段昱娟，黃 晶

上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院上海精準醫(yī)學研究院，上海 200125

組蛋白修飾是生物體表觀遺傳調控的一種主要方式，多種不同類型組蛋白修飾酶通過在染色質核小體的核心組蛋白上添加或去除甲基、乙酰基、磷酸基或泛素等共價修飾，動態(tài)地調節(jié)染色質的結構與功能，從而廣泛參與到基因表達調控、干細胞多能性維持、DNA 損傷修復及個體發(fā)育等重要的生命活動過程［1］。組蛋白上的乙?；瘎討B(tài)修飾由組蛋白乙酰轉移酶（histone acetyltransferase，HAT）和組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase， HDAC） 共 同 調 控［2］。HDAC 通過去除HAT 向組蛋白尾部加入的乙?；揎棧谷旧|形成更高級、濃縮的結構，從而有效抑制基因轉錄。組蛋白上乙?；揎椘胶獾奈蓙y往往會使基因表達失控，導致腫瘤的發(fā)生［3］。有研究發(fā)現，HDAC 抑制劑能通過增加細胞內組蛋白的乙?；潭?，提高p21等基因的表達水平，抑制腫瘤細胞的增殖，誘導細胞分化或凋亡［4］，現已成為腫瘤靶向治療的一個新熱點。目前已經研發(fā)出的多種能夠有效抑制HDAC 酶活性的抑制劑大多為針對第Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ類HDAC的廣譜抑制劑，在臨床治療中具有較強的不良反應。另外，在通常情況下，HDAC會被招募到Sin3復合物、核小體重塑和組蛋白去乙?；笍秃衔铮╪ucleosome remodeling and deacetylase complex，NuRD 復 合 物）、 CoREST （corepressor of RE1-silencing transcription factor）復合物等不同的大分子復合物中［5-8］，與其他亞基協(xié)同作用，發(fā)揮功能活性。HDAC抑制劑對不同的HDAC復合物也表現出明顯的選擇偏向性［9］。單純靶向于HDAC蛋白自身的癌癥治療藥物具有較大的局限性，設計更為有效的、靶向于特定復合物的藥物是目前藥物開發(fā)新的突破點，也是研究者面臨的巨大挑戰(zhàn)。

NuRD 復合物是一種同時具備染色質重塑酶和去乙酰化酶活性的大分子復合物，由ATP 依賴的染色質重塑因子CHD3/4（chromodomain helicase DNA binding protein 3/4）、轉錄抑制因子GATAD2A/B（GATA zinc finger domain containing 2A/B）、甲基化CpG 結合蛋白MBD2/3（methyl-CpG-binding domain protein 2/3）、組蛋白去乙?；窰DAC1/2（histone deacetylase 1/2）、 腫瘤轉移相關蛋白MTA1/2/3（metastasis-associated protein 1/2/3）和組蛋白結合蛋白RBBP4/7 （retinoblastoma-binding protein 4/7） 等多種蛋白質亞基組成［10］。基于NuRD 復合物在基因轉錄調控、DNA 損傷修復及干細胞多能性維持上的重要作用，其對于機體的正常生長發(fā)育至關重要，其水平也與人類癌癥的發(fā)生發(fā)展及轉移潛能密切相關［11-14］。受限于超大復合物表達純化的難度，目前已有的NuRD 復合物結構研究多聚焦于去乙?；诵哪KMTA1/2/3-HDAC1/2-RBBP4/7，完整復合物的 研 究 是較為缺失的。MILLARD 等［15-17］自2013 年以來，通過結構解析初步揭示了NuRD 復合物去乙?；诵哪K中MTA1/2/3 作為支架蛋白分別招募HDAC1/2和RBBP4/7 的分子機制。LOW 等［18］通過金標準絕對定量的質譜分析，初步推斷NuRD 復合物 中 各 亞 基 RBBP4/7、 HDAC1/2、 MTA1/2/3、MBD2/3、GATAD2A/B、CHD3/4 的化學計量比為4∶2∶2∶1∶1∶1，并通過交聯質譜、靜態(tài)光散射等多種方法證實了NuRD 復合物是由MTA1/2/3-HDAC1/2-RBBP4/7 去乙酰化核心模塊和MBD2/3-GATAD2A/B-CHD3/4 染色質重塑模塊兩部分組成，且整體的NuRD 復合物可能呈現為非對稱的、模塊化的狀態(tài)。

解析獲得完整NuRD 復合物的高分辨率結構信息，了解各亞基間的相互作用關系，獲得更多的位點信息，對于探索NuRD 復合物參與基因表達調控的分子機制以及設計相應的靶向藥物具有重要意義。本研究擬通過哺乳細胞瞬時轉染過表達和蛋白純化系統(tǒng)，富集得到完整的人源NuRD 復合物，借助120 kV 透射電鏡和單顆粒重構技術獲得NuRD 復合物的負染三維結構模型，以期為后續(xù)解析高分辨率NuRD 復合物冷凍電鏡結構奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要試劑與儀器 Fast Pfu DNA 聚合酶（全式金）， 限制性核酸內切酶（Thermo Fisher Scientific），DNA 連接酶Ligation high（Toyobo），質粒大量抽提試劑盒（康為世紀），聚乙烯亞胺（polyethylenimine， PEI） 40 000 （Polysciences），Balance CD 293 培養(yǎng)基（Cell wise），Ni-NTA 瓊脂糖（Qiagen），抗DYKDDDDK G1 親和樹脂（金斯瑞），兔源HDAC1 單克隆抗體（Proteintech），兔源MTA1單克隆抗體、兔源RBBP4 多克隆抗體、兔源CHD4單克隆抗體（ABclonal），鼠源抗His單克隆抗體、鼠源抗Flag 單克隆抗體、山羊抗兔IgG、山羊抗兔IgG（AbHO），ECLTMPrime Western blotting 檢 測 試 劑（Cytiva），Superose 6 Increase 5/150、快速蛋白液相色譜儀（GE healthcare），eBlot L1 快速濕轉儀（金斯瑞），高分辨軌道阱質譜儀（型號Q-Exactive HF，Thermo Fisher Scientific），碳膜銅網（北京中鏡科儀技術有限公司），透射電鏡（型號Talos L120C，FEI），3%乙酸雙氧鈾（uranyl acetate，UA）（河南銳欣實驗用品有限公司）。

1.1.2 細胞、菌株與載體 人胚腎來源的Expi293F細胞，大腸埃希菌DH5α菌種、Stbl3菌種，哺乳動物細胞表達載體pMLink均由本實驗室保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物合成和DNA 序列測定 實驗所用引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。DNA序列測定由上海鉑尚生物技術有限公司完成。

1.2.2 質粒的構建 利用PCR 從HEK293T 細胞cDNA 文庫中獲得人源MBD3 全長（氨基酸殘基：1～291）、GATAD2A全長（氨基酸殘基：1～633）的基因編碼序列，分別插入到帶有Flag 或His 純化標簽的pMLink 載體中，獲得相應的pMLink-MBD3-3×Flag、pMLink-10×His-GATAD2A重組蛋白表達質粒。

1.2.3 瞬時轉染過表達蛋白 將重組質粒pMLink-MBD3-3×Flag 和pMLink-10×His-GATAD2A 以1∶1的比例加入到20 mL 哺乳動物細胞懸浮培養(yǎng)基中，室溫孵育10 min。另外將轉染試劑PEI 加入到20 mL 哺乳動物細胞懸浮培養(yǎng)基中室溫孵育10 min。將轉染試劑稀釋液與質粒稀釋液混合，繼續(xù)室溫孵育20 min，最后將轉染混合物加入到密度為2.5×106個/mL 的Expi293F 細胞中（每毫升細胞轉染1 mg 目的基因質粒，使用2 mL 1 mg/mL pH 7.0 的PEI 轉染試劑）。加入轉染體系后將細胞在37℃、5% CO2的 搖 床 中125 r/min 繼 續(xù) 培 養(yǎng)，48～52 h 后 收集細胞用于蛋白純化。

1.2.4 NuRD 復合物純化 將轉染表達有目的蛋白復合物的Expi293F細胞用裂解緩沖液（含50 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl、300 mmol/L NaCl、10%甘油、20 mmol/L咪唑、1 mmol/L β-巰基乙醇、1 mmol/L PMSF、5 mmol/L benzamidine、1 μg/mL亮抑蛋白酶肽、1μg/mL胃蛋白酶抑制劑）重懸，冰浴條件下超聲破碎。將勻漿于4 ℃、46 000×g高速離心1 h，離心后的上清液與平衡好的Ni-NTA填料于旋轉混合儀上4 ℃緩慢混合1 h?；旌贤瓿珊髮⒒旌弦?35×g離心5 min，棄去上清液，將填料轉移至層析管中進行重力流動的親和層析實驗，用裂解緩沖液清洗填料，直至考馬斯亮藍檢測液檢測不到蛋白組分流出后，再用相應的洗脫緩沖液Ⅰ（含25 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl、150 mmol/L NaCl、250 mmol/L 咪唑、1 mmol/L β-巰基乙醇、1 mmol/L PMSF、5 mmol/L benzamidine、1 μg/mL 亮抑蛋白酶肽、1μg/mL胃蛋白酶抑制劑）洗脫蛋白。將洗脫下來蛋白與抗DYKDDDDK G1 親和樹脂低溫旋轉混合約5 h，之后用洗滌緩沖液（含25 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl、150 mmol/L NaCl、20 mmol/L 咪 唑、1 mmol/L β-巰基乙醇、1 mmol/L PMSF、5 mmol/L benzamidine、1 μg/mL亮抑蛋白酶肽、1μg/mL胃蛋白酶抑制劑）清洗填料直至無雜蛋白流出，再用洗脫緩沖液Ⅱ（含25 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl、 150 mmol/L NaCl、500 μg/mL Flag 多肽）洗脫目的蛋白。將蛋白樣品用截留分子量為30 000 的濃縮管濃縮至約100 μL，利用分子篩Superose 6 Increase 5/150 進行進一步分離純化。最后通過十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE） 分析鑒定，合并組分完整的NuRD 復合物蛋白溶液。

1.2.5 NuRD 復合物組分的鑒定

（1）利用蛋白質印跡法（Western blotting）鑒定NuRD 復合物中的各蛋白組分。通過SDS-PAGE分離蛋白樣品后，用濕轉轉膜儀將蛋白轉移至甲醇活化后的聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。之后將PVDF 膜浸潤在含5%脫脂奶粉的封閉液中，室溫封閉2 h。倒棄封閉液，分別加入稀釋至合適濃度的HDAC1、MTA1、RBBP4、CHD4 蛋白特異性抗體及抗His、Flag 標簽特異性抗體，4 ℃孵育過夜。用膜清洗液TBST （含20 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl、150 mmol/L NaCl、0.05% tween-20）清洗PVDF 膜，重復3 次，每次10 min。之后加入稀釋后的偶聯了辣根過氧化物酶（HRP）的山羊抗鼠抗體或山羊抗兔抗體，室溫孵育1 h。用TBST 清洗3 次，每次10 min。使用化學發(fā)光成像法顯色鑒定。

（2）通過質譜鑒定檢測純化產物中的蛋白組分。取約20 μg 蛋白，經烷基化處理后，加入胰蛋白酶，37 ℃酶解過夜；酶解肽段經C18 柱除鹽后，采用液相色譜-串聯質譜法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）進行分析；質譜原始數據提交到Proteome Discoverer 2.3 軟件中，使用UniProt 數據庫中的人蛋白質數據庫（Protein Data Bank，PDB）進行檢索。

1.2.6 負染樣品的制備、數據收集及模型構建 因UA 溶液滲透力較強、顆粒細膩，故選擇其作為樣品的負染色液。負染電鏡實驗步驟如下：使用輝光放電儀對碳膜銅網進行親水化處理后，于碳膜銅網中央滴加3 μL 濃度約為0.05 mg/mL 的蛋白質溶液，靜置1 min；用濾紙從碳膜銅網邊緣輕輕吸去多余的溶液，滴加3 μL 1.5% UA 溶液，染色1 min；用濾紙吸去多余液體，置于數顯式紅外烘烤燈下烘烤；之后將樣品置于120 kV 透射電鏡中觀察，放大倍數設置為57 000 倍，欠焦值設置為-1.0～-2.5 μm；選擇樣品顆粒分散性和均一性較好的區(qū)域進行數據收集。 隨后利用數據處理軟件EMAN2 和RELION3.1.1 對所收集的圖像進行處理并生成相應的三維模型［19-20］。用傅里葉空間中不同分辨率殼層中2 個獨立的計算結構的相關性估計三維結構的分辨率，通常將獲得的結構的空間分辨率定義為傅里葉殼層關聯函數（Fourier shell correlation，FSC）=0.143 時的空間頻率的倒數。

1.2.7 NuRD 復合物蛋白質結構分析 將PDB 中已提交的亞復合物MTA1-HDAC1-MBD2 冷凍電鏡結構（PDB：7AO9） 及 亞 基RBBP4 晶 體 結 構（PDB：5FXY）通過UCSF Chimera軟件自動匹配至本研究獲得的三維結構模型中［21］，定位二聚體MTA1-HDAC1、RBBP4 及MBD2 在NuRD 復合物負染結構模型中的位置，并預測其他亞基的定位。

2 結果

2.1 NuRD復合物的表達與純化

經過多重篩選最終決定構建C端帶有3×Flag標簽的MBD3重組蛋白表達質粒和N端帶有10×His標簽的GATAD2A重組蛋白表達質粒，用于后續(xù)的表達純化。將構建好的質粒在哺乳動物細胞Expi293F中瞬時轉染共表達，依次通過Ni-NTA純化和Flag標簽純化，將純化得到的蛋白通過SDS-PAGE分離及考馬斯亮藍染色鑒定。結果顯示，哺乳動物細胞內過表達的MBD3和GATAD2A 能成功共純化出細胞內的多個內源蛋白，在與NuRD復合物各組分蛋白（圖1A）的分子量進行比對分析后，初步認為純化產物為組分齊全、純度較高的NuRD復合物樣品（圖1B）。為了確認復合物的狀態(tài)以及提高樣品的均一性，將親和層析得到的蛋白樣品通過分子篩Superose 6 Increase 5/150 進一步分離純化，得到的復合物在1.3～1.6 mL 的體積處出峰（圖1C）；該出峰位置對應分子量大于669 000的球狀蛋白物，這與NuRD 復合物的預測大?。ǚ肿恿?20 000）接近。分管收集流出組分，通過SDS-PAGE分離及考馬斯亮藍染色鑒定，結果顯示復合物中多組分蛋白比例適當，且于1.3～1.6 mL 處共同出峰（圖1D），合并收集可能為NuRD 復合物的1.3～1.6 mL 流出組分，濃縮用于后續(xù)實驗。經過整個分離純化步驟，從2 L 的Expi293F細胞中可純化出約0.1 mg NuRD復合物。

圖1 NuRD復合物的表達與純化Fig 1 Expression and purification of the NuRD complex

2.2 NuRD 復合物的組分鑒定

針對通過兩步親和層析及分子篩純化得到的復合物，利用蛋白特異性抗體成功檢測到MTA1、HDAC1、RBBP4 和CHD4 蛋 白（圖2A）。采 用Western blotting 對檢測到的各組分蛋白進行進一步分析，其中，MTA1 和RBBP4 條帶清晰，特異性強（圖2B、2D）；HDAC1 的主條帶清晰，但利用該兔源HDAC1 蛋白單克隆抗體能在約50 000 處同時檢測到一條非特異性結合條帶（圖2C），與文獻報道結果一致［22］；CHD4 對應條帶信號強，檢測到的多條分子量較小的條帶可能為CHD4 降解產物或其他非特異性結合條帶（圖2G）。通過His、Flag 標簽特異性抗體成功鑒定到了相應蛋白His-GATAD2A和MBD3-Flag，雖有非特異性結合條帶，但主帶信號強且條帶清晰（圖2E、2F）。根據分子量大小，Western blotting 檢測到的蛋白與考馬斯亮藍染色后SDS-PAGE 膠上的主要蛋白條帶基本吻合。以上結果均證實NuRD 復合物中的各主要組分蛋白被有效地共純化。

圖2 純化的NuRD復合物的Western blotting鑒定Fig 2 Western blotting identification of the purified NuRD complex

LC-MS/MS 鑒定結果顯示，純化得到的復合物終產物中含有NuRD 復合物的染色質重塑模塊蛋白GATAD2A/B、MBD2/3、CHD3/4 及組蛋白去乙?；K蛋白MTA1/2/3、RBBP4/7、HDAC1/2。分別以蛋白群組中鑒定到的二級肽段譜圖數（peptide spectrum matches，PSMs）排序，可粗略估計各蛋白的相對含量，如表1 所示。上述結果表明純化得到的產物為NuRD復合物。

表1 純化的NuRD復合物樣品蛋白組分LC-MS/MS分析結果Tab 1 Analysis of protein components in the purified NuRD complex by LC-MS/MS

2.3 NuRD 復合物的負染電鏡數據收集和三維模型構建

在獲得高純度且均一性較好的NuRD 復合物蛋白樣品后，通過負染電鏡技術和單顆粒重構技術分析復合物的三維模型。樣品吸附到經親水化處理的碳膜銅網后，經重金屬UA 染色，通過120 kV 透射電鏡觀察，樣品在負染條件下蛋白質濃度合適，顆粒分散性、均一性良好，雖存在少量細小的小蛋白顆粒，但不影響后續(xù)的顆粒挑選及結構解析。電鏡照片中大部分顆粒為長條形，長度為25～32 nm，與預期大小基本相符，其長度差異可能體現復合物不同角度下的截面狀態(tài)（圖3A）。在57 000放大倍數下共收集負染電鏡照片233 張，運用RELION3.1.1 軟件挑選顆粒并進行二維分類和三維分類分析。二維分類下，NuRD 復合物結構特征明顯，大部分呈現出多節(jié)球狀樣的形態(tài)（圖3B），用于三維重構的顆粒角度分布均勻（圖3C）。經過進一步的三維優(yōu)化處理，最終獲得分辨率約為17 ?（1 ?=0.1 nm）的人源NuRD 復合物負染三維結構模型（圖3D）。

圖3 NuRD 復合物的負染電鏡分析Fig 3 Negative-staining electron microscopy analysis of the NuRD complex

2.4 NuRD 復合物結構的初步分析

針對生成的三維結構進行分析，NuRD 復合物的大小約為270 ?×100 ?×80 ?，呈現為多節(jié)球狀的長條形，具有與對稱二聚體較為吻合的模塊，但整體的NuRD 復合物呈現出一定的不對稱性（圖4A），其輪廓和已報道的亞復合物MTA1-HDAC1-MBD2、MTA1-HDAC1-MBD2-RBBP4 結構輪廓有所類似［18］。將PBD 中已有的亞復合物結構（7AO9，5FXY）通過UCSF Chimera自動匹配［21］，大致確定對稱的二聚體MTA1-HDAC1、2 個RBBP4 亞基及MBD2 亞基在NuRD復合物負染結構模型中的定位（圖4B）。另外，通過三維結構模型信息可以推測其他亞基的定位，其中，MBD2 附近的多余電鏡密度可能為GATAD2A/B亞基，HDAC1 旁的多余電鏡密度可能為RBBP4/7亞基。

圖4 NuRD復合物三維模型結構和多亞基的定位Fig 4 Three-dimensional reconstruction of NuRD complex and localization of multiple domains

3 討論

由于在基因轉錄和DNA 損傷修復及腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的調控功能，NuRD 復合物一直是表觀遺傳學及腫瘤學領域的研究熱點［12-13，23-24］。相較于NuRD 復合物的功能研究，關于完整NuRD 復合物的結構研究較為缺失。解析NuRD 復合物的結構信息，對于揭示復合物中各亞基組成及相互作用關系、研究NuRD 復合物影響基因表達的調控機制、進一步揭示疾病的發(fā)生發(fā)展過程及研發(fā)后續(xù)的治療藥物具有重大意義。

有研究［25］表明，染色質結合蛋白PWWP2A/B（PWWP domain-containing protein 2A/B）能與MBD2/3等組分競爭性地結合染色質重塑模塊（MTA1/2/3-HDAC1/2-RBBP4/7），形成穩(wěn)定復合物，使去乙?；诵哪K（MTA1/2/3-HDAC1/2-RBBP4/7）招募染色質重塑模塊的能力減弱，這可能造成在選擇去乙?；诵哪K添加純化標簽進行親和純化時難以純化得到完整NuRD 復合物。與之前的研究不同，我們將蛋白純化重點從較為穩(wěn)定的組蛋白去乙?；诵哪K轉向染色質重塑模塊。經過Ni-NTA 純化和Flag 標簽純化，首次分離純化得到了完整NuRD 復合物。通過凝膠過濾層析Superose 6 Increase 5/150按分子量進一步分離，為后續(xù)的電鏡結構研究提供了更為均一完整的復合物狀態(tài)的蛋白樣品。之后，運用負染電鏡和單顆粒重構技術，獲得了NuRD 復合物的低分辨率結構模型。從整體輪廓上看，NuRD復合物呈現出條形、多節(jié)球狀樣的結構特征。已有的亞復合物MTA1-HDAC1-MBD2 及RBBP4 結構可以通過UCSF Chimera 軟件較好地自動匹配進去，其他多余密度推測可能為GATAD2A/B、RBBP4/7 等亞基組分，但染色質重塑模塊中的CHD4 亞基由于分子量較大，難以在我們解析得到的結構模型中找到合適的定位空間。我們推測由于在純化產物中CHD4 的含量較低，最終得到的含有CHD4 的完整NuRD 復合物可能較少， 以至于后續(xù)使用RELION3.1.1 軟件進行結構解析數據處理時二維、三維分類挑選到的顆粒大多為缺失CHD4 組分的亞復合物，最終得到的結構模型可能為缺失CHD4 亞基的亞復合物結構模型。在后續(xù)的研究中，可通過額外添加CHD4 蛋白進行體外組裝的方式提高復合物中CHD4 的含量，以期得到更多更為完整的NuRD復合物用于結構生物學研究。

受限于負染電鏡結構解析的局限性，染色劑中的重金屬可能會遮蔽部分結構信息，且在吸附過程中，所涉及的分子力可引起構象變化，使負染電鏡解析的結構信息與真實蛋白質結構間存在些許差異。另外，負染電鏡結構解析只能提供粗略的輪廓信息，精確的亞基定位及相互作用信息還需要進一步通過冷凍電鏡高分辨率結構解析提供依據。為了得到完整人源NuRD 復合物的高分辨率結構，未來可通過加入交聯劑戊二醛的方式提高復合物的完整穩(wěn)定性，獲得更為均一的樣品，進行冷凍電鏡結構分析，從而獲得NuRD 復合物的高分辨率冷凍電鏡結構；另外，也可嘗試尋找合適的核小體底物進一步穩(wěn)定復合物的結構，解析核小體-NuRD 復合物的高分辨率冷凍電鏡結構，進而闡明NuRD 復合物在基因表達調控上的結構基礎。

利益沖突聲明/Conflict of Interests

所有作者聲明不存在利益沖突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

作者貢獻/Authors'Contributions

黃晶設計并指導了整個課題的研究；段昱娟參與了實驗設計并完成了所有的實驗；段昱娟和黃晶參與了整篇論文的寫作與修改。所有作者均閱讀并同意了最終稿件的提交。

The study was designed and supervised by HUANG Jing. DUAN Yujuan participated in research design and performed all experiments.The manuscript was drafted and revised by DUAN Yujuan and HUANG Jing. All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2022-01-13

·Accepted：2022-03-07

·Published online：2022-04-26