宗凌姜鴻彥

1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院耳鼻咽喉科(廣州 510260)

2海南省人民醫(yī)院耳鼻咽喉醫(yī)院(海口 570311)

內(nèi)耳螺旋神經(jīng)元損傷導(dǎo)致的神經(jīng)性耳聾，目前缺乏有效的預(yù)防、治療措施，而干細(xì)胞移植可能成為治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷的一個有效手段[1-4]。前期研究證實：羊水干細(xì)胞（amniotic fluid stem cells，AFS）具有向神經(jīng)元定向分化的潛能，未經(jīng)誘導(dǎo)(92.0±1.0%)表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)記物Tuj1（anti-Neuronal Class III β-Tubulin(Tuj1)antibody），但缺乏神經(jīng)元形態(tài)特征[5]；而將人來源的AFS分別接種于小鼠基底膜和前庭組織來源的飼養(yǎng)層形成支持接觸-立體三維共培養(yǎng)模式，即使不添加神經(jīng)生長因子和信號誘導(dǎo)因子，僅用DMEM/F12作為培養(yǎng)基，約37-52%的AFS可定向分化為聽覺神經(jīng)元[6,7]；AFS經(jīng)懸滴培養(yǎng)形成擬胚體，具有神經(jīng)干性，與耳蝸基底膜共培養(yǎng)（二維培養(yǎng)模式，無立體支持接觸），并不能誘導(dǎo)擬胚體向形態(tài)典型的神經(jīng)元分化[8]，說明支持接觸-立體三維共培養(yǎng)模式是AFS分化為聽覺神經(jīng)元的前提條件，而了解其發(fā)生和調(diào)控機(jī)制，對于螺旋神經(jīng)元再生，及AFS豚鼠耳蝸內(nèi)移植的替代研究，及后續(xù)的臨床應(yīng)用具有重要的現(xiàn)實意義。

立體三維接觸是AFS及其他干細(xì)胞有效分化為神經(jīng)元/毛細(xì)胞的前提條件[9-11]，說明這種模式參與干細(xì)胞定向分化及調(diào)控，而內(nèi)耳支持細(xì)胞對AFS的分化作用仍不明確。文獻(xiàn)報道結(jié)合我們前期研究推測AFS本身就具有特殊性，不僅表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記物，也表達(dá)神經(jīng)干/祖細(xì)胞標(biāo)記物，并具有向神經(jīng)元自發(fā)分化的趨勢，提示AFS在向神經(jīng)元方向誘導(dǎo)上可能較其他種子細(xì)胞有優(yōu)勢[5-7]。另外，分別獲取前庭和基底膜來源的內(nèi)耳支持細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)前庭來源的飼養(yǎng)層分化效果要優(yōu)于基底膜[6,7]，說明二者的內(nèi)在差異可能也參與神經(jīng)元分化的調(diào)控。在哺乳類Corti器支持細(xì)胞群中存在P27kip1，其在于促使細(xì)胞退出細(xì)胞周期，停止分裂，保持不能增殖的狀態(tài)[12]；前庭和基底膜來源的飼養(yǎng)層細(xì)胞都表達(dá)P27kip1[5,6]，而兩者誘導(dǎo)神經(jīng)分化能力的差異是否與P27kip1表達(dá)量相關(guān)，仍有待研究。

實驗擬從AFS接種密度，內(nèi)耳支持細(xì)胞P27kip1表達(dá)差異入手，研究上述因素與AFS向神經(jīng)元定向分化的潛在聯(lián)系。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗小鼠：出生1～3d的C57BL/6J小鼠30-50只(雌雄不限)，由中山醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。

1.1.2 羊水標(biāo)本：由中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院提供，孕19～22周，經(jīng)B超引導(dǎo)下抽取羊水10-15ml。羊水取自產(chǎn)前檢查家庭，夫妻雙方均簽署知情同意書，研究經(jīng)中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.1.3 主要試劑：DAPI一抗、Tuj1一抗、P27kip1一抗購于美國Abcam公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 分離并培養(yǎng)擴(kuò)增AFS

將羊水接種于25cm2的培養(yǎng)瓶，第7天或第8天，根據(jù)羊水貼壁細(xì)胞的增殖情況，全量換液，繼續(xù)培養(yǎng)2～3d，觀察羊水貼壁細(xì)胞的生長狀態(tài)，決定是否需要傳代[4-7]。采用德國Miltenyi Biotec公司的c-Kit磁珠抗體，分選羊水中具有c-Kit標(biāo)記的AFS[6,13]。

1.2.2 基底膜和前庭來源的內(nèi)耳支持細(xì)胞飼養(yǎng)層的制備

解剖顯微鏡下，分離基底膜、橢圓囊和球囊組織，經(jīng)酶解消化細(xì)胞培養(yǎng)6天；收集懸浮的內(nèi)耳干細(xì)胞空心球體，再次酶解消化，用DMEM/F12重懸細(xì)胞，按1×105/cm2的密度接種于無菌蓋玻片上，免疫熒光鑒定P27kip1的表達(dá)[6,7]。

1.2.3 內(nèi)耳支持細(xì)胞對AFS（不同密度接種）的定向分化

制備基底膜來源的內(nèi)耳支持細(xì)胞飼養(yǎng)層，24小時后，將細(xì)胞培養(yǎng)液棄去，將AFS消化、離心，用DMEM/F12 重懸細(xì)胞，分別將 2×105、4×105、6×105、8×105、10×105個細(xì)胞接種在制備好的飼養(yǎng)層上培養(yǎng)6天，檢測Tuj1的表達(dá)[6]；

1.2.4 內(nèi)耳支持細(xì)胞（基底膜和前庭來源）對AFS的定向分化

分別選取基底膜和前庭組織來源的空心球體，按接種密度1×105/cm2制備內(nèi)耳支持細(xì)胞飼養(yǎng)層，免疫熒光檢測這兩種飼養(yǎng)層細(xì)胞P27kip1的表達(dá)；將10×105個AFS分別接種于這兩種飼養(yǎng)層上，用DMEM/F12培養(yǎng)6天，檢測Tuj1的表達(dá)[6,7]。

1.2.5 細(xì)胞計數(shù)

免疫熒光染色 Tuj1、P27kip1、DAPI，以細(xì)胞突起長度為胞體直徑5倍以上的神經(jīng)樣細(xì)胞表型作為形態(tài)學(xué)評價指標(biāo)，使用Leica顯微鏡觀察；分別選取5個樣本，每個樣本隨機(jī)選取4個不同視野，計數(shù)20倍鏡視野下觀察到的Tuj1、P27kip1陽性細(xì)胞數(shù)與DAPI陽性細(xì)胞數(shù)之比，計算20個視野的平均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

陽性細(xì)胞表達(dá)率以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SSPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，組間比較采用Oneway ANOVA檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AFS接種密度相關(guān)性

分別將2×105、4×105、6×105、8×105、10×105個AFS接種在基底膜來源的飼養(yǎng)層表面，經(jīng)支持接觸-立體三維共培養(yǎng)6天，AFS可以分化為Tuj1陽性且形態(tài)典型的神經(jīng)元。AFS以高密度(10×105)接種于飼養(yǎng)層能產(chǎn)生更多形態(tài)典型的神經(jīng)元(20倍鏡視野下，平均208±25.7條神經(jīng)突起)，相對于低密度(2×105)接種(20倍鏡視野下，平均41±12.3條神經(jīng)突起)(圖1)；隨著接種細(xì)胞數(shù)的增加，神經(jīng)突起的數(shù)量增多(P＜0.01，n=10)，神經(jīng)突起的長度基本保持不變，平均88±7.8μm(P＞0.05，n=10)(圖2)。

圖1 AFS分別以高密度(10×105)和低密度(2×105)接種于飼養(yǎng)層細(xì)胞表面。A為低密度接種；B為高密度接種；a，d紅色熒光代表Tuj1；b，e 藍(lán)色熒光代表DAPI；c，f疊加圖像，標(biāo)尺=25μm。Fig.1 The AFS were inoculated on the feeder layer with low density(2×105)（A）and high density(10×105)(B),respectively.a,d red fluorescence represents Tuj1;b,e Blue fluorescence represents DAPI;c,f Overlay image;Bar=25μm.

圖2 AFS分別以2×105、4×105、6×105、8×105、10×105接種于飼養(yǎng)層表面，低密度(2×105)和高密度(10×105)相比較，高密度分化所得的神經(jīng)突起數(shù)量增多(P＜0.01，n=10,A)，神經(jīng)突起長度無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05，n=10,B)；C神經(jīng)突起數(shù)量隨著接種比例的增加而逐漸上升；神經(jīng)突起長度隨著接種比例的增加，基本保持不變。Fig.2 The AFS were inoculated on the feeder layer with 2×105,4×105,6×105,8×105and 10×105,respectively.2×105represents low density.10×105represents high density.The number of neurites was significantly higher on high density than low density(P＜0.01,n=10,A),the length of neurites have no statistical differences(P＞0.05,n=10,B).With the increase of inoculation proportion,the number of neurites gradually increased,but the length of neurites remained unchanged(C).

2.2 內(nèi)耳支持細(xì)胞P27kip1表達(dá)差異對神經(jīng)元分化的影響

將基底膜和前庭組織來源的空心球體制備飼養(yǎng)層，都表達(dá)內(nèi)耳支持細(xì)胞標(biāo)記物P27kip1；前庭P27kip1（79.8±8.0%），明顯高于基底膜（46.9±9.7%）(P＜0.01，n=10，圖3)。

圖3 基底膜與前庭來源的飼養(yǎng)層細(xì)胞都表達(dá)P27kip1。A基底膜，B 前庭，a.d P27kip1，b.e DAPI，c.f疊加圖像；C 基底膜與前庭P27kip1表達(dá)量對比，前庭P27kip1明顯高于基底膜(P＜0.01，n=10)，標(biāo)尺=50μm。Fig.3 The P27kip1was on the feeder layer cells derived from the Corti’s organ(A)and vestibular tissue(B).a,d P27kip1;b,e DAPI;c,f Overlay image;(C)the comparison of P27kip1between the Corti’s organ and vestibule tissue.The P27kip1on the vestibule tissue was significantly higher than the Corti’s organ(P＜0.01，n=10);Bar=50μm.

而將AFS種植于前庭組織來源的內(nèi)耳支持細(xì)胞飼養(yǎng)層，分化得到的神經(jīng)突起數(shù)量(20倍鏡視野下，平均81.1±15.6條)和神經(jīng)突起長度(20倍鏡視野下，平均110.9±11.9μm)，都優(yōu)于基底膜(20倍鏡視野下，平均41.4±12.9條，平均長度90.1±12.9μm，P＜0.01，n=10，圖4)；

圖4 AFS分別接種于基底膜（A）和前庭（B）組織來源的內(nèi)耳支持細(xì)胞飼養(yǎng)層。a.d Tuj1，b.e DAPI，c.f疊加圖像；與基底膜相比，前庭來源的飼養(yǎng)層分化所得的神經(jīng)突起數(shù)量和長度增多(P＜0.01,n=10,C,D)，標(biāo)尺=50μm。Fig.4 The AFS were inoculated on the feeder layer derived from the Corti’s organ(A)and vestibular tissue(B).a,d Tuj1;b,e DAPI;c,f Overlay image;The number and length of neurites was significantly higher on vestibular tissue than Corti’s organ(P＜0.01,n=10,C,D)，Bar=50μm.

基底膜和前庭組織來源的飼養(yǎng)層都表達(dá)內(nèi)耳支持細(xì)胞標(biāo)記物P27kip1，前庭P27kip1表達(dá)量明顯高于基底膜；前庭組織來源的內(nèi)耳支持細(xì)胞對神經(jīng)元定向分化的能力，明顯強(qiáng)于基底膜組織。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)P27kip1表達(dá)量與分化的神經(jīng)突起的數(shù)量和長度均呈正相關(guān)(圖5)。

圖5 內(nèi)耳支持細(xì)胞飼養(yǎng)層P27kip1表達(dá)量與神經(jīng)突起的數(shù)量（A）和長度（B）呈正相關(guān)。Fig.5 The P27kip1in the inner ear supporting cells feeder layer was positively correlated with the number(A)and length(B)of neurites.

3 討論

由螺旋神經(jīng)元損傷導(dǎo)致的神經(jīng)性耳聾是耳科常見疾病之一，雖已有文獻(xiàn)證實，胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞在體外能分化為神經(jīng)元，但由于接種活體動物有致瘤性，限制了此類干細(xì)胞的臨床應(yīng)用。AFS具有全能干細(xì)胞的特點[13]，接種活體動物也無致瘤性。前期研究已證實，AFS有向神經(jīng)元定向分化的潛能[5]，與小鼠基底膜或前庭組織來源的內(nèi)耳支持細(xì)胞共培養(yǎng)，能定向分化為神經(jīng)元。探尋其定向分化機(jī)制，有助于深入神經(jīng)元分化、再生和保護(hù)的相關(guān)研究，并對耳科基礎(chǔ)研究向臨床運用轉(zhuǎn)化具有重要的前期指導(dǎo)意義。

小鼠內(nèi)耳支持細(xì)胞誘導(dǎo)AFS定向分化為神經(jīng)元的機(jī)制迄今并不明確。研究已證實未經(jīng)誘導(dǎo)的多個不同AFS樣本，神經(jīng)元標(biāo)記物Tuj1呈強(qiáng)陽性，傳代30次后表達(dá)仍未減弱，提示AFS在向神經(jīng)元方向分化上較其他種子細(xì)胞可能更具有優(yōu)勢[5]。課題組前期研究已證實內(nèi)耳支持細(xì)胞在體外可能通過Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控AFS向神經(jīng)元方向分化[6-8]，推測AFS內(nèi)在Wnt信號參與調(diào)控(密度/劑量依賴性)。隨著接種比例的提高，更高比例的Wnt信號相關(guān)因子參與促進(jìn)神經(jīng)元分化。同時，低密度接種AFS已經(jīng)可以有效地分化為神經(jīng)元，具有和高密度接種一樣的神經(jīng)突起長度，說明神經(jīng)突起長度(88±7.8μm)可能已達(dá)到穩(wěn)定/接近成熟狀態(tài)，或歸因于AFS誘導(dǎo)能力的極限。增加AFS數(shù)量，可使神經(jīng)突起數(shù)量增加，提高移植效率。

分別獲取基底膜和前庭來源的內(nèi)耳干細(xì)胞空心球體制備飼養(yǎng)層，接種的細(xì)胞密度都是1×105/cm2，對基底膜和前庭來源的飼養(yǎng)層進(jìn)行免疫熒光染色，鑒定內(nèi)耳支持細(xì)胞標(biāo)記物P27kip1，發(fā)現(xiàn)雖然接種細(xì)胞密度一樣，但前庭P27kip1表達(dá)量確實比基底膜要高。推測可能前庭制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞存活率比基底膜要好，因此以相同密度接種，前庭和基底膜P27kip1的表達(dá)量差異顯著，所以我們才進(jìn)一步提出假設(shè)，可能羊水干細(xì)胞向神經(jīng)元定向分化與P27kip1相關(guān)；另外，在小鼠胚胎發(fā)育的第13至14天，超過80%的內(nèi)耳祖細(xì)胞精確分化為終末型毛細(xì)胞和支持細(xì)胞。哺乳動物耳蝸毛細(xì)胞損傷后自身不能分裂增生，同時其周圍的支持細(xì)胞亦保持不能分裂增生的狀態(tài)，不能轉(zhuǎn)化成毛細(xì)胞，而P27kip1在這當(dāng)中起重要作用[14]，與毛細(xì)胞和支持細(xì)胞祖細(xì)胞停止有絲分裂有關(guān)；在P27Kip1基因被靶向敲除的小鼠模型中，胚體發(fā)育第14天后，感覺祖細(xì)胞增殖仍持續(xù)存在，導(dǎo)致出現(xiàn)多余的毛細(xì)胞和支持細(xì)胞，這表明成熟支持細(xì)胞中P27Kip1持續(xù)表達(dá)可能有助于維持該組織的靜止?fàn)顟B(tài)。另外，Corti器由精確排列的內(nèi)、外毛細(xì)胞，支持細(xì)胞等構(gòu)成；而一排內(nèi)毛細(xì)胞和三排外毛細(xì)胞間都有P27Kip1表達(dá)的內(nèi)耳支持細(xì)胞相間隔并依托包繞，P27Kip1可能定向誘導(dǎo)與其直接接觸的內(nèi)耳祖細(xì)胞退出有絲分裂形成終末型毛細(xì)胞?；啄ず颓巴ソM織來源的飼養(yǎng)層都表達(dá)內(nèi)耳支持細(xì)胞標(biāo)志物P27kip1；而將AFS種植在內(nèi)耳支持細(xì)胞表面，模擬耳蝸Corti器的分化過程，發(fā)現(xiàn)37-52%的AFS可定向分化為神經(jīng)元，推測可能是內(nèi)耳支持細(xì)胞P27kip1誘導(dǎo)與其直接接觸的AFS停止有絲分裂，退出細(xì)胞周期，開始自發(fā)的向神經(jīng)元方向分化[6,7]。前庭來源內(nèi)耳支持細(xì)胞P27kip1的表達(dá)量高于基底膜，在與AFS直接接觸共培養(yǎng)中，前庭分化得到的神經(jīng)突起在數(shù)量和長度方面均優(yōu)于基底膜，P27kip1與神經(jīng)突起的數(shù)量和長度呈正相關(guān)，推測內(nèi)耳支持細(xì)胞飼養(yǎng)層P27kip1增多，導(dǎo)致更多的AFS停止有絲分裂，失去干性，又由于本身具有向神經(jīng)元定向分化的特殊性，最終產(chǎn)生大量神經(jīng)元。

因此，AFS接種密度以及內(nèi)耳支持細(xì)胞P27kip1表達(dá)水平與調(diào)控AFS神經(jīng)元定向分化有關(guān)。適當(dāng)增加AFS接種比例、采用前庭來源的內(nèi)耳支持細(xì)胞作為飼養(yǎng)層、有效調(diào)控Wnt信號、過表達(dá)P27kip1基因等，均有助于AFS向神經(jīng)元分化，提高效率。這對臨床轉(zhuǎn)化研究具有參考價值。

當(dāng)然，本研究仍存在局限性。深入Wnt信號因子、P27kip1基因的相關(guān)研究，分析相應(yīng)內(nèi)耳支持細(xì)胞飼養(yǎng)層對AFS神經(jīng)元分化的影響，可能更好闡述其相關(guān)機(jī)制。