高宇潔，詹發(fā)強(qiáng),，陳 澄，包慧芳，楊 蓉，王 寧，侯新強(qiáng)，侯 敏，史應(yīng)武，龍宣杞，

(1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊 830046；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所/新疆特殊環(huán)境微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】新疆葡萄種植面積一直居全國首位，2018年達(dá)到14.29×104hm2，占全國葡萄種植面積的19.7%[1]。葡萄果實(shí)含水量較高，在貯藏過程中容易受到微生物污染產(chǎn)生腐爛，霉菌侵染是引起生鮮葡萄采后霉變腐爛的主要原因[2]。我國每年因此而導(dǎo)致的葡萄等大宗果蔬損失占其總產(chǎn)量的30 %～40 %，尤其在常溫、亞常溫的運(yùn)輸和銷售過程中，擠壓及機(jī)械傷口極易引起黑曲霉(Aspergillusniger)大范圍感染，即黑粉病，多發(fā)生在葡萄果柄基部或果粒傷口處[3]，導(dǎo)致果蔬失去其食用價(jià)值和商品價(jià)值[4]。昆蟲病原線蟲共生菌不僅能產(chǎn)生對(duì)昆蟲有殺傷作用的毒素，還能產(chǎn)生其它代謝產(chǎn)物[5]，如胞外酶、胞內(nèi)晶體蛋白、色素、熒光素和抑菌物質(zhì)等?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，國內(nèi)外常用葡萄保鮮方式主要有物理保鮮、化學(xué)保鮮和生物保鮮3大類[6]。生物防治具有無毒、無害、殘留量低等優(yōu)點(diǎn)。研究表明，昆蟲病原線蟲共生菌對(duì)植物病原菌具有較好的抑菌效果[7、8、9、10]，主要集中在生物防治番茄灰霉病、大豆疫霉病，辣椒疫霉病、蘋果輪紋病[11]、蘋果腐爛病和蘋果灰霉病等?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】昆蟲病原線蟲共生細(xì)菌具有廣譜高效的抑菌作用，目前應(yīng)用于果蔬采后保鮮的生防菌有酵母菌[12]、芽孢桿菌[13]、熒光假單胞菌[14]、乳酸菌[15]等，利用昆蟲病原線蟲共生菌作為生防菌株的研究較少。需從現(xiàn)有共生細(xì)菌資源中篩選對(duì)黑曲霉具有高拮抗作用的菌株?！緮M解決的關(guān)鍵問題】利用昆蟲病原線蟲共生細(xì)菌廣譜高效的抑菌特性，以黑曲霉為靶標(biāo)菌，從現(xiàn)有昆蟲病原線蟲共生細(xì)菌資源中篩選對(duì)葡萄黑曲霉具有高拮抗作用的共生細(xì)菌，通過單因素篩選和響應(yīng)面分析法優(yōu)化菌株培養(yǎng)條件，防效試驗(yàn)驗(yàn)證拮抗細(xì)菌防治效果，為葡萄采后黑曲霉感染的生物防治提供新的生物材料和相關(guān)研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試病原菌：黑曲霉(Aspergillusniger)(GenBank ID：MT832028)由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工研究所提供。所用菌株均為實(shí)驗(yàn)室保存。表1

表 1 供試?yán)ハx病原線蟲共生菌Table 1 Test strains of Entomopathogenic nematode symbiotic bacteria

供試培養(yǎng)基：NBTA培養(yǎng)基(在NA培養(yǎng)基中加入0.04%三苯基四氮唑(w/v)和0.002 5%溴百里酚藍(lán)(w/v))；休和利夫森二氏培養(yǎng)基、明膠培養(yǎng)基(Nutrient Gelatin Medium)、尿素試驗(yàn)培養(yǎng)基(Urea Medium)[16]，用于生理生化特征測定試驗(yàn)。

供試?yán)ハx：大蠟螟老熟幼蟲Galleriamellonella，本實(shí)驗(yàn)室繁殖保存。

營養(yǎng)瓊脂(Nutrient Agar)培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯( Nutrient Broth)培養(yǎng)基、MRS 肉湯培養(yǎng)基、MRS 瓊脂培養(yǎng)基、瓊脂粉等購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；DP302-02(離心柱型)細(xì)菌基因組 DNA 提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 昆蟲病原線蟲共生菌的分離、純化及保藏

在直徑為9 cm的培養(yǎng)皿底部鋪一層滅菌濾紙，加入1 mL 1 000 IJs/mL的昆蟲病原線蟲液均勻滴于濾紙上，放入5頭新鮮健康的大蠟螟幼蟲，用不同品系昆蟲病原線蟲侵染。

將被線蟲致死的大蠟螟幼蟲在無菌條件下用75%(體積分?jǐn)?shù))乙醇表面消毒30 s，重復(fù) 2 次；用無菌剪刀剪去大蠟螟第 5 或第 6 對(duì)腹足，用接種針沾取血淋巴于NBTA平板培養(yǎng)基上劃線，28 ℃暗培養(yǎng) 2～3 d，可吸附色素并在其周圍形成透明圈的菌落即為目標(biāo)菌落。挑取藍(lán)色初生型單菌落于NBTA平板劃線純化并接于20 %甘油管-80 ℃保存，備用。

1.2.2 拮抗黑曲霉的昆蟲病原線蟲共生菌篩選

1.2.2.1 初 篩

采用平板對(duì)峙法，在NA培養(yǎng)基平板上同時(shí)接種黑曲霉和共生菌培養(yǎng) 3～5 d，每組處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，以只接病原菌作對(duì)照，觀察是否有拮抗效果，記錄病原菌生長半徑，計(jì)算抑菌率：

抑菌率(%)=(對(duì)照組病原菌菌落半徑-處理組菌落半徑)/對(duì)照組病原菌菌落半徑×100。

1.2.2.2 復(fù) 篩

根據(jù)初篩結(jié)果，挑取對(duì)黑曲霉具有顯著抑菌效果的單菌落接種至NB培養(yǎng)基中，180 r/min、28 ℃振蕩培養(yǎng)12 h，得種子液。將種子液按2 %接種量接于NB培養(yǎng)基中，180 r/min、28 ℃振蕩培養(yǎng)72 h，得發(fā)酵液，于4 ℃條件下，10 000 r/min離心10 min，所得上清經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌的發(fā)酵濾液，離心沉淀用 0.9 % NaCl 溶液清洗2次，將最終所得沉淀物用蒸餾水重懸制成菌懸液。

采用預(yù)加菌液傾注平板法結(jié)合打孔法，確認(rèn)拮抗菌的抑菌效果。

向已冷卻至50 ℃左右的平板培養(yǎng)基中注入1×106spores/mL的黑曲霉孢子懸液，混合均勻，傾注平板，水平靜置凝固后備用。用8 mm的無菌打孔器在試驗(yàn)平板上打孔，挑去培養(yǎng)基小塊以做成圓孔，向孔中注入200 μL發(fā)酵液，4 ℃預(yù)擴(kuò)散2 h，28 ℃培養(yǎng)48 h，觀察并測量抑菌圈大小，并計(jì)算抑菌效價(jià)。

抑菌效價(jià)(cm/mL)=(抑菌圈直徑-打孔器直徑)/ 發(fā)酵液體積×100。

1.2.3 拮抗黑曲霉的昆蟲病原線蟲共生菌鑒定1.2.3.1 生理生化特征測定

分離得到的供試菌株進(jìn)行生理生化檢測[14]，檢測內(nèi)容包括明膠液化、接觸酶、葡萄糖發(fā)酵和蔗糖利用等生理生化指標(biāo)。

1.2.3.2 分子生物學(xué)鑒定

根據(jù)天根生化科技(北京)有限公司的DP302-02(離心柱型)細(xì)菌基因組 DNA 提取試劑盒要求，提取菌體總DNA。

以提取的細(xì)菌基因組 DNA 為模板，使用細(xì)菌16S rRNA 通用引物27F(5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′)和1492R (5′-CAA ACT TGG TCA TTA GAG GA-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)體系：1× PCR預(yù)混液25 μL，上下游引物27F和1492R (10 μmol/L)各1 μL，ddH2O 23 μL。

PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94℃ 30 s，54℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0 %瓊脂糖電泳檢測后送至北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司測序。所得序列提交至GenBank并利用BLAST相似序列檢索比對(duì)，使用MEGA 7.0軟件進(jìn)行多序列同源性分析，并采用鄰接法(Neighbor-Joining Method)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4Xenorhabdusbovienii445生長量測定

取菌株種子液(OD600約為1)，按2 %接種量轉(zhuǎn)接至盛有100 mL NB培養(yǎng)基的250 mL三角瓶，平行三組，置于28 ℃，180 r/min的搖床搖瓶培養(yǎng)，每隔2 h取樣，測菌液的OD600，取平均值，直至取到72 h。以取樣時(shí)間為橫坐標(biāo)，光密度值OD600為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。

1.2.5Xenorhabdusbovienii445抑制黑曲霉發(fā)酵條件優(yōu)化1.2.5.1 不同單因素發(fā)酵條件篩選

選取不同種齡(6、8、10、12、14 h)、接種量(1%、2%、3%、4%、5%)、裝液量(50、80、100、120 mL/250 mL)、發(fā)酵時(shí)間(24、36、48、72、96 h)、pH(5、6、7、8、9)、溫度(26、28、30、32、35 ℃)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，各處理均在培養(yǎng)后，按照復(fù)篩方法檢測抑菌活性，以抑菌圈直徑作為指標(biāo)。

1.2.5.2 響應(yīng)面法發(fā)酵條件優(yōu)化設(shè)計(jì)

采用中心組合試驗(yàn)Box-Behnken 設(shè)計(jì)方案，對(duì)抑菌活性影響最顯著的3個(gè)因素接種量(%)、pH、裝液量(mL)，分別用A、B、C來表示，+1、0、-1 分別代表變量的水平，發(fā)酵液的抑菌圈直徑Y(jié)表示響應(yīng)值，每組試驗(yàn)重復(fù) 3 次。表2

表 2 Box-Behnken 設(shè)計(jì)因素水平編碼Table 2 Factors and levels of Box-Behnken design

1.2.6Xenorhabdusbovienii445對(duì)黑曲霉的防效測定

葡萄果實(shí)處理參考李麗梅等[2]方法。挑選大小、色澤及成熟度一致的果粒，將葡萄果粒從葉莖上剪下，防止葡萄果粒干枯，每個(gè)葡萄果粒上留有5 mm的果梗。將葡萄果粒浸入無菌的2 %次氯酸鈉溶液中表面消毒2 min，用無菌水沖洗以去除殘留的次氯酸鈉溶液，置于無菌操作臺(tái)中晾干。待葡萄果粒表面無水分殘留時(shí)，用無菌牙簽刺破果實(shí)赤道部位3 mm×3 mm×5 mm的傷口，處理組果實(shí)傷口處分別加入10 μL拮抗菌共生菌發(fā)酵液，2 h后加入10 μL病原菌孢子懸浮液(104spores/mL)，于室溫(25 ℃)下放置1 h，待果實(shí)風(fēng)干至傷口邊緣無流動(dòng)液體后置于無菌培養(yǎng)皿蓋中，用保鮮膜進(jìn)行密封，以 25 ℃/ 93 %濕度恒溫保濕培養(yǎng)，每天觀察并測量傷口處病斑大小和腐爛率，對(duì)照組加入無菌水和病原菌孢子懸浮液。

腐爛率(%)=(每個(gè)處理中果實(shí)腐爛的個(gè)數(shù))/(每個(gè)處理中果實(shí)總數(shù))×100；

防治效果(%)=(對(duì)照組病斑直徑-處理組病斑直徑)/(對(duì)照組病斑直徑-刺孔直徑)×100。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析，這用 LSD 法和Duncan’s 多重比較檢驗(yàn)法分析數(shù)據(jù)和差異顯著性檢驗(yàn)(P<0.05)，利用Microsoft Excel 2010軟件作圖，采用 Design-Expert (version 8.0.6)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同共生菌對(duì)黑曲霉的抑制效果

研究表明，初篩得到的20株共生細(xì)菌對(duì)黑曲霉抑制率均超過58%以上，其中抑菌率最大為65.00%(B5)，最小為58.49%(sf-ZMHYL)，其中抑菌率超過62% 6個(gè)菌株為B5、445、NLKSD 3-1、YC、ALL和sf-scp，抑制率分別為65.00%、64.92%、64.30%、63.58%、62.86%和62.25%，針對(duì)這6株菌進(jìn)行復(fù)篩。圖1，表3

圖 1 不同共生細(xì)菌菌株對(duì)黑曲霉Aspergillus niger的抑制效果Fig.1 Antagonistic effects of different symbiotic bacteria strains on Aspergillus niger

表 3 不同共生菌株對(duì)黑曲霉的抑制率Table 3 Inhibition rate of Aspergillus niger by different symbiotic strains

菌株445抑菌圈直徑最大為(23.72±0.61) mm，抑菌效價(jià)為7.61 cm/mL，并顯著高于其它4株共生菌(P<0.05)。圖2，表 4

注：

表4 不同共生菌株對(duì)黑曲霉的抑制效果Table 4 The inhibitory effect of different symbiotic strains on Aspergillus niger

2.2 Xenorhabdus bovienii 445的鑒定結(jié)果

2.2.1Xenorhabdusbovienii445菌落形態(tài)及生理生化特征

研究表明，菌株445可在濃度為2%的NaCl溶液中生存，可水解油脂、氧化葡萄糖酸鹽，可利用葡萄糖、乳糖進(jìn)行發(fā)酵。圖3，表5

圖 3 A:Xenorhabdus bovienii 445菌落形態(tài); B:Xenorhabdus bovienii 445革蘭氏染色Fig.3 A: Colonial morphology of Xenorhabdus bovienii 445; B: Gram staining of Xenorhabdus bovienii 445

表5 Xenorhabdus bovienii 445主要生理生化特征Table 5 Main physiological and biochemical test of Xenorhabdus bovienii 445

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

研究表明，菌株445的16S rRNA與Xenorhabdusbovieniistrain Xb139 (MG995576.1)聚于同一分支，相似性達(dá)99.79%，結(jié)合菌落形態(tài)及生理生化特征，445(GeneBank ID：OK560680)菌株為伯氏致病桿菌Xenorhabdusbovienii。圖4

注：分支處數(shù)值表示 Bootstrap 值；括號(hào)內(nèi)數(shù)字表示序列 GeneBank 登錄號(hào)；標(biāo)尺為進(jìn)化距離

2.3 Xenorhabdus bovienii 445在不同時(shí)間內(nèi)生長量變化

研究表明，Xenorhabdusbovienii 445的生長曲線，0～6 h 為延遲生長期，6～14 h 為對(duì)數(shù)生長期，14 h以后進(jìn)入穩(wěn)定生長期。圖5

圖 5 Xenorhabdus bovienii 445 的生長曲線Fig.5 The growth curve of Xenorhabdus bovienii 445

2.4 Xenorhabdus bovienii 445抑制黑曲霉發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果

2.4.1 單因素試驗(yàn)篩選結(jié)果

研究表明，在培養(yǎng)條件分別為種齡8 h，接種量3 %，pH 7.0，裝液量為100 mL/250 mL，溫度28℃，發(fā)酵時(shí)間36 h時(shí)Xenorhabdusbovienii445對(duì)黑曲霉的抑菌活性較高，其中，接種量、pH和裝液量對(duì)抑菌活性影響顯著高于其它單個(gè)因素(P<0.05)。圖6

圖 6 不同初始種齡(A)、接種量(B)、pH(C)、裝液量(D)、時(shí)間(E)和 溫度(F)對(duì)Xenorhabdus bovienii 445 抑菌活性的影響Fig.6 Effects of different initial seed ages (A),inoculum concentration (B), pH (C), liquid loading (D), time (E), and temperature (F) on the inhibitory activity of Xenorhabdus bovienii 445

2.4.2 響應(yīng)面法發(fā)酵條件優(yōu)化2.4.2.1 Box-behnken組合結(jié)果

研究表明，17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)中12個(gè)是析因點(diǎn)，5個(gè)是零點(diǎn)，析因點(diǎn)是自變量取值在 A、B、C所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)，零點(diǎn)表示區(qū)域的中心點(diǎn)，其中重復(fù)零點(diǎn)試驗(yàn) 5 次，用以估算試驗(yàn)誤差。表 6

表 6 不同試驗(yàn)編碼下菌株 445抑菌活性變化Table 6 Effect of different test sites on the antibacterial activity of strain 445

2.4.2.2 回歸模型的建立與方差

研究表明，Xenorhabdusbovienii445發(fā)酵液抑菌圈直徑(Y)對(duì)接種量(A)、pH(B)、裝液量(C)的多項(xiàng)回歸方程：

Y=27.65+0.37A+0.59B+0.061C+0.48AB-0.13AC+0.65BC-1.50A2-1.29B2-1.46C2

F值為10.03，相關(guān)系數(shù)R2= 0.9280，P< 0.01，達(dá)到顯著水平，失擬項(xiàng)的P= 0.0721 > 0.05不顯著，說明該模型擬合程度較好，試驗(yàn)誤差小，用此模型預(yù)測Xenorhabdusbovienii445發(fā)酵條件對(duì)抑菌活性的影響。B的一次項(xiàng)顯著(P< 0.05)，A、B、C二次項(xiàng)極顯著(P< 0.01)，其他項(xiàng)均不顯著。各因素對(duì)抑菌活性影響的主次順利為B > A > C，即pH >接種量>裝液量。圖2，表7

表 7 二次回歸模型的方差顯著性Table 7 Significance of the variance in the quadratic regression model

圖7 兩因素交互作用下抑菌圈直徑變化Fig.7 Influence of interaction of two factors on the diameter of bacteriostatic zone

2.4.2.3Xenorhabdusbovienii445發(fā)酵條件優(yōu)化后模型驗(yàn)證

研究表明，Xenorhabdusbovienii445抑菌活性的最優(yōu)培養(yǎng)條件為接種量3.06 %、pH 7.0、裝液量100.15 mL/250 mL，在此條件下抑菌圈直徑為(29.67±0.28) mm。在最適條件下經(jīng)過 3 組重復(fù)性試驗(yàn)，抑菌圈的平均直徑為 29.63 mm，僅比預(yù)測值小0.04 mm，無顯著性差異(P> 0.05)，擬合度良好，確定模型條件可以用于預(yù)測實(shí)際值，此方程有效可靠。在此條件下抑菌效價(jià)為10.59 cm/mL，比優(yōu)化前提高了39.16%。

2.5 Xenorhabdus bovienii 445對(duì)黑曲霉的防效測定

研究表明，室溫條件下(25±1℃)第3 d時(shí)，CK組開始發(fā)病，發(fā)病率為6 %，第4 d時(shí)，CK組發(fā)病率達(dá)到54 %，而Xenorhabdusbovienii445發(fā)酵液處理后發(fā)病率為32%。研究表明，室溫貯藏6 d之內(nèi)，處理組發(fā)病率顯著低于CK組(P< 0.05)，至第7 d時(shí)，對(duì)照和處理組葡萄果實(shí)全部發(fā)病。表8

注： A、B為優(yōu)化后的抑菌效果；C、D為優(yōu)化前的抑菌效果

表 8 3～7 d內(nèi)處理組與CK組的發(fā)病率Table 8 Incidence rate of treatment group and control group within 3-7 days

葡萄果實(shí)接種黑曲霉后，病斑直徑隨貯藏時(shí)間的推移逐漸增大。在整個(gè)常溫實(shí)驗(yàn)期間CK組病斑直徑逐漸增大，且始終大于發(fā)酵液處理組果實(shí)的病斑直徑。發(fā)酵液處理可顯著抑制果實(shí)病斑的擴(kuò)展(P< 0.05)，在25 ℃條件下貯藏至第4 d，Xenorhabdusbovienii445發(fā)酵液處理組葡萄果實(shí)病斑直徑為(6.01±0.40) mm，對(duì)于葡萄采后病原菌黑曲霉的防治效果達(dá)到61.30 %，Xenorhabdusbovienii445發(fā)酵液可有效控制黑曲霉對(duì)葡萄果實(shí)的侵染，能夠顯著延緩葡萄腐爛。圖9，表 9

表 9 3～7 d內(nèi)Xenorhabdus bovienii 445對(duì)黑曲霉的抑制效果Table 9 The inhibitory effect of Xenorhabdus bovienii 445 on Aspergillus niger within 3-7 days

圖 9 Xenorhabdus bovienii 445在葡萄果實(shí)上對(duì)黑曲霉的防治效果 Fig.9 Control effect of Xenorhabdus bovienii 445 on Aspergillus niger in grape fruit

3 討 論

目前國內(nèi)外在昆蟲病原線蟲共生菌資源收集、鑒定等方面做了大量研究工作，已發(fā)現(xiàn)一批具有應(yīng)用開發(fā)前景的優(yōu)良菌株，相關(guān)共生菌次級(jí)代謝物質(zhì)已被開發(fā)成為殺蟲劑[17]、殺菌劑[18]等，是微生物源農(nóng)藥的重要來源之一。

當(dāng)前，利用昆蟲病原線蟲共生菌防治葡萄采后黑曲霉病害國內(nèi)外鮮有報(bào)道，但是利用昆蟲病原線蟲共生菌防治其它植物病原菌已有部分報(bào)道。張園[9]等報(bào)道了線蟲致病桿菌HB310發(fā)酵上清液對(duì)蘋果灰霉病原菌菌絲抑制率為30.35%，且對(duì)蘋果輪紋菌和腐爛菌菌絲生長、孢子萌發(fā)具有良好的抑制效果。張潘杰[19]等研究發(fā)現(xiàn)伯氏致病桿菌NN6的10%發(fā)酵無菌濾液對(duì)禾谷鐮刀菌的菌絲抑制率為55.21%，孢子萌發(fā)抑制率為100%，具有極顯著的抑制活性。竇振國[20]等通過硫酸銨沉淀伯氏致病桿菌NN6的胞外蛋白，其具有良好的抑菌作用，對(duì)禾谷鐮刀菌菌絲生長和孢子萌發(fā)的IC50分別為517.37和47.86 μg/mL。Chacón Orozco Julie G.[21]等研究表明，Xenorhabdusszentirmaii的發(fā)酵濾液可以抑制大豆核盤菌Sclerotiniasclerotiorum菌絲生長且抑制率達(dá)98%以上，而細(xì)菌培養(yǎng)產(chǎn)生的揮發(fā)物可以完全抑制菌絲生長和菌核生成；將Xenorhabdusszentirmaii的發(fā)酵液稀釋至33%并涂在大豆種子上，與對(duì)照組相比，發(fā)酵液稀釋液可抑制核盤菌提高種子萌發(fā)率(78.3%)。Li Bo[22]等發(fā)現(xiàn)一株昆蟲病原線蟲共生細(xì)菌XenorhabdusbudapestensisC72對(duì)南方玉米葉枯病 (SCLB) 的菌絲生長和孢子萌發(fā)具有顯著的抑制作用，溫室和田間試驗(yàn)的相對(duì)防治效果分別達(dá)到59.15%和77.96%，與殺菌劑的效果相當(dāng)。研究以黑曲霉病菌為指示菌，利用實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的共生菌資源，進(jìn)行了拮抗菌株的篩選，篩選出1 株有顯著抑菌作用的Xenorhabdusbovienii445，其抑菌圈可達(dá)(23.72±0.61) mm，其抑菌效價(jià)為7.61 cm/mL。

實(shí)驗(yàn)室先前篩選得到的嗜線蟲致病桿菌ALL在葡萄灰霉病防治實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出良好的防治效果[23]，而在研究中，嗜線蟲致病桿菌ALL對(duì)于黑曲霉的抑制效果顯著低于伯氏致病桿菌445，可能是由于致病桿菌屬不同菌株所產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)種類和產(chǎn)量有所區(qū)別。通過適當(dāng)發(fā)酵方法，昆蟲病原線蟲共生菌能產(chǎn)生并積累較多活性物質(zhì)，并可相應(yīng)提高活性物質(zhì)的抑菌活性。優(yōu)化生防菌培養(yǎng)液組成成分和培養(yǎng)條件，可以促進(jìn)菌體的生長量增加，并提高抗菌活性物質(zhì)的產(chǎn)量及防效[24]。

響應(yīng)面分析法通過局部試驗(yàn)回歸擬合因素與結(jié)果間的全局函數(shù)關(guān)系，得到準(zhǔn)確有效的試驗(yàn)結(jié)論，能在整個(gè)考察區(qū)域上確定各個(gè)因素的最佳組合及最優(yōu)響應(yīng)值，可信度高[25]。Wang Yonghong[26]等采用響應(yīng)面法優(yōu)化了伯氏致病桿菌YL002產(chǎn)抗生素的培養(yǎng)基成分，獲得了較高的抗生素活性(337.5U/mL)，優(yōu)化后其抗生素活性總體提高了37.8%。研究采用單因素試驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面分析法，對(duì)Xenorhabdusbovienii445抑菌活性的培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，最佳條件為接種量3.06 %、pH 7.0、裝液量100.15 mL/250 mL，在此條件下抑菌圈直徑為(29.67±0.28) mm，抑菌效價(jià)為10.59 cm/mL，比優(yōu)化前提高了39.16%。王永娟[27]等針對(duì)嗜線蟲致病桿菌HB310菌株抑菌活性對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)的因素進(jìn)行了篩選優(yōu)化，得出的接種量、裝液量和培養(yǎng)基初始pH值的結(jié)論與本研究一致，致病桿菌屬共生菌抑菌物質(zhì)產(chǎn)生的最適條件具有一定的相似性。

張磊[28]等利用新疆無核白葡萄為試材，采用500 μL/L的H2S氣體對(duì)葡萄果實(shí)進(jìn)行間歇熏蒸，可有效控制常溫條件下葡萄采后黑曲霉的生長和病斑直徑的擴(kuò)展，貯藏至第2 d，葡萄果實(shí)開始腐爛，貯藏至第3 d，H2S處理組和對(duì)照組葡萄果實(shí)的病斑直徑分別為10.8 mm和14.3 mm，H2S處理組果實(shí)的病斑直徑比對(duì)照果實(shí)的病斑直徑小24.5 %。研究中，發(fā)酵液處理后在第四天開始腐爛，腐爛率為32 %，果實(shí)病斑直徑為(6.01±0.40) mm；CK此時(shí)的腐爛率為54 %，病斑直徑為(7.61±0.32) mm，處理組果實(shí)病斑直徑比對(duì)照組果實(shí)低了21.02 %。室溫條件下，研究利用昆蟲病原線蟲共生菌株Xenorhabdusbovienii445發(fā)酵液生物防治葡萄黑曲霉與使用H2S氣體熏蒸的物理方法達(dá)到了相似的防治效果。后續(xù)研究將進(jìn)一步聚焦抑菌活性物質(zhì)的分離純化、鑒定以及相關(guān)代謝產(chǎn)物的功能特性分析等。

4 結(jié) 論

初篩篩選出6株抑菌率超過62%的菌株，通過復(fù)篩篩選出1株有顯著抑菌作用的共生細(xì)菌，經(jīng)鑒定為伯氏致病桿菌Xenorhabdusbovienii(OK560680)。確定該菌株抑菌活性的最優(yōu)培養(yǎng)條件為：接種量3.06 %、pH 7.0、裝液量100.15 mL/250 mL，在此條件下抑菌圈直徑為(29.67±0.28) mm，抑菌效價(jià)為10.59 cm/mL，比優(yōu)化前提高了39.16 %。在常溫條件下對(duì)葡萄進(jìn)行損傷接種的防效試驗(yàn)中，Xenorhabdusbovienii445發(fā)酵液具有顯著的抑制黑曲霉、延緩葡萄腐爛的作用。應(yīng)用昆蟲病原線蟲共生細(xì)菌防治葡萄貯期黑曲霉侵染，具有較好的生防潛能。