鄭凡君 徐聰 張晨 李子博 李雨青 任巍 郭維維 趙輝

中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科醫(yī)學(xué)部；國(guó)家耳鼻咽喉疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心；解放軍耳鼻咽喉研究所；聾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；聾病防治北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（北京 100853）

聽(tīng)覺(jué)色素障礙（Auditory-pigmentary disorders，APDs）指的是先天性感音神經(jīng)性聽(tīng)力損失與先天性虹膜、頭發(fā)或皮膚色素缺陷聯(lián)合出現(xiàn)的一類神經(jīng)嵴疾??；主要包括了Waardenburg綜合征、Tietz綜合征、眼白化病、斑駁病伴發(fā)先天性耳聾等[1-3]。c-KIT是人類斑駁病的主要致病基因，參與調(diào)控神經(jīng)嵴細(xì)胞的發(fā)育、遷移及黑素細(xì)胞的形成、遷移、增殖和分化[4]。截止目前報(bào)道的臨床病例中位于胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域區(qū)的突變會(huì)導(dǎo)致先天性色素障礙伴先天性耳聾[2,5-8]。動(dòng)物模型研究報(bào)道中，KIT基因突變可出現(xiàn)先天性耳聾伴色素分布異常的表現(xiàn)，這與人類臨床病例表現(xiàn)具有一定的相似性[9-13]，這些研究加強(qiáng)了斑駁病與各種形式APDs的臨床相似性。動(dòng)物模型研究中研究者普遍認(rèn)為，KIT基因功能缺失性突變后無(wú)法調(diào)控黑素細(xì)胞的遷移和分化，從而導(dǎo)致了血管紋中間細(xì)胞的減少和缺失，內(nèi)淋巴電位消失，毛細(xì)胞無(wú)法正常產(chǎn)生機(jī)-電反應(yīng)，導(dǎo)致感音神經(jīng)性聾。但截止目前為止，KIT突變導(dǎo)致APDs的病理機(jī)制及分子機(jī)制研究仍不明確。2005年Ruan等人建立了KitF856S（Wads）小鼠模型，并對(duì)該模型純合突變小鼠的白化、貧血、耳聾、不育和肥大細(xì)胞缺乏進(jìn)行了報(bào)道，強(qiáng)調(diào)了該模型可用于Kit突變導(dǎo)致多種疾病的研究[12]；但關(guān)于此模型各種病變機(jī)制均未作深入研究。由于該模型相較于之前報(bào)道的模型進(jìn)一步明確了Kit突變的位點(diǎn)，且該位點(diǎn)位于KIT基因編碼酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域區(qū)，與人類臨床病例報(bào)道的突變位于同一結(jié)構(gòu)域區(qū)。因此利用該模型對(duì)KIT突變引起APDs耳聾的聽(tīng)力變化表型、病理機(jī)制及相關(guān)分子機(jī)制進(jìn)行研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 研究模型

KitF856S（Wads）小鼠模型，該模型由南京大學(xué)高翔教授所有，是Kit基因(c.2567T＞C,p.F856S)錯(cuò)義突變，突變點(diǎn)位于18號(hào)外顯子的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域區(qū)。

1.2 家系建立與篩選

向南京大學(xué)高翔教授申請(qǐng)獲得使用授權(quán)后，同窩胚胎復(fù)蘇后，取同窩雜合型雄鼠及雜合型雌鼠、野生型雌鼠兩種配繁方式進(jìn)行繁育，并對(duì)繁育后代行鼠尾基因型鑒定。

1.3 聽(tīng)性腦干反應(yīng)測(cè)試

使用TDT RZ6系統(tǒng)，記錄電極放置于顱頂，參考電極放置于同側(cè)耳后，接地電極至于對(duì)側(cè)耳后。頻率分別選用短聲（Click）及短聲（Tone-pip）4kHz、8kHz、16kHz、24kHz、32kHz，自 最 大 輸 出 功 率90dBSPL給聲刺激，以引出可辨認(rèn)的ABR波I波的最小聲強(qiáng)定為閾值，刺激強(qiáng)度以10dBSPL遞減，接近閾值時(shí)以5dBSPL遞減。

1.4 掃描電鏡及透射電鏡

使用雙束掃描電鏡（美國(guó)FEI，Helios Nano lab 600i）及透射電子顯微鏡（美國(guó) FEI，TECNAI Spirit120kV）。聽(tīng)力監(jiān)測(cè)至8周，取同窩不同表型小鼠，處死后取出耳蝸，經(jīng)固定脫鈣后，于0.1M的PB溶液中解剖耳蝸，充分暴露膜迷路，并完整取下螺旋韌帶及血管紋。將標(biāo)本使用1%四氧化鋨工作液進(jìn)行后固定，2%單寧酸導(dǎo)電染色，梯度脫水并進(jìn)行臨界點(diǎn)干燥后鍍膜，而后進(jìn)行掃描電鏡觀察。梯度脫水后的血管紋分為頂、中、底三段，包埋后固化再延樣品長(zhǎng)軸超薄連續(xù)切片，行透射電子顯微鏡觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用GraphPad Prism 9.0軟件分析數(shù)據(jù)。各頻率聽(tīng)力閾值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間采用單向方差分析，P＜0.05具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外觀毛色表型

家系內(nèi)野生型小鼠與家系外C57BL/6J小鼠具有一樣的外觀及毛色分布表型，既全身皮膚毛色為黑色；雜合型小鼠則表現(xiàn)為全部具有腹部白斑及白毛，其中少量個(gè)體還有少量局部的背部白斑及白毛，四肢及尾巴靠近尾端局部皮膚白化；而純合型小鼠則變現(xiàn)為全身皮膚白化及白毛。詳見(jiàn)圖1：

圖1 同窩野生型、雜合型及純合型小鼠毛色分布表型。ac為同窩野生型小鼠，d-f為雜合型小鼠，g-i為純合型小鼠。紅色虛線表示了雜合型小鼠及純合型小鼠皮膚或毛色異常的位置，紅色箭頭標(biāo)注出不同表型小鼠虹膜顏色均為黑色。Fig.1 Pigment distribution phenotype of wild-type,heterozygous and homozygous mice.a-c were wild-type mice,d-f were heterozygous mice,and g-i were homozygous mice.The red dotted lines showed abnormal skin or hair pigment in heterozygous and homozygous mice,and the red arrows showed black iris in mice with different phenotypes.

2.2 聽(tīng)力表型

將家系外野生型C57BL/6J小鼠及家系內(nèi)不同配繁方式野生型小鼠分為3組，每組5只小鼠，對(duì)3組小鼠自2周開(kāi)始每周測(cè)聽(tīng)至8周，發(fā)現(xiàn)家系外野生型小鼠及家系內(nèi)不同配繁方式獲得的野生型小鼠的聽(tīng)力形成及變化情況基本相似，在2周齡時(shí)家系外野生型小鼠的聽(tīng)力與家系內(nèi)野生型小鼠各頻有一定的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖2）。將同窩小鼠分為野生型小鼠、雜合型小鼠、純合型小鼠3組，對(duì)3組小鼠自3周開(kāi)始每周測(cè)聽(tīng)至8周，野生型及雜合型小鼠聽(tīng)力表型總體表現(xiàn)為低頻（click、4k、8k、16k）在3周后趨于穩(wěn)定。純合型小鼠在3周時(shí)尚有聽(tīng)力，而后隨周齡逐漸下降，觀察至8周時(shí)其聽(tīng)力在8k及16k兩個(gè)頻率仍保有一定的聽(tīng)力，其平均閾值分別為：78.75dBSPL和81.25dBSPL（圖3、4）。

圖2 家系外與家系內(nèi)不同配繁方式野生型小鼠聽(tīng)力圖。其中A-WT為家系外野生型C57BL/6J小鼠，B-WT為家系內(nèi)野生型與雜合型小鼠后代中的野生型小鼠，C-WT為家系內(nèi)雜合型與雜合型小鼠后代中的野生型小鼠。(***P＜0.001,**P＜0.01,*P＜0.05)Fig.2 Audiogram of wild type mice under different breeding patterns inside the family and C57BL/6J mice.A-WT refers to wild-type C57BL/6J mice independent from the family,BWT refers to wild-type offspring mice under heterozygous with wild-type breeding pattern,C-WT refers to wild-type offspring mice under heterozygous with heterozygous breeding pattern.(***P＜0.001,**P＜0.01,*P＜0.05)

圖3 家系內(nèi)不同表型小鼠聽(tīng)力圖。(****P＜0.0001)Fig.3 Audiogram of mice with different phenotypes in the family.(****P＜0.0001)

圖4 家系內(nèi)純合型突變小鼠聽(tīng)力隨周齡變化圖。（*P＜0.05）Fig.4 Audiogramofhomozygous miceinthefamily.(*P＜0.05)

2.3 家系遺傳模式確認(rèn)

遺傳模式分析：對(duì)家系內(nèi)所生小鼠于P7時(shí)取鼠尾行PCR測(cè)序，基因型鑒定，并結(jié)合聽(tīng)力篩查情況繪制出該模型的遺傳家系圖（圖5）。自F1代開(kāi)始對(duì)家系內(nèi)雜合配雜合模式繁育的小鼠個(gè)體計(jì)數(shù)后進(jìn)行卡方適合度檢驗(yàn)提示家系的耳聾伴色素異常的遺傳方式符合孟德?tīng)柍Ｈ旧w隱性遺傳（表1）。

表1 卡方適合度檢驗(yàn)Table 1 Chi-square fitness test

2.4 基底膜掃描電鏡

8周測(cè)聽(tīng)后取家系內(nèi)同窩野生型、雜合型、純合型小鼠，取耳蝸后對(duì)基底膜行掃描電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)野生型與雜合型的三轉(zhuǎn)內(nèi)、外毛細(xì)胞及其他支持細(xì)胞結(jié)構(gòu)無(wú)明顯異常。純合型三轉(zhuǎn)的內(nèi)毛細(xì)胞及其纖毛未見(jiàn)明顯異常，外毛細(xì)胞可見(jiàn)部分纖毛缺失，殘余頭板；部分區(qū)域外毛細(xì)胞缺失，基底膜上皮化；以底轉(zhuǎn)及頂轉(zhuǎn)最為明顯嚴(yán)重。（詳見(jiàn)圖6g-i所示）。

圖6 同窩野生型、雜合型及純合型小鼠基底膜掃描電鏡。紅色箭頭所指為缺失的外毛細(xì)胞。Fig.6SEM image of basal membrane of wild-type,heterozygous and homozygous mice in the same litter.The red arrows indicated the absence outer hair cells.

2.5 血管紋透射電鏡

對(duì)血管紋行透射電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)野生型與雜合型的三轉(zhuǎn)血管紋厚度、三層細(xì)胞（邊緣細(xì)胞、中間細(xì)胞、基底細(xì)胞）的分布及結(jié)構(gòu)無(wú)明顯異常；而純合型的三轉(zhuǎn)血管紋均明顯變薄，其三層細(xì)胞結(jié)構(gòu)明顯異常：邊緣細(xì)胞結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯異常，但相較于野生型個(gè)體其細(xì)胞間隔增大，緊密連接松散；中間細(xì)胞（圖8中紅色★）數(shù)量顯著減少（圖9a），其胞質(zhì)中黑色素顆粒似乎相對(duì)減少，頂、中轉(zhuǎn)的細(xì)胞指突紊亂，底轉(zhuǎn)細(xì)胞指突消失；基底細(xì)胞（圖8中紅色）排列紊亂，細(xì)胞間緊密連接異常，連接疏松，與螺旋韌帶屏障界限模糊；毛細(xì)血管明顯減少（圖9c），且在野生型及雜合型個(gè)體毛細(xì)血管周圍可觀察到巨噬樣-黑素細(xì)胞（圖8中紅色），而在純合型個(gè)體中未觀察到典型的巨噬樣-黑素細(xì)胞（圖9b）。

圖7 同窩野生型、雜合型及純合型小鼠血管紋透射電鏡。紅色虛線標(biāo)注為血管紋。Fig.7 TEM image of the stria vascularis of wild-type,heterozygous and homozygous mice.The red dotted lines showed the stria vascularis.

圖8 同窩野生型、雜合型及純合型小鼠血管紋透射電鏡。其中紅色★為中間細(xì)胞，紅色為基底細(xì)胞，紅色△為毛細(xì)血管，紅色為巨噬樣-黑素細(xì)胞。Fig.8 TEM image of the stria vascularis of wild-type,heterozygous and homozygous mice.Red★refers to the intermediate cell（IC）,red refers to the basal cell（BC）,red △ refers to the capillary,and redrefers to Perivascular-resident macrophage-like melanocytes（PVM）.

圖9 透射電鏡中間細(xì)胞、PVM及毛細(xì)血管計(jì)數(shù)分析圖（***P＜0.001,**P＜0.01,**P＜0.05）。Fig.9 Analysis of intermediate cells，PVM，and blood capillaries of TEM.

3 討論

本研究再次驗(yàn)證了KitF856S（Wads）小鼠家系的色素分布異常伴先天性耳聾的突變性狀符合孟德?tīng)枂位虺Ｈ旧w隱性遺傳規(guī)律。在Ruan等人關(guān)于此模型耳聾、色素分布異常、血管紋異常，Corti器可疑病理變化的基礎(chǔ)上[12]，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)純合型小鼠初期聽(tīng)力表現(xiàn)為中度耳聾，各頻聽(tīng)力部分保留，后隨周齡逐漸下降，并明確了內(nèi)耳病理學(xué)的具體變化：血管紋中間細(xì)胞和毛細(xì)血管周圍駐留的巨噬樣-黑素細(xì)胞（Perivascular-resident macrophagelike melanocytes，PVM）的減少，毛細(xì)血管減少，基底膜外毛細(xì)胞的缺失。

該模型家系內(nèi)純合突變個(gè)體同時(shí)表現(xiàn)出皮膚毛色白化伴耳聾，雜合型個(gè)體表現(xiàn)出皮膚毛色的局部異常不伴耳聾，且二者虹膜顏色均正常（圖1），其毛色分布表型與人類斑駁病表現(xiàn)相似。色素分布異常和耳聾兩種性狀同時(shí)受到Kit基因的調(diào)控，色素異常表型為顯性遺傳，而耳聾表型為隱性遺傳。家系內(nèi)不同配繁方式的野生型小鼠與家系外野生型小鼠聽(tīng)力變化之間在聽(tīng)力成熟后無(wú)明顯差異，家系內(nèi)雜合型和野生型小鼠聽(tīng)力變化之間亦無(wú)明顯差異（圖2、3）。說(shuō)明家系內(nèi)野生型小鼠及雜合型小鼠聽(tīng)力正常，聽(tīng)力表型遺傳穩(wěn)定。純合型小鼠聽(tīng)力自形成初期已表現(xiàn)為全頻中度聽(tīng)力下降，并隨周齡漸進(jìn)性下降（圖3，4所示）。聽(tīng)力表型與已報(bào)道的W（s）、W（v）小鼠及W（s）大鼠的聽(tīng)力變化相似[9,10,14,15]。但我們注意到純合小鼠聽(tīng)力低頻（click、4kHz）及高頻（24kHz、32kHz）早于 中 頻（8kHz、16kHz）表現(xiàn)出隨周齡下降，而8kHz、16kHz聽(tīng)力在16W時(shí)最大刺激無(wú)法引出（僅1只純合型小鼠，結(jié)果未顯示），其聽(tīng)力下降的變化與外毛細(xì)胞頂轉(zhuǎn)和底轉(zhuǎn)異常表現(xiàn)重于中轉(zhuǎn)相符；而對(duì)于這一現(xiàn)象還需待進(jìn)一步的研究。這可能與聽(tīng)力形成過(guò)程中耳蝸黑素細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞的遷移、分化等有關(guān)，而遷移的多少可能與聽(tīng)力損失的程度相關(guān)。我們的研究觀察到純合型小鼠血管紋中間細(xì)胞及PVM均顯著減少或缺失，且毛細(xì)血管明顯減少，血管紋三層細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂（圖7、8）。耳蝸血管紋的黑素細(xì)胞是由神經(jīng)嵴細(xì)胞遷移并分化來(lái)的[16,17]，既往包括W（s）、W（v）小和W（s）大鼠的研究證實(shí)Kit突變可干擾神經(jīng)嵴來(lái)源的黑素細(xì)胞的發(fā)育遷移，導(dǎo)致中間細(xì)胞數(shù)量減少，并引起EP幅值下降或缺失，出現(xiàn)感音神經(jīng)性耳聾[9,10,14,15]。這與我們觀察到的KitF856S模型純合小鼠內(nèi)耳病變一致，可能說(shuō)明致病機(jī)制有一定的相似性。PVM最初被認(rèn)為是巨噬細(xì)胞，但在后續(xù)的研究中發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞不同于經(jīng)典的巨噬細(xì)胞，還同時(shí)表達(dá)多種黑素細(xì)胞標(biāo)志物，是一種混合類型的細(xì)胞，其受到局部組織環(huán)境中有害因素刺激時(shí)可產(chǎn)生黑色素[18,19]。而黑色素在組織穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要的免疫作用包括利用緩沖鈣調(diào)節(jié)鈣離子平衡，清除重金屬、外來(lái)蛋白和脂質(zhì)，并促進(jìn)抗氧化活性[20,21]。同時(shí)PVM作為巨噬細(xì)胞，亦在免疫防御和修復(fù)中發(fā)揮作用[22,23]。由此可見(jiàn)PVM在耳蝸血管紋中的作用比我們之前理解的要更多。此外PVM和內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接和信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)于維持完整的血迷路屏障及其正常功能都極為重要[24,25]。而在之前的研究報(bào)道中，并未對(duì)PVM進(jìn)行深入的研究，W（s）大鼠研究中曾報(bào)道突變體毛細(xì)血管網(wǎng)的廣泛性破壞，可能導(dǎo)致了內(nèi)耳的缺血缺氧[9]，這也許與我們觀察注意到的PVM的減少有潛在的關(guān)系，PVM的減少和缺失可能是Kit突變致聾的另一個(gè)重要因素。純合型小鼠基底膜外毛細(xì)胞或其纖毛部分缺失，考慮到毛細(xì)胞和血管紋的依存關(guān)系，可能是由于血管紋的異常而導(dǎo)致的進(jìn)行性變化[26]。

結(jié)合以上討論，我們推測(cè)Kit突變導(dǎo)致KitF856S突變小鼠耳聾的機(jī)制可能有以下兩點(diǎn)：第一，Kit突變導(dǎo)致了血管紋中間細(xì)胞的減少甚至缺失，可能無(wú)法形成正常的EP完成機(jī)-電傳導(dǎo)，導(dǎo)致耳聾。第二，Kit突變有可能影響了PVM的遷移和分化，導(dǎo)致血管紋毛細(xì)血管的減少或發(fā)育不良，破壞了血迷路屏障功能，導(dǎo)致血管紋各層組織缺血缺氧，加劇邊緣細(xì)胞、基底細(xì)胞之間細(xì)胞連接（緊密連接、縫隙連接）的異常，進(jìn)一步破壞了血管紋的功能。以上兩點(diǎn)可能共同導(dǎo)致了毛細(xì)胞的凋亡及結(jié)構(gòu)異常（纖毛消失）。

據(jù)Ruan等人報(bào)道的該模型純合型小鼠產(chǎn)出較低，207只中僅有12只突變白鼠產(chǎn)出[12]，我們?cè)诩蚁禂U(kuò)繁中遇到了同樣的問(wèn)題，從F2代開(kāi)始雜合配雜合方式的純合型小鼠產(chǎn)出率為11.5%（6/52），低于預(yù)期的25%，但具體原因不詳。我們推測(cè)可能是純合型小鼠可能有其他系統(tǒng)的病變，有一定的胚胎致死率，后續(xù)我們也將對(duì)于其他器官如：腎、腸等進(jìn)行一定的探索研究。由于純合突變個(gè)體數(shù)量有限，我們對(duì)于KIT基因突變導(dǎo)致耳聾的時(shí)空規(guī)律探索還有欠缺，KIT基因突變導(dǎo)致毛細(xì)胞凋亡與血管紋異常及可能存在的功能異常之間的相互關(guān)系還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，KitF856S小鼠模型耳聾的病理機(jī)制是血管紋的結(jié)構(gòu)異常、中間細(xì)胞及PVM的減少和外毛細(xì)胞的凋亡。該模型可以作為KIT基因突變致聾的病理機(jī)制和分子機(jī)制研究的可靠動(dòng)物模型。