李明航，劉海林，刁俊玲，周春巧 綜述，王 松 審校

(重慶兩江新區(qū)第一人民醫(yī)院藥劑科，重慶 401147)

緊密連接是細胞膜相鄰之間一起構成的一道物理屏障。該屏障和細胞增殖、分化調控，以及腫瘤細胞在體內的遷移有關[1]。緊密連接蛋白由細胞質附著蛋白、跨膜蛋白和細胞骨架蛋白共同組成?？缒さ鞍子职ㄒ韵?種完整膜蛋白：連接黏附分子(JAM)、咬合蛋白(Occludin)、閉合蛋白(Claudin)。目前認為，其主要作用的是Occludin和Claudin，尤其以Claudin的作用最為重要，這是形成緊密連接功能的主要蛋白。Claudin中的Claudin-3在維持細胞間物理屏障功能和參與分子細胞間傳遞方面發(fā)揮著重要作用。本文對Claudin-3目前的相關研究進展進行綜述，以便臨床進一步的了解Claudin-3在相關疾病檢測、診斷、治療及預后判斷方面的重要性。

1 緊密連接蛋白Claudin-3概況

Claudin是一類相對分子質量在17～27 kDa的跨膜緊密連接蛋白，目前已發(fā)現(xiàn)有近30個家族成員，其主要作用是維持細胞間的物理屏障功能及細胞極性[2-3]。緊密連接蛋白如果出現(xiàn)異常表達，則會使細胞間的屏障結構遭到破壞，使細胞間的黏附力下降，導致細胞極性喪失，從而致使腫瘤發(fā)生[4-6]。在緊密連接的結構中，每種Claudin蛋白都具有獨一無二的自身細胞旁離子選擇性[7]，其在人體內的各種組織、器官的離子交換選擇性完全不同。在Claudin家族蛋白成員中，不同的蛋白會以多種排列組合方式參與構成緊密連接的物理屏障，提高緊密連接的生物功能多樣性，為人體內不同組織類型的物理屏障功能多樣性提供了分子學的理論依據(jù)。只要Claudin蛋白發(fā)生細微的改變，就會影響到整個緊密連接物理屏障的結構和功能。這種細微的改變可以是基因突變，也可以是數(shù)量改變。一旦緊密連接物理屏障的功能遭到不可逆的破壞，上皮細胞之前存在的極性即遭到不同程度的改變，導致不同液體空間的脂質和蛋白發(fā)生自由擴散，2個不同內環(huán)境之間的滲透屏障也會遭到破壞，最終直接導致組織的生物學特性發(fā)生改變，嚴重時甚至會使細胞外環(huán)境潛在的有害物質或病原體進入機體。Claudin-3是構成緊密連接的一種特異性跨膜蛋白，在不同類型的組織中，其表達也具有較大差異，這歸結于細胞內分子信號的精確傳遞和其組織特異性。

2 Claudin-3的生物學特性

Claudin-3具有3種相互關聯(lián)的生物學特性：屏障功能、柵欄功能和信號轉導功能。緊密連接由分支狀封閉索網絡組成，每條封閉索獨立于其他封閉索作用。緊密連接防止離子通過的能力隨封閉索的數(shù)目呈指數(shù)級增長。每條封閉索由一列嵌入2個原生質膜的跨膜蛋白構成，蛋白的胞外結構域使其彼此間一個個直接相聯(lián)。盡管還有其他蛋白存在，2種主要類型的蛋白是密封蛋白和Claudin。它們與位于細胞膜內側不同的外周膜蛋白相聯(lián)，后者則把封閉索錨定到肌動蛋白細胞骨架。因此，緊密連接連起了相鄰細胞的細胞骨架。緊密連接蛋白Claudin-3主要通過體內蛋白激酶的途徑，對細胞與細胞連接處的選擇性滲透進行調節(jié)。其中,蛋白激酶A和蛋白激酶C作用于Claudin-3蛋白上特定的氨基酸靶點，一般以絲氨酸和蘇氨酸為主要氨基酸。Claudin-3蛋白發(fā)生磷酸化后，其維持緊密連接的屏障及柵欄功能開始下降，主要表現(xiàn)為外周氯化物的滲透增加，血腦屏障被破壞。此外，Claudin-3蛋白的信號轉導功能也開始下降，這可能與信號物質及其蛋白結合物在細胞間的轉移和擴散有關。

3 Claudin-3與疾病

Claudin-3是構成內皮細胞緊密連接的主要蛋白，當其表達發(fā)生異常時可導致內皮細胞間結構遭到損壞。研究發(fā)現(xiàn)，Claudin-3與多種疾病(如腦缺血、膽固醇結石、腫瘤等)密切相關。然而，Claudin-3與疾病的發(fā)生、發(fā)展及轉歸具有復雜關系，且在這些疾病狀態(tài)下Claudin-3表達的調控機制仍需更深入的研究。

3.1Claudin-3與腦缺血 腦缺血是目前中老年人群中常見的腦血管疾病之一。有研究表明，血腦屏障結構的破壞是導致早期腦缺血的主要病理學基礎。血腦屏障結構主要由周細胞和內皮細胞構成，星形細胞的足突包裹著毛細血管外周。內皮細胞之間的緊密連接結構是構成血腦屏障的最重要部分。在腦微血管內皮系統(tǒng)中，Claudin-3的表達十分豐富。Claudin-3是構成內皮細胞緊密連接的主要蛋白，當其表達發(fā)生異常時可導致內皮細胞間結構遭到損壞，血腦屏障通透性也隨之變化?？赡茉蚴?，磷酸化的Claudins-3會干擾緊密連接的形成[8]。HARTWIG等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在人類自身的免疫性腦脊髓炎和成膠質胞瘤中，小靜脈上因為包繞炎性物質，從而使緊密連接因失去Claudin-3而導致免疫著色。然而，其他緊密連接蛋白的結構和功能未發(fā)生改變，由此可以推斷Claudin-3在體內血腦屏障緊密連接的穩(wěn)定性方面起重要作用。Claudin-3與血腦屏障的結構、功能密切相關，提示可以通過人為改變緊密連接蛋白Claudin-3的表達來改變血腦屏障的通透性，從而改變治療藥物在腦組織的有效溶度，這為今后治療中樞神經系統(tǒng)疾病開辟了新路徑，提供了新的藥物作用靶點。

3.2Claudin-3與膽固醇結石 膽固醇結石是一種主要常見于成人的疾病，發(fā)病率隨著年齡的增長而增高。膽固醇結石常見病因包括肥胖、妊娠、糖尿病等。通常認造成膽固醇結石的主要病理學基礎是膽固醇飽和度升高，所以臨床上膽固醇結石的治療主要針對高脂、年齡增長相關的脂質代謝紊亂等。實際上，構成膽固醇結石的主要核心是鈣和對鈣敏感的碳酸根、磷酸根、硬脂酸根等陰離子，但是尚不清楚其在膽固醇結石形成中的作用機制。由于細胞間的緊密連接蛋白在調控水和某些陰離子經過旁細胞途徑轉運中發(fā)揮著重要的屏障作用，張嘉昕等[10]將研究重點放在了小鼠肝臟中高表達的緊密連接蛋白Claudin-3。其發(fā)現(xiàn)在敲除了Claudin-3基因的小鼠肝臟中，旁細胞的屏障功能受到損壞，細胞間水、金屬離子、磷酸根離子的轉運增加，導致膽汁中離子代謝出現(xiàn)失衡現(xiàn)象。正常飲食條件下，在敲除了Claudin-3基因的小鼠中可以觀察到深褐色沉淀物，沉淀物的主要成分是磷酸鈣。但是并未在敲除了Claudin-2基因的小鼠中發(fā)現(xiàn)該物質。進一步在高脂飲食條件下，如果將小鼠的Claudin-3基因敲除，可以加速形成以磷酸鈣核心的淺褐色膽固醇結石，這為“高脂飲食條件下促進膽固醇結石形成”的理論提供了新的實驗依據(jù)。此外，在小鼠肝臟中，Claudin-3的表達會隨年齡的增加而降低，這有助于更好地解釋膽固醇結石的發(fā)病率與年齡的關系。研究揭示了人體內膽固醇結石形成的新機制：緊密連接蛋白Claudin-3受損缺失，導致旁細胞屏障功能降低，增加了離子經肝膽管上皮的旁細胞轉運通路，最終形成以磷酸鈣為主的膽固醇結石。

3.3Claudin-3與前列腺癌 研究發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌、結直腸癌和鼻咽癌等均有Claudins蛋白的異常表達，且Claudin-3在不同癌細胞中的表達量也不同。緊密連接蛋白的異常表達導致上皮細胞滲透屏障遭到破壞，細胞極性喪失，細胞間的黏附力下降，最終導致腫瘤細胞的擴散和轉移。在某些惡性腫瘤發(fā)生的時候[11]，Claudin蛋白總體表達水平明顯下降，這被認為是細胞間黏附性丟失的機制和腫瘤細胞發(fā)生及轉移的重要步驟。然而，臨床在多數(shù)腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)，Claudin表達水平較正常細胞組織明顯升高[12]，這意味著Claudin表達上調在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中也起到了促進作用。Claudin-3跨膜蛋白在細胞間的傳輸和轉運中起重要作用，而細胞黏附功能的基礎又是緊密連接，這與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關[13]。畢罡等[14]研究發(fā)現(xiàn)，相對于前列腺增生組織，Claudin-3蛋白在前列腺癌組織中的表達上調，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。AGARWAL等[15]利用Northen印跡發(fā)現(xiàn)，與周圍正常組織比較，人類前列腺癌組織上皮細胞中的Claudin-3基因轉錄信使RNA水平顯著增高；采用免疫組織化學方法發(fā)現(xiàn)，骨轉移灶中的Claudin-3蛋白表達水平也出現(xiàn)增高現(xiàn)象。2種差異性的表達使得Claudin-3蛋白有可能成為診斷前列腺癌的候選癌標。Claudin-3也是產氣莢膜桿菌腸毒素(CPE)的受體，可以通過CPE對高表達Claudin-3蛋白的腫瘤組織產生特異性細胞溶解作用，這可以為探索Claudin-3表達上調的腫瘤治療新技術提供理論基礎和實驗依據(jù)。李家兵等[16]通過檢測前列腺癌和良性前列腺增生組織中的Claudin-3信使RNA表達水平平，發(fā)現(xiàn)Claudin-3信使RNA在前列腺癌組織和良性前列腺增生組織中的表達水平有顯著性差異，其在前列腺癌組織中的表達水平高，而在良性前列腺增生組織中的表達水平低，推測Claudin-3可能成為診斷前列腺癌的候選癌標，也可能成為前列腺癌治療的潛在靶點。

3.4Claudin-3與結直腸癌 目前，我國的結直腸癌發(fā)病率位居惡性腫瘤疾病第4位，且仍有上升趨勢[17]。有研究證實，上皮間質轉化在癌癥的發(fā)生、進展中起重要作用，其主要表現(xiàn)是緊密連接結構在腫瘤邊緣細胞處遭到破壞。緊密連接是相鄰細胞膜與細胞膜共同構成的物理屏障，與細胞增殖、分化調控及腫瘤細胞轉移有關[1]。陳宗池等[18]發(fā)現(xiàn)，結直腸癌組中的Claudin-3表達水平明顯高于正常結直腸組及結直腸腺瘤組，結直腸腺瘤組的Claudin-3表達水平也顯著高于正常結直腸組。YASUNORI等[19]通過體外細胞研究發(fā)現(xiàn)，Claudin-3在結直腸癌細胞中呈高表達狀態(tài)，提示Claudin-3表達上調可能參與惡性腫瘤的發(fā)生。當Claudin蛋白發(fā)生異常表達時，上皮細胞對細胞旁通路的通透性發(fā)生異常，促進癌癥的發(fā)生[20]。YAXI等[21]通過小鼠動物模型對結直腸癌組織中Claudin-3的表達變化進行了體內和體外研究。結果表明，通過激活SCF/c-kit/JNK/AP-1細胞信號轉導通路，可使Claudin-3在結直腸癌組織中的水平升高，結直腸癌的發(fā)生可能與Claudin-3的異常表達有關，提示Claudin-3有可能成為早期診斷結直腸癌的檢測指標之一。癌細胞轉移的重要步驟是對內皮細胞和間皮細胞的侵襲[22]，而腫瘤轉移涉及到一系列級聯(lián)反應的過程，只有完成這些級聯(lián)反應，癌細胞才能轉移到遠處。而要完成上述轉移級聯(lián)反應，就必須破壞緊密連接的物理屏障作用，導致細胞極性和細胞間的黏附性丟失。Claudin-3在細胞黏附功能的丟失、轉移過程起重要作用。因此，破壞Claudin-3維持緊密連接的完整性是完成轉移級聯(lián)反應發(fā)生的關鍵步驟。但是，由于樣本量有限及缺少相關機制研究，Claudin-3能否作為結直腸癌的治療靶點有待深入基礎和臨床研究。

3.5Claudin-3與鼻咽癌 鼻咽癌是一個多階段變異累積、多基因參與形成的病理過程。尋找鼻咽癌的分子標志物將有利于個體化治療方案選擇及預后評估。研究表明，Claudin蛋白在惡性腫瘤發(fā)展的一系列病理生理過程中發(fā)揮作用[23]。Claudin-3也是如此，其在不同的腫瘤組織中呈現(xiàn)不同的表達水平，也發(fā)揮著不一樣的作用。陳茹等[24]發(fā)現(xiàn)，Claudin-3在鼻咽癌組織中的表達率要高于鼻咽癌旁組織，但是兩者比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。然而，在病理分期更高的鼻咽癌組織，Claudin-3的表達率更高，多項研究顯示了鼻咽癌的臨床分期與血清EB病毒抗體的滴度有關[25-26]，推斷Claudin-3的表達升高與鼻咽癌臨床分期有關，Claudin-3可能在鼻咽癌的病程發(fā)展中起一定作用。近年來，腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的細胞間連接功能異常逐漸受到重視，干預該過程的關鍵蛋白從而抑制腫瘤細胞的擴散和轉移已成為腫瘤研究領域的新熱點。Claudin-3的異常表達與鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關，有望成為治療鼻咽癌的新靶點，可對其開展深入研究。

4 小結與展望

緊密連接蛋白Claudin-3是構成細胞間緊密連接的主要功能蛋白，通過細胞間的物理屏障、細胞間旁路轉運和信號轉導維持細胞內環(huán)境的平衡。雖然Claudin-3在相關疾病及腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的確切作用機制還不清楚，但是Claudin-3蛋白在腫瘤和正常組織中表達水平存在差異，可利用Claudins家族蛋白表達存在的高度組織特異性，對Claudin-3的表達情況和其調節(jié)因子的作用機制進行深入探索。隨著分子生物學技術的飛速發(fā)展和對Claudins-3結構和功能的進一步深入研究，Claudins-3在多種惡性腫瘤的檢測、診斷、治療中將會成為一個新的靶點。