ軟件進(jìn)行灰度分析，同時(shí)計(jì)算打靶效率，計(jì)算公式為fcut=(b+c)/(a+b+c)和indel(%)=[1-(1-fcut)1/2]×100。b和c為酶切條帶的灰度值，a為未被酶切條帶的灰度值。

1.2.5Western blotting檢測(cè) 將一定數(shù)量的正常細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)細(xì)胞接種于六孔板，待細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)，更換含200 μmol/L氯化鈷的完全培養(yǎng)基。處理8 h后，將六孔板移至冰上操作，棄去培養(yǎng)基，隨即加入200 μL聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白上樣緩沖液(1×)，用細(xì)胞刮刀反復(fù)均勻刮擦板底，使細(xì)胞充分裂解后轉(zhuǎn)移至離心管中，隨后立即放到高速離心機(jī)內(nèi)，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液。轉(zhuǎn)移至水浴鍋內(nèi)100 ℃水浴8 min。配置8%聚丙烯酰胺凝膠，上樣，80 V電泳1.5 h，然后轉(zhuǎn)膜、封閉1 h，一抗孵育過(guò)夜，TBST清洗，二抗孵育1 h，TBST再清洗，最后經(jīng)增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光顯影液在化學(xué)發(fā)光儀中顯影，檢測(cè)HIF-1α蛋白表達(dá)情況。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用ImageJ軟件進(jìn)行灰度分析，數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 7進(jìn)行繪圖及單因素方差分析(ANOVA)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1LentiCRISPR V2-HIF-1α質(zhì)粒鑒定 測(cè)序結(jié)果與所設(shè)計(jì)的sgRNA序列一致，LentiCRISPR V2-HIF-1α載體質(zhì)粒構(gòu)建成功。見(jiàn)圖2。

圖2 質(zhì)粒構(gòu)建及測(cè)序結(jié)果

2.2嘌呤霉素篩選濃度確定 HEK-293細(xì)胞在不同濃度嘌呤霉素完全培養(yǎng)基篩選48 h后,濃度大于或等于2.0 μg/mL嘌呤霉素培養(yǎng)基內(nèi)的細(xì)胞均完全死亡,而對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好。故確定嘌呤霉素水平2.0 μg/mL為細(xì)胞生長(zhǎng)的最佳篩選濃度。

2.3T7E1酶切實(shí)驗(yàn)及sgRNA打靶效率檢測(cè) 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，引物擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為759 bp，經(jīng)過(guò)T7E1酶切后，形成約250 bp的引物小片段和約500 bp的引物大片段，與設(shè)計(jì)結(jié)果一致。利用灰度分析和相關(guān)計(jì)算公式得出sgRNA的打靶效率為33.8%。

2.4Western blotting檢測(cè)HIF-1α蛋白表達(dá) 為進(jìn)一步驗(yàn)證經(jīng)過(guò)嘌呤霉素篩選后的混合細(xì)胞株HIF-1α蛋白表達(dá)情況，用200 μmol/L氯化鈷處理野生型和篩選后的混合細(xì)胞株，Western blotting結(jié)果顯示，氯化鈷可以誘導(dǎo)野生型細(xì)胞的HIF-1α表達(dá)，而經(jīng)氯化鈷誘導(dǎo)的混合細(xì)胞株HIF-1α表達(dá)明顯降低，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組的HEK-293細(xì)胞HIF-1α被成功敲低。

A：野生型PCR產(chǎn)物；B：混合細(xì)胞株P(guān)CR產(chǎn)物；M：DNA Maker。用T7E1酶切鑒定，三角形表示T7E1酶從未完全互補(bǔ)配對(duì)處切割后產(chǎn)生的2個(gè)片段。

A：用200 μmol/L氯化鈷處理野生型(HIF-1α +/+)和混合細(xì)胞株(HIF-1α +/-)8 h后，HIF-1α蛋白表達(dá)的Western blotting結(jié)果；B：ImageJ灰度分析，相對(duì)定量統(tǒng)計(jì)。**P<0.01；*P<0.05。

3 討 論

缺氧被認(rèn)為是疾病發(fā)生、發(fā)展的一個(gè)重要致病因素，HIF在調(diào)控基因表達(dá)以維持氧穩(wěn)態(tài)方面起著重要作用[5]。牙周病是一種炎癥性疾病，會(huì)導(dǎo)致牙周組織被破壞，牙根表面的牙菌斑生物膜形成是其主要病因[6]。牙周炎炎性反應(yīng)部位通常會(huì)出現(xiàn)缺氧環(huán)境，這是由于牙周組織循環(huán)障礙導(dǎo)致周圍氧氣供應(yīng)減少，炎性反應(yīng)使細(xì)胞密度增加，新陳代謝增強(qiáng)氧氣消耗增加[7]。KING-TUNG等[2]報(bào)道了HIF-1α在牙周病灶中的表達(dá)增加，支持這些區(qū)域存在缺氧環(huán)境。SHI等[8]的一項(xiàng)研究表明，HIF-1α在慢性牙周炎不同階段患者牙齦組織中的表達(dá)顯著增加。隨著牙周炎癥的發(fā)展，HIF-1α在牙周炎患者組織中的免疫反應(yīng)比牙齦炎和健康對(duì)照組更為強(qiáng)烈。這些發(fā)現(xiàn)提示，HIF-1α可能在牙周病中起作用。SLUIMER等[9]證實(shí)患者頸動(dòng)脈斑塊內(nèi)存在缺氧環(huán)境,同時(shí)該研究表明斑塊內(nèi)缺氧誘導(dǎo)了HIF-1α和促血管生成因子(VEGF)的表達(dá)，HIF-1α表達(dá)與斑塊內(nèi)新生血管形成、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)及斑塊病變進(jìn)展相關(guān)。氯化鈷是目前最常用的HIF-1α誘導(dǎo)劑，主要通過(guò)與PAS域結(jié)合誘導(dǎo)HIF-1α表達(dá)，導(dǎo)致HIF-1α-pvhl結(jié)合被阻斷，從而影響HIF-1α的表達(dá)[10]。

CRISPR/Cas9目前已廣泛應(yīng)用于細(xì)胞基因編輯和基因調(diào)節(jié)、基因敲除動(dòng)物模型的構(gòu)建、人類疾病動(dòng)物模型的治療研究等領(lǐng)域[11-12]。HEK-293細(xì)胞作為基因工程最常使用的工具細(xì)胞，在基因編輯方面已有廣泛應(yīng)用。盧利莎等[13]利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功建立了MEIS2基因完全敲除的HEK-293 T細(xì)胞株,為研究MEIS2基因的機(jī)制和功能提供了有效工具。楊芳等[14]已經(jīng)成功利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建人卵巢顆粒細(xì)胞瘤HIF-1α基因敲除細(xì)胞株。

本研究中，使用設(shè)計(jì)好的sgRNA序列與LentiCRISPR V2質(zhì)粒相連，構(gòu)建靶向HIF-1α基因的CRISPR/Cas9表達(dá)載體，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染將載體轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK-293細(xì)胞中，再經(jīng)過(guò)嘌呤霉素篩選已編輯的細(xì)胞，在嘌呤霉素壓力下擴(kuò)大培養(yǎng)，形成混合克隆細(xì)胞株。提取混合克隆細(xì)胞株的DNA擴(kuò)增目標(biāo)序列后進(jìn)行T7E1酶實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證目的基因的突變情況。提取混合克隆細(xì)胞株的蛋白進(jìn)行Western blotting實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證目的基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，T7E1酶實(shí)驗(yàn)成功將目標(biāo)序列切開(kāi)，說(shuō)明目的基因序列成功產(chǎn)生突變，且設(shè)計(jì)的sgRNA敲除效率為33.8%。同時(shí)，Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲除后的混合克隆細(xì)胞株經(jīng)過(guò)氯化鈷誘導(dǎo)后的HIF-1α蛋白表達(dá)量較野生型細(xì)胞株有顯著降低，提示有部分細(xì)胞發(fā)生移碼突變，混合細(xì)胞株HIF-1α基因成功被敲低，靶向HIF-1α基因的CRISPR/Cas9載體構(gòu)建成功且具有相應(yīng)功能。

需要說(shuō)明的是，HEK-293經(jīng)CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除HIF-1α基因后，出現(xiàn)細(xì)胞傳代數(shù)降低、生長(zhǎng)速度減慢等現(xiàn)象。本研究嘗試通過(guò)有限稀釋法培育單細(xì)胞克隆，但最終細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)到需要的數(shù)量。這可能提示HIF-1α及其相關(guān)蛋白對(duì)HEK-293的生長(zhǎng)有重要作用，目前的文獻(xiàn)報(bào)道成功利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建HIF-1α敲除的細(xì)胞均為癌癥細(xì)胞[14-15]，普通細(xì)胞可能無(wú)法耐受HIF-1α敲除的影響。這可能是由于HIF與細(xì)胞衰老機(jī)制有關(guān)聯(lián)[16]，但具體原因和機(jī)制有待進(jìn)一步驗(yàn)證，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將嘗試將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)癌癥細(xì)胞并驗(yàn)證猜想。

綜上所述，本研究通過(guò)在HIF-1α的3號(hào)外顯子設(shè)計(jì)特異性靶點(diǎn)，成功構(gòu)建了靶向HIF-1α基因的CRISPR/Cas9質(zhì)粒，并通過(guò)T7E1酶切實(shí)驗(yàn)和Western blotting實(shí)驗(yàn)成功驗(yàn)證其功能。這為進(jìn)一步研究HIF-1α蛋白的功能奠定了基礎(chǔ)。