趙冰楠，馬雙羽，胥春龍，王 瓊

1.上海交通大學醫(yī)學院組織胚胎學與遺傳發(fā)育學系，上海市生殖醫(yī)學重點實驗室，上海市“細胞穩(wěn)態(tài)調控與疾病”前沿科學研究基地，上海 200025；2.上海腦科學與類腦研究中心，上海 200031

轉化生長因子β（transforming growth factor β，TGFβ） 超家族的細胞因子，包括TGFβ、活化素（activin）、 nodal 生 長 分 化 因 子（nodal growth differentiation factor，Nodal） 和 骨 形 態(tài) 發(fā) 生 蛋 白（bone morphogenetic protein，BMP）等，參與調控后生動物發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)與再生、免疫監(jiān)測以及腫瘤發(fā)生等過程。TGFβ 信號異常會導致發(fā)育缺陷、免疫紊亂、纖維化形成和癌癥等疾病的發(fā)生［1］。TGFβ 超家族細胞因子與TGFβ Ⅱ型受體結合后，TGFβ Ⅱ型受體將磷酸化TGFβ Ⅰ型受體，活化的Ⅰ型受體進而招募SMAD 蛋白（drosophila mothers against decapentaplegic protein） ——SMAD2 和SMAD3，并磷酸化其C-末端Ser-Ser-X-Ser（SSXS）序列。磷酸化的SMAD2/3 與通用SMAD4 形成復合物后入核，進而與靶基因的啟動子和/或增強子上的SMAD結合元件結合，從而調控基因轉錄［1］。

TGFβ 家族成員廣泛存在于胚胎干細胞（embryonic stem cell，ESC）中。ESC 是一類具有自我更新和多向分化潛能的細胞。人胚胎干細胞（human embryonic stem cell，hESC）存在著由TGFβ/activin 誘導磷酸化的SMAD2/3。通過SB431542 抑制TGFβ/activin受體活性，SMAD2/3的磷酸化水平下降將促進hESC 自發(fā)分化［2-3］。并且，SMAD2/3 還可以與多能性因子NANOG 同源盒（nanog homeobox，NANOG）的啟動子結合，從而調控NANOG 的表達［4-5］。這些研究證實了TGFβ信號對于維持hESC多能性的重要作用。在合適的條件下，ESC可以在體外模擬胚胎早期的發(fā)育過程，包括分化成為3 個胚層：外胚層、中胚層和內(nèi)胚層。在缺乏TGFβ 信號的情況下，人和小鼠的ESC 均默認分化成為外胚層，而中胚層和內(nèi)胚層的分化則需要TGFβ 家族Nodal/activin和BMP 等信號的誘導激活［6］。例如，Nodal/activin活化的SMAD2/3 可直接與內(nèi)胚層譜系特異性因子性別決定區(qū)Y 框蛋白17（sex determining region Y-box 17，SOX17）、叉頭框轉錄因子A2 （forkhead box A2， FOXA2）、 GATA 結 合 蛋 白6 （gata binding protein 6， GATA6） 和GSC 同 源 盒（goosecoid homeobox，GSC）等結合，誘導hESC 向定型內(nèi)胚層（definitive endoderm，DE）分化；SMAD2/3 還可進一步與脫中胚蛋白（eomesodermin，EOMES）相互作用，啟動內(nèi)胚層基因網(wǎng)絡的轉錄［7-8］。因此，ESC向中內(nèi)胚層（mesendoderm，ME）分化的過程中，TGFβ信號通路發(fā)揮著極其重要的作用。

SMAD 蛋白是經(jīng)典的TGFβ 信號下游關鍵的轉錄因子。SMAD2 和SMAD3 的蛋白結構高度相似，但全長的SMAD2 的MH1 結構域中還存在一個由3號外顯子（exon 3，E3）編碼的30 個氨基酸區(qū)域。當這個外顯子被剪接后，SMAD2 將產(chǎn)生在結構和功能上類似于 SMAD3 的短蛋白質產(chǎn)物（SMAD2β）［9］。由于SMAD2 和SMAD3 在結構上較為相似，因此兩者常被視為同等功能的轉錄因子。但是，不少研究已經(jīng)表明SMAD2 和SMAD3 的功能其實并不完全相同。Smad2與Smad3敲除小鼠的表型各異。Smad2-/-小鼠因為原腸胚發(fā)育障礙而死亡，而Smad3-/-小鼠的胚胎卻基本正常［10-12］。在嵌合體實驗中，SMAD2 缺陷的ESC 不能形成DE［13-14］。此外，SMAD2，而非SMAD3，在TGFβ 信號作用下可直接活化NANOG 的表達，因此對hESC 和小鼠上胚層干細胞的多能性維持更為重要［15］。沒有TGFβ信號刺激時，SMAD2 和SMAD3 呈現(xiàn)不同的亞細胞定位——SMAD2 主要分布于細胞質，而SMAD3 則傾向于聚集在細胞核［9，16］。在小鼠多能性細胞中，先驅因子叉頭框轉錄因子H1 （forkhead box H1，F(xiàn)OXH1）首先將SMAD3 募集到ME 分化基因的啟動子上；而SMAD2 在細胞質內(nèi)等待TGFβ 信號的來臨。一旦TGFβ 誘導的分化啟動，SMAD2 被磷酸化激活，并與SMAD4 結合。TGFβ 信號驅動的SMAD2-SMAD4 復合物將分化信號傳遞到細胞核內(nèi)，并與FOXH1-SMAD3 共同結合迅速啟動ME 相關基因的表達［9］。

雖然，TGFβ 家族在胚胎發(fā)育過程中具有非常重要的調控作用，但在hESC 中，其下游關鍵轉錄因子SMAD2 和SMAD3 對hESC 的調控機制尚不清楚。本研究將通過比較hESC 中SMAD2 和SMAD3 的表達，以及SMAD2或SMAD3敲除對hESC 多能性基因以及分化過程中神經(jīng)外胚層（neuroectoderm，NE）和ME相關基因表達的影響，揭示SMAD2 和SMAD3 在調控干細胞功能方面的差異，進一步解析TGFβ-SMAD復雜的信號轉導網(wǎng)絡，以期揭示早期胚胎發(fā)育過程中信號調控機制，為探索疾病機制和治療等方面的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 hESC（H1-icas9）由紀念斯隆-凱特琳癌癥中心（Memorial Sloan-Kettering Cancer Center）的HUANGFU實驗室建立［17］并贈予。

1.1.2 質粒 lentiGuide-Puro（#52963）、psPAX2（#12260） 和pMD2.G （#12259） 質 粒 均 購 自 美 國Addgene 公 司； pLVX-Tight-Puro 和pLVX-Tet-On Advanced（#632162）質粒均購自美國Clontech公司。

1.1.3 主要試劑 Essential 8 培養(yǎng)基、Essential 6 培養(yǎng)基、Advanced RPMI 培養(yǎng)基、GlutaMAX、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、乙二胺四乙酸（EDTA）、青霉素/鏈霉素、PowerUp?SYBR?Green 預混液和Pierce?Coomassie Plus（Bradford）檢測試劑均購自美國Thermo Fisher Scientific 公司，ROCK 抑制劑Y-27632 2HCl（S1049，美國Selleck 公司），活化素A（activin A，AC）（12014E，美國PeproTech 公司），TGFβ 抑制劑SB431542（161410，美國Tocris 公司），糖原合成酶激酶-3 （glycogen synthase kinase 3，GSK-3） 抑 制 劑CHIR99021 （4423，美 國Tocris 公司），BMP 抑制劑LDN193189 （1509，美國Axon Medchem 公司），熒光二抗IRDye 800CW/680RD（美國LI-COR 公司），SMAD2/3 抗體（8685S）、SMAD2抗體（5339S）、SMAD3 抗體（9523S）、SOX1 抗體（4194）均購自美國Cell Signaling Technology 公司，八聚體結合轉錄因子4（octamer-binding transcription factor 4， OCT4） 抗 體 （5279）、 SOX2 抗 體（365823） 購自美國Santa Cruz 公司，SOX17 抗體（AF1924）、C-X-C 模 體 趨 化 因 子 受 體4 （C-X-C motif chemokine receptor 4，CXCR4）抗體（FAB170 A）購自美國R&D 公司，γ-微管蛋白（γ-tubulin）抗體（T6074，美國Sigma 公司），配對盒因子6（paired box 6， PAX6） 抗 體 （901301， 美 國BioLegend 公司），EOMES 抗體（11-4877-41，美國eBioscience公司）。

1.2 方法

1.2.1SMAD敲除細胞系構建 利用iCRISPR 方法［17］構 建 H1-icas9 的SMAD2敲 除 （SMAD2knockout， SMAD2KO） 和SMAD3敲 除（SMAD3knockout， SMAD3KO） 細 胞 系。 將SMAD2和SMAD3的 小 型 導 引RNA （small-guiding RNA，sgRNA）克隆入lentiGuide-Puro［18］質粒中，sgRNA的靶向序列分別為：SMAD2，ATGTTATATATTGCC GATTA；SMAD3， ACCTGAATGGGCCTTTGCAG。在HEK293T 細胞中使用Lipofectamine2000 （美國Thermo Fisher Scientific 公司）包裝慢病毒，收集轉染48 h 的慢病毒去感染H1-icas9 細胞。H1-icas9 細胞感染了包含sgRNA 的慢病毒后，通過每日持續(xù)添加強力霉素（doxycycline，dox）2 mg/mL 誘導Cas9 表達5 d。保持H1-icas9 細胞以單細胞密度生長，以允許克隆細胞系的擴增與分離?？寺〉奶暨x、基因分型和擴增按照文獻報道的方法進行［17］。

1.2.2 在SMAD敲除細胞系中過表達SMAD蛋白建立SMAD2和SMAD3的dox 誘導表達質粒系統(tǒng)。pLVX-Tight-Puro 是一種受四環(huán)素誘導的慢病毒表達載體。pLVX-Tet-On 上具有受dox 調控的轉錄激活因子rtTA。當添加dox 誘導rtTA 的表達后，rtTA 可以激活pLVX-Tight-Puro 上的四環(huán)素操作子，從而誘導操作子下游的蛋白表達。人源SMAD2和SMAD3的開放閱讀框被克隆到pLVX-Tight-Puro 載體中。替換pLVX-Tet-On 中的CMV 啟動子為pGK 啟動子，防止其 在ESC 中 沉 默［19］。在HEK293T 細 胞 中，利 用Lipofectamine2000 將病毒包裝質粒（psPAX2、pMD2.G）、包 含 人 源SMAD2或SMAD3的pLVXTight-Puro 表達質粒以及pLVX-Tet-On 質粒，轉入HEK293T 細 胞 中， 隨 后 收 集 慢 病 毒， 感 染SMAD2KO 或SMAD3KO 細胞以實現(xiàn)外源性SMAD蛋白的過表達。

1.2.3 細胞培養(yǎng)以及誘導hESC 向DE 和NE 分化

hESC 貼壁培養(yǎng)在Essential 8 培養(yǎng)基中，待細胞長滿后使用EDTA 按照一定比例傳代，細胞培養(yǎng)皿用基底膠（Matrigel）包被。

（1）誘導hESC 向DE 分化 D0（代表多能性階段）：用含Rock 抑制劑的Essential 8 培養(yǎng)基將hESC按照1×105個/孔鋪于6 孔板中，培養(yǎng)過夜。D1（代表ME 階段）：更換包含AC 和GSK-3抑制劑CHIR99021（CHIR）的Advanced RPMI內(nèi)胚層分化培養(yǎng)基Ⅰ，培養(yǎng)1 d。D3 （代表DE 階段）：更換添加AC 的Advanced RPMI 內(nèi)胚層分化培養(yǎng)基Ⅱ［20-21］，每日更換新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)2 d。收集D3細胞進行流式細胞檢測和免疫熒光染色，鑒定SOX17、EOMES、CXCR4和SMAD2的表達。

（2）誘導hESC 向NE 分化 D0（代表多能性階段）：利用含Rock抑制劑的Essential 8培養(yǎng)基將hESC按照5×105個/孔鋪于6 孔板中，培養(yǎng)24 h。D1～D8（代表NE 階段）：更換添加TGFβ 抑制劑SB431542 和BMP 抑制劑LDN193189 的Essential 6 培養(yǎng)基，每日更換新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)8 d。收集D8細胞進行流式細胞檢測和免疫熒光染色，鑒定PAX6、OCT4 和SOX1的表達。

1.2.4 RNA 的提取以及實時定量PCR 收取ME 分化過程中的D0 和D1 細胞，檢測EOMES、FOXA2和GSC的RNA 表達水平。利用500 μL Trizol 裂解細胞，隨后加入200 μL三氯甲烷，上下劇烈振蕩15 s，室溫靜置10 min 后，4°C 12 000×g離心15 min。離心后，轉移上層液體于新的1.5 mL EP 管中，加入等體積異丙醇，上下顛倒混勻后，室溫靜置15 min，4 ℃12 000×g離心15 min，可在EP 管底部觀察到白色RNA 沉淀。去除上清液，用75%乙醇（DEPC 水配制）和無水乙醇分別洗滌1 次，晾干沉淀后加入DEPC 水 溶 解， 定 量。 用All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix （AT341，北京全式金生物）試劑盒將RNA 反轉錄為cDNA，隨后在384孔板中進行實時定量PCR （real-time quantitative reverse transcription PCR， qRT-PCR）， 每 孔 加 入5 μL PowerUp?SYBR?Green預混液、1 μL 1 μmol/L 上游引物和下游引物、2.5 μL cDNA（1∶10 稀釋）和1.5 μL ddH2O，在熒光定量PCR 儀（CFX384 Touch，美國Bio-Rad 公司）上檢測。反應條件為Bio-Rad 熒光定量PCR 儀的PrimePCR 程序。qRT-PCR 所用引物的序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列Tab 1 Primer sequences for qRT-PCR

1.2.5 流式細胞術 向預先貼壁培養(yǎng)的hESC 中加入適量非動物源性重組酶TrypLE，消化細胞，使用含有血清的培養(yǎng)基重懸中和細胞，160×g離心5 min，用預冷PBS 清洗3 次。使用流式緩沖液稀釋抗體和活細胞染料，重懸清洗后的細胞團塊，利用抗體進行標記，避光4 ℃染色30 min 至1 h，隨后通過流式細胞儀（MoFlo Astrios EQ， 美國Beckman Coulter 公司）檢測不同抗體標記的蛋白熒光表達情況。

1.2.6 蛋白質印跡檢測 分別收取適量未處理hESC（0 h），AC 和GSK-3 抑制劑CHIR 處理12、24、36、48 h 的hESC，SMAD2KO、SMAD3KO 細胞或者在SMADKO 細胞中過表達外源性SMAD 蛋白的細胞樣品，利用RIPA 蛋白裂解液［20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4）、1 mmol/L EDTA、1% 甘油、150 mmol/L NaCl、1% NP40、1% 脫氧膽酸鈉］裂解細胞制備蛋白樣品，通過Pierce?Coomassie Plus（Bradford）檢測試劑進行蛋白定量后取適量蛋白樣品進行SDSPAGE，采用濕式轉膜法，5% BSA 溶液室溫搖床封閉1 h，加入一抗，4 ℃搖床孵育過夜。1×TBST 洗3次，加入熒光二抗，室溫避光孵育1 h，1×TBST 洗3次后顯影成像，通過雙色紅外激光成像系統(tǒng)（Odyssey CLx，美國LI-COR 公司）分析蛋白熒光強度。

1.2.7 免疫熒光染色 培養(yǎng)hESC 至合適密度，1×PBS 洗滌1 次后用4%多聚甲醛固定細胞，1%Triton X-100 通透2 min，5% BSA 溶液室溫封閉1 h，加入一抗4°C孵育過夜。1×TBST洗3次，加入熒光二抗，室溫避光孵育1 h，1×TBST 洗3 次，加入熒光染料DAPI 復染標記細胞核，室溫避光孵育15 min，1×TBST 洗3 次，使用熒光顯微鏡（ECLIPSE Ts2R，日本Nikon公司）采集圖像。

1.2.8 iTranscriptome數(shù)據(jù)庫分析 根據(jù)iTranscriptome［22］數(shù)據(jù)庫（http：//www.itranscriptome.org/），對小鼠原腸胚運動E6.5～E7.5時期SMAD2和SMAD3的RNA表達進行分析并得到它們的表達分布模式圖。

1.3 統(tǒng)計學方法

通過GraphPad Prism Version 9.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。所有實驗均進行3 次以上獨立重復，數(shù)據(jù)以均值±標準誤差的形式表示。組間比較采用非配對t檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 SMAD2和SMAD3在胚胎發(fā)育過程中的表達

SMAD2 和SMAD3 的蛋白序列高度相似，尤其是兩者的MH1 結構域的序列具有>90%的一致性。但是，SMAD2 包含了2 段插入序列：一段是連接2個螺旋結構的環(huán)延伸序列；另一段是靠近β 發(fā)夾結構的高度保守的E3 插入序列（圖1A）。在胚胎發(fā)育過程中，SMAD2 和SMAD3 具有不同的表達模式和豐度。iTranscriptome 數(shù)據(jù)庫顯示，小鼠原腸胚運動E6.5～E7.5 時期，Smad2的RNA 表達幾乎遍布整個上胚層，相比之下，Smad3的RNA 表達水平不高且分布相對較局限（圖1B）。hESC 需要TGFβ 信號來進行自我更新和分化。那么SMAD2 和SMAD3 的蛋白水平是否會在干細胞的不同階段也呈現(xiàn)出表達上的差異？hESC 在AC 和GSK-3 抑制劑CHIR 的處理下向ME 分化。蛋白質印跡法（Western blotting）結果顯示，SMAD2 在hESC 中的表達水平更高（圖1C）。利用Odyssey 成像系統(tǒng)軟件分析Western blotting 實驗的熒光強度顯示，在hESC 分化的前36 h，SMAD2 和SMAD3 的表達量比值可以達到3.5∶1～4.5∶1；當分化誘導達到48 h，SMAD3 的蛋白表達有所上調，SMAD2 和SMAD3 的表達量比值 接 近 于1.5∶1 （圖1D）。因 此，SMAD2 和SMAD3 在hESC 中的表達比例與其在小鼠原腸胚運動時期的表達比例較為相似——SMAD2 是最主要表達的調控因子。

圖1 SMAD2和SMAD3的表達模式Fig 1 Expression pattern of SMAD2 and SMAD3

2.2 單一敲除SMAD2 或者SMAD3 對hESC 多能性因子表達的影響

為了進一步研究SMAD2 和SMAD3 在hESC 中的功能，利用CRISPR/sgRNA 技術構建了SMAD2 KO 和SMAD3KO 細胞系。與野生型hESC 基因序列相比，SMAD2KO 細胞的4 號外顯子丟失了7 bp 堿基，而SMAD3KO 細胞的9 號外顯子丟失了101 bp堿基（圖2A）。Western blotting 結果顯示SMAD2 或SMAD3 蛋白分別在SMAD2KO 和SMAD3KO 細胞中被特異性敲除（圖2B）。為了鑒定SMAD2敲除和SMAD3敲除對hESC 多能性的影響，對多能性因子OCT4 和SOX2 進行了免疫熒光染色。結果顯示，SMAD2或SMAD3的敲除沒有影響OCT4 和SOX2 的表達。這說明單一敲除SMAD2或SMAD3并不會影響hESC 多能性因子的表達（圖2C）。但是，值得注意的是，在實驗過程中，無法在hESC 中獲得SMAD2和SMAD3的雙敲除克隆（數(shù)據(jù)未顯示）。推測這是因為同時敲除SMAD2和SMAD3將導致hESC 死亡。這說明TGFβ 至少需要通過一個SMAD2 或者SMAD3 轉錄因子來有效地維持hESC的多能性。

圖2 單一敲除SMAD2或者SMAD3對hESC多能性因子表達的影響Fig 2 Influence of SMAD2 knockout or SMAD3 knockout on the expression of pluripotent factors in hESCs

2.3 SMAD2 敲除和SMAD3 敲除對hESC 向NE 分化的影響

既然SMAD2敲除和SMAD3敲除不會影響hESC的多能性，那么接下來將檢測二者對于hESC 分化能力的影響。首先探究SMAD2 和SMAD3 是否在hESC向NE 分化的過程中扮演重要角色。通過從D1～D8 添加TGFβ 抑制劑SB431542 和BMP 抑制劑LDN193189可以誘導hESC向NE分化。第8日，通過流式細胞術分析發(fā)現(xiàn)，在野生型hESC、SMAD2KO和SMAD3KO細胞中，由PAX6 標記的NE 細胞群分布并無明顯差異（圖3A）。免疫熒光染色結果顯示，與野生型hESC 相比，無論是SMAD2KO 還是SMAD3KO 細胞，多能性因子OCT4 的表達不變或者稍有下降，但是NE標志因子PAX6和SOX1的表達呈現(xiàn)出不同程度的上調（圖3B）。這意味著SMAD2或SMAD3的敲除并不會影響hESC 向NE 的分化。相反，SMAD2KO細胞甚至呈現(xiàn)出比野生型hESC 更高的PAX6和SOX1的表達，表明SMAD2 缺失在某種程度上還促進了hESC向NE的分化。

圖3 SMAD2敲除和SMAD3敲除對hESC向NE分化的影響Fig 3 Effect of SMAD2 knockout or SMAD3 knockout on the NE differentiation of hESC

2.4 SMAD2 敲除和SMAD3 敲除對hESC 向DE 分化的影響

通過上述實驗已經(jīng)證實SMAD2敲除和SMAD3敲除不影響hESC 向NE 分化，甚至SMAD2敲除還能促進部分NE 標志因子的表達。接下來，需要確定這是否與ME 分化受阻所導致的繼發(fā)性NE分化增強有關。野生型hESC、SMAD2KO 和SMAD3KO 細胞分別受到GSK-3 抑制劑CHIR 和AC 處理1 d 后（D1）到達ME 階段，繼續(xù)添加AC 2 d使細胞分化到達DE階段。收取D3 細胞進行流式細胞分析，野生型hESC 和SMAD3KO 細胞能有效表達DE 標志因子SOX17、CXCR4和EOMES，而SMAD2KO 細胞中幾乎沒有發(fā)現(xiàn)SOX17 和EOMES 雙 陽 性 或 者SOX17 和CXCR4 雙陽性的細胞（圖4A）。同時，免疫熒光染色實驗證實，SOX17 和SMAD2 在SMAD2KO 細胞中沒有表達，而在SMAD3KO 細胞與野生型hESC 中均有表達（圖4B）。這一結果說明，SMAD2，而非SMAD3，在hESC 向DE 的分化過程中參與調控DE 相關基因的表達。同時，也說明SMAD2KO 細胞向DE 分化受阻，因此才會出現(xiàn)部分代償性的NE分化。

圖4 SMAD2敲除和SMAD3敲除對hESC向DE分化的影響Fig 4 Effect of SMAD2 knockout or SMAD3 knockout on the DE differentiation of hESC

2.5 過表達外源性SMAD2 對SMAD2KO 細胞向ME分化的影響

上述分析結果已表明SMAD2敲除會影響DE標志因子的表達。接下來，需要驗證SMAD2KO 細胞是否早在ME 階段就出現(xiàn)了分化異常。分別收集野生型hESC以及2種SMAD缺失細胞在GSK-3抑制劑CHIR和AC處理前（D0）和處理1 d后（D1）到達ME階段的RNA，并通過qRT-PCR實驗對ME的標志基因進行檢測。結果顯示，與野生型hESC相比，SMAD2KO細胞中ME的標志基因EOMES、FOXA2和GSC的表達顯著下降，證實SMAD2KO 細胞幾乎無法誘導ME 基因的表達；同時，SMAD3敲除對ME分化基因表達的影響甚微（圖5A）。那么SMAD2KO 細胞向ME 分化障礙，是否是由特異性缺失SMAD2導致的呢？利用Teton藥物誘導表達系統(tǒng)在SMAD2KO和SMAD3KO細胞中分別過表達外源性的人源SMAD2和SMAD3，進而檢測其向ME分化的能力。Western blotting結果顯示，在SMAD2KO和SMAD3KO細胞中分別成功地誘導了SMAD2 和SMAD3 的表達（圖5B）。qRT-PCR 結果顯示，外源性SMAD2 可以幾乎完全恢復EOMES、FOXA2以及GSC在SMAD2KO細胞中的表達；而在外源性SMAD3過表達前后，SMAD3KO細胞ME基因的表達水平差異沒有統(tǒng)計學意義（圖5C）。這些結果均說明，SMAD2和SMAD3對hESC向ME的分化調控存在差異；SMAD2 在hESC 向ME 分化的過程中扮演了至關重要的角色。

圖5 過表達外源性SMAD2對SMAD2KO細胞向ME分化的影響Fig 5 Effect of overexpressing exogenous SMAD2 in SMAD2KO cells on the ME differentiation

3 討論

TGFβ 家族的細胞因子及其下游的SMAD 信號轉導通路是多細胞動物發(fā)育和組織再生的控制核心。許多遺傳性和細胞性疾病都是由TGFβ 信號轉導紊亂所造成。SMAD2和SMAD3是TGFβ信號下游公認的重要信號轉導因子，與SMAD4 形成異源三聚體后入核調控下游基因的表達。除了SMAD2的MH1結構域包含一段E3 插入序列外，SMAD2 和SMAD3 的蛋白結構高度相似，但在調控干細胞分化、上胚層發(fā)育以及在病理情況下所介導的TGFβ 作用依然存在差異，而其中的調控機制尚不清楚［16，23］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)SMAD2 和SMAD3 在hESC 的多能性階段及分化的過程中，兩者的表達水平均存在差異。敲除SAMD2或SMAD3不會影響多能性因子OCT4 和SOX2 的表達，也不會干擾hESC 向NE 的分化。有趣的是，SMAD2敲除足以阻斷hESC 向ME 以及后續(xù)的DE 的分化，并引起部分SMAD2KO 細胞代償性地向外胚層分化；而SMAD3敲除不會影響該分化過程。由此可見，SMAD2對于hESC向ME分化更為關鍵。

SMAD2和SMAD3對于ESC的干性維持和ME分化具有不同的調控作用。在一些情況下，SMAD2 與SMAD3 的功能有冗余現(xiàn)象，但是不少研究表明SMAD2 往往比SMAD3 具有更廣泛的作用。例如，Th17 輔助性T 細胞的分化需要SMAD2 而不是SMAD3［24］。SMAD2或SMAD3缺失小鼠具有截然不同的表型。如果將SMAD3 重構到內(nèi)源性SMAD2 位點，可以部分挽救SMAD2 缺失導致的小鼠胚胎致死［25］。此外，SMAD2 特有的高度保守的E3 插入序列可能是導致SMAD2 和SMAD3 功能差異的關鍵。在沒有TGFβ 信號刺激的情況下，E3 序列能決定SMAD2 和SMAD3 在細胞內(nèi)的定位：敲除SMAD2 中的E3 序列，會使SMAD2 像SMAD3 一樣累積在細胞核中；反之，若將E3 序列插入到SMAD3 的MH1 結構域的相應位點，會使SMAD3 在細胞質中富集［15］。在小鼠ESC 中，從內(nèi)源性的SMAD2 中移除E3 序列（S2ΔE3），可以有效地干擾類胚體對于外源性AC 的快速應答。并且，這類S2ΔE3 細胞注入小鼠囊胚中所形成的嵌合體具有明顯的胚外中胚層異常，但是對胚胎本身的影響并不大［9］。

值得注意的是，與我們前期在小鼠ESC中的研究相比［9］，SMAD2的E3序列對于hESC的調控作用并不明顯。敲除SMAD2 特有的E3 插入序列對于hESC 向ME分化的影響非常短暫和有限（數(shù)據(jù)未顯示）。這些表型的差異可能與TGFβ在2種ESC中的作用狀態(tài)不同有關。始發(fā)態(tài)hESC 中，TGFβ 信號已經(jīng)被激活，SMAD2/3預結合在關鍵ME基因的啟動子上［26］。而在原始態(tài)小鼠ESC中，SMAD3和先驅因子FOXH1預結合在ME 基因的啟動子上，而SMAD2 則依賴于E3 序列積聚在細胞質中［9］。當TGFβ 信號啟動分化時，SMAD2-SMAD4復合物迅速入核，與SMAD3-FOXH1匯合并激活ME基因的轉錄。這進一步強調了SMAD2的E3插入序列作用的精確性和時效性［9］。

綜上所述，SMAD2 和SMAD3 在結構上高度相似，但主要是SMAD2，而非SMAD3，決定了hESC在TGFβ 信號的誘導下向ME 分化。這種功能上的差異可能并不是完全由SMAD2特有的E3插入序列所導致，其背后的分子作用機制仍需要更深一步的探索。闡明TGFβ信號通路中SMAD2和SMAD3差異性調控ESC 分化的原因，將有助于理解TGFβ 信號通路的機制與功能，進而為胚胎發(fā)育生物學、干細胞研究和疾病治療提供堅實的理論基礎和新的思考方向。

利益沖突聲明/Conflict of Interests

所有作者聲明不存在利益沖突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

作者貢獻/Authors'Contributions

趙冰楠主要完成細胞培養(yǎng)與分子實驗的工作，馬雙羽主要完成流式分析與免疫熒光染色的工作，胥春龍主要進行實驗指導與數(shù)據(jù)分析整理，王瓊主要負責論文整體構思與文章撰寫。所有作者均閱讀并同意了最終稿件的提交。

ZHAO Bingnan performed the cell culture and molecular experiments.MA Shuangyu conducted the flow cytometry analysis and immunofluorescence staining experiments. XU Chunlong guided this project and conducted data analysis. WANG Qiong designed and supervised the project and wrote the manuscript. All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2022-01-19

·Accepted：2022-04-10

·Published online：2022-04-28