秦新政，王玉苗，王志慧，謝成娟，王 博

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所/新疆特殊環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830091；2.新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830054)

0 引 言

【研究意義】秸稈是一種天然可再生資源[1]，富含氮、磷、鉀等營(yíng)養(yǎng)元素。隨著農(nóng)業(yè)的發(fā)展，農(nóng)作物秸稈數(shù)量增長(zhǎng)迅速[2-3]，秸稈若被遺棄和焚燒，會(huì)造成環(huán)境污染和資源浪費(fèi)[4-5]。秸稈還田可以避免資源浪費(fèi)和環(huán)境污染[6]，也可以增加土壤養(yǎng)分[7]、調(diào)整土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，能提高土壤質(zhì)量[8-9]，也是發(fā)展可持續(xù)農(nóng)業(yè)的有效途徑[10]。秸稈還田形式多樣，包括粉碎后直接翻壓還田、覆蓋還田、堆漚還田和腐熟劑處理還田等，其中，秸稈粉碎后直接翻壓還田是當(dāng)前秸稈肥料化利用的主要方式[11]。土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中極其重要和最為活躍的部分[12]，在土壤有機(jī)質(zhì)形成和轉(zhuǎn)化、土壤養(yǎng)分循環(huán)等方面發(fā)揮重要作用[13-14]。土壤微生物群落組成及活性變化是衡量土壤質(zhì)量和肥力的一個(gè)關(guān)鍵性指標(biāo)[15]。研究秸稈還田方式下土壤微生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)演替規(guī)律，為秸稈資源有效利用提供理論依據(jù)，對(duì)改善土壤生態(tài)功能具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】棉稈中木質(zhì)素含量較高，結(jié)構(gòu)致密，還田后不易腐爛分解為土壤養(yǎng)分[16-18]。目前秸稈還田對(duì)農(nóng)田土壤的影響已有很多研究結(jié)果，主要集中在秸稈還田對(duì)土壤的理化性質(zhì)、酶活性、微生物群落結(jié)構(gòu)變化以及農(nóng)作物產(chǎn)量影響上。棉稈還田能夠提高沿海鹽堿地土壤養(yǎng)分，增加了土壤全氮、硝態(tài)氮、速效鉀含量[19]。【本研究切入點(diǎn)】秸稈還田是減少棉花廢棄物對(duì)環(huán)境污染的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)措施。目前秸稈直接還田對(duì)棉田土壤養(yǎng)分的深入研究報(bào)道較少。通過對(duì)棉稈還田后的降解、還田前后的土壤理化性質(zhì)、可培養(yǎng)微生物數(shù)量和微生物多樣性。需要研究還田后棉花秸稈的降解及對(duì)土壤養(yǎng)分與微生物多樣性的影響?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以棉花秸稈粉碎還田后的土壤養(yǎng)分和土壤微生物為研究對(duì)象，分析棉花秸稈還田對(duì)棉田土壤養(yǎng)分和微生物多樣性的影響，為棉花秸稈還田在降低農(nóng)業(yè)環(huán)境污染和提升土壤肥力方面提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗(yàn)位于新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院綜合試驗(yàn)場(chǎng)(E：87.4643，N：43.9448)，研究區(qū)屬中溫帶大陸性干旱氣候，年平均降水量不足200 mm，年氣溫7.3℃，試驗(yàn)點(diǎn)前茬作物為棉花。

1.2 方 法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2020年開始試驗(yàn)采用秸稈還田方式，共設(shè)置2個(gè)處理：傳統(tǒng)耕作(秸稈不還田+常規(guī)種植作為對(duì)照CK)，秸稈粉碎還田(CS)；將同一處理20袋秸稈樣品(25×35) cm，孔徑1 mm，每袋秸稈重量30 g左右，分成5組，每組4袋用細(xì)繩拴在一起。將5組樣品按5點(diǎn)梅花形均勻埋置于小區(qū)(5 m×5 m)，深度5～15 cm，均勻散開袋中秸稈，還田實(shí)驗(yàn)期間未進(jìn)行施肥及其他田間管理。棉花種植品種為棉雙豐500 NH12026。

1.2.2 樣品采集

土壤樣品：于2020年11月初棉花收獲后，2021年4月底棉花播種前，在處理樣地內(nèi)隨機(jī)取樣。每個(gè)處理設(shè)5個(gè)土壤采樣點(diǎn)，去除土壤表層植株，采集0～20 cm土壤樣品，用無菌袋收集。將每個(gè)處理的樣品除去土壤中的根系、碎石及其他雜物，充分混勻后分成3份。土壤樣本采用干冰凍存，寄送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測(cè)序。用于土壤微生物量測(cè)定的樣品4℃保存，風(fēng)干樣品用于測(cè)定土壤理化性質(zhì)。

棉稈樣品：2020年11月初還田后采集對(duì)照棉稈樣品，并于120、160和180 d采集還田腐解后的棉稈樣品。

1.2.3 棉稈降解率

參照文獻(xiàn)[20]方法，將還田實(shí)驗(yàn)所用的尼龍袋中的秸稈取出，沖洗干凈，80℃烘干至恒重。秸稈失重率以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)，按式(1)計(jì)算每袋樣品的秸稈失重率：

Wx=(No-Nx)×100/No.

(1)

式中：

No：腐解前秸稈干重，g；

Nx：某腐解時(shí)間秸稈干重，g。

取5次測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值作為測(cè)定結(jié)果，結(jié)果保留到小數(shù)點(diǎn)后2位。

1.2.4 土壤理化性質(zhì)

參照文獻(xiàn)中的土壤檢測(cè)方法[21]測(cè)定土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、速效氮、速效鉀、速效磷、水溶性鹽總量、pH。

1.2.5 土壤微生物數(shù)量

對(duì)照土壤(CK)與還田處理土壤(CS)微生物菌落計(jì)數(shù)。稱取3 g土樣置于裝有30 mL無菌生理鹽水的三角瓶中，在搖床上以240 r/min，振蕩30 min后靜置3 min；將土樣混懸液用無菌生理鹽水逐級(jí)稀釋，將稀釋液分別涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板、馬丁培養(yǎng)基平板、高氏一號(hào)培養(yǎng)基平板；細(xì)菌培養(yǎng)條件為37℃，培養(yǎng)48 h；真菌培養(yǎng)條件為25℃，培養(yǎng)6 d；放線菌培養(yǎng)條件為28℃，培養(yǎng)5 d；記錄不同類型培養(yǎng)基中觀察到的細(xì)菌、真菌、放線菌的菌落數(shù)量。

1.2.6 高通量測(cè)序

取0.5 g土樣，采用SPINeasy DNA Kit for Soi，MP Biomedicais DNA提取試劑盒(12888)提取土壤DNA。將純化后的基因組DNA作為聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的模板。采用細(xì)菌V3-V4區(qū)擴(kuò)增引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′) /907R(5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′)，真菌ITS1區(qū)段擴(kuò)增引物ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)/ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。PCR采用25 μL反應(yīng)體系：含10倍PCR buffer 5 μL，dNTP 0.5 μL，正向、反向引物各0.5 μL，Taq酶0.25 μL (250 U)，DNA模板1 μL，ddH2O補(bǔ)齊至25 μL。PCR反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性3 min，98℃15 s，50℃30 s和72℃30s，分別進(jìn)行25個(gè)(細(xì)菌)和35個(gè)(真菌)循環(huán)，最后在72℃下延伸7 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，在Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)上進(jìn)行高通量測(cè)序分析。獲得原始序列后進(jìn)行質(zhì)量控制，之后在97%序列相似性水平上聚類成可操作的分類單元(Operational Taxonomic Units， OTUs)。對(duì)照RDP和UNITE數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分類注釋，獲取對(duì)應(yīng)的細(xì)菌和真菌分類學(xué)信息。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010和SPSS25.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析，方差分析采用最小顯著差異法(LSD)多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同還田時(shí)間下棉秸稈降解程度變化

研究表明，棉花秸稈的降解率隨著還田天數(shù)的增加而上升，處理180 d后，降解率最大可達(dá)5.01%。

秸稈還田后土壤速效氮、速效鉀含量顯著升高。秸稈還田前速效氮平均值為113.10 mg/kg，秸稈還田后速效氮平均值為121.48 mg/kg，提升了7.4%。秸稈還田前速效鉀的平均值為308.00 mg/kg，秸稈還田后速效鉀的平均值為408.93 mg/kg，提升了32.77%。表2

表1 不同還田時(shí)間下棉花秸稈降解程度變化Table 1 Change of degradation degree of cotton straw under different returning time

表2 不同秸稈還田下棉田土壤養(yǎng)分變化Table 2 Changes of soil nutrients in cotton field under different straw returning

2.2 秸稈還田對(duì)微生物數(shù)量的影響

研究表明，棉田土壤中可培養(yǎng)微生物總量提高9.8%，其中細(xì)菌數(shù)量提高64.6%，放線菌數(shù)量提高39.3%。表3

表3 不同秸稈還田下土壤主要微生物群落數(shù)量變化Table 3 Changes of soil microbial community quantity under different straw returning

2.3 秸稈還田對(duì)土壤微生物多樣性的影響

研究表明，秸稈還田后真菌的Chao1、Ace、Simpson指數(shù)降低，多樣性下降；而細(xì)菌的Chao1、Ace、Simpson指數(shù)升高，多樣性上升。表4，表5

表4 不同秸稈還田下土壤真菌多樣性變化Table 4 Diversity of soil fungi under different straw returning

表5 不同秸稈還田下土壤細(xì)菌群落多樣性變化Table 5 Changes of soil bacterial diversity under different straw returning

2.4 秸稈還田對(duì)土壤真菌群落組成的影響

2.4.1 土壤真菌TOP10 科群落結(jié)構(gòu)對(duì)比

研究表明，秸稈還田處理后真菌群落在科水平上菌種類型有顯著變化，麥角菌科(Clavicipitaceae)、毛殼菌科(Chaetomiaceae)、粉褶菌科(Entolomataceae)、葡萄穗霉科(Stachybotryaceae)代替格孢菌科(Pleosporaceae)、沙漠殼菌科(Eremomycetaceae)、糞殼菌科(Hypocreales)、盤菌科(Helotiales)成為秸稈還田后的土壤真菌優(yōu)勢(shì)菌群。其中秸稈還田后枝孢霉科(Cladosporiaceae)、赤殼科(Nectriaceae)、盤菌科(Helotiales)的相對(duì)豐度降低了48%、11%、10%；麥角菌科(Clavicipitaceae)、被孢霉科(Mortierellaceae)、毛殼菌科(Chaetomiaceae)的相對(duì)豐度提高了28%、25%、13%，其中被孢霉科中有些物種可能與植物形成共生關(guān)系，這對(duì)改善土壤的結(jié)構(gòu)性質(zhì)、促進(jìn)植物的生長(zhǎng)起一定的作用，毛殼菌科中的生防菌可能對(duì)植物病原菌具有抑制效果。圖1

注：CK為對(duì)照處理；CS為秸稈還田處理；下圖相同。橫坐標(biāo)/縱坐標(biāo)為樣本名，縱坐標(biāo)/橫坐標(biāo)為物種在該樣本中所占的比例，不同顏色的柱子代表不同的物種，柱子的長(zhǎng)短代表該物種所占比例的大小，下同

2.4.2 土壤真菌TOP10 屬群落結(jié)構(gòu)對(duì)比

研究表明，秸稈還田土樣與對(duì)照土樣在真菌屬群落構(gòu)成類型有顯著變化，優(yōu)勢(shì)菌屬差異較大，綠僵菌菌屬(Metarhizium)、毛殼菌屬(Chaetomium)、粉紅粘帚霉屬(Clonostachys)、金孢子菌屬(Chrysosporium)、刺盤孢屬(Chordomyces)代替鏈格孢屬(Alternaria)、假埃希氏菌屬(Pseudallescheria)、匍柄霉屬(Stemphylium)、異莖點(diǎn)霉屬(Paraphoma)、粉紅螺旋聚孢霉屬(Clonostachys)成為秸稈還田后的土壤真菌優(yōu)勢(shì)菌屬。其中被孢霉屬(Mortierella)、綠僵菌菌屬(Metarhizium)相對(duì)豐度提高了26%、29%，變化最為顯著，這與真菌科水平上的變化相對(duì)應(yīng)。圖2

圖2 秸稈還田土壤真菌屬水平群落組成Fig.2 Community composition of Genus level of fungi in straw returning soil

2.4.3 土壤真菌TOP10 種群落結(jié)構(gòu)對(duì)比

研究表明，對(duì)照土樣在種水平上最優(yōu)勢(shì)的10個(gè)種分別是皺枝孢(Cladosporiumdelicatulum)、枝孢菌(Cladosporiumlimoniforme)、高山被孢霉(Mortierellaalpina)、甜菜黃萎病病原菌(Gibellulopsisnigrescens)、枝細(xì)枝孢菌(Cladosporiumramotenellum)、拉長(zhǎng)被孢霉(Mortierellaelongata)、喜馬拉雅山維希尼克氏酵母(Vishniacozymaheimaeyensis)、緊密帚枝霉(Sarocladiumstrictum)、小囊菌(Microascusbrevicaulis)和Chordomycesantarcticus；

秸稈還田土樣在種水平上最優(yōu)勢(shì)的10個(gè)種分別是南極被孢霉(Mortierellaantarctica)、糞生毛殼菌(Chaetomiumtruncatulum)、裂葉金孢霉(Chrysosporiumlobatum)、小孢擬棘殼孢(Pyrenochaetopsisdecipiens)、Cadophoramalorum、高山被孢霉(Mortierellaalpina)、甜菜黃萎病病原菌(Gibellulopsisnigrescens)、拉長(zhǎng)被孢霉(Mortierellaelongata)、Chordomycesantarcticus。對(duì)照土樣與秸稈還田土樣在真菌種水平群落組成表現(xiàn)出極明顯差異。其中南極被孢霉(Mortierellaantarctica)、高山被孢霉(Mortierellaalpina)都屬于被枝孢霉屬，秸稈還田后相對(duì)豐度提高了17%、33%；皺枝孢菌(Cladosporiumdelicatulum)、枝孢菌(Cladosporiumlimoniforme)相對(duì)豐度分別降低了72%、13%，其它種類在還田前后變化差異不大。圖3

圖3 秸稈還田土壤真菌種水平群落組成Fig.3 Community composition of Species level of fungi in straw returning soil

2.5 秸稈還田對(duì)土壤細(xì)菌群落組成的影響

2.5.1 土壤細(xì)菌TOP10 科群落結(jié)構(gòu)對(duì)比

研究表明，秸稈還田前后土壤細(xì)菌科群落結(jié)構(gòu)中TOP10占總序列的百分比分別為20%、22.1%，并用相對(duì)含量作堆積圖。對(duì)照土樣與秸稈還田土樣在細(xì)菌科群落構(gòu)成上類型有一定變化，芽孢桿菌科(Bacillaceae)、芽單胞菌科(Gemmatimonadaceae)、除硫單胞菌科(Desulfuromonadaceae)仍是優(yōu)勢(shì)菌群，但芽孢桿菌科(Bacillaceae)與除硫單胞菌科(Desulfuromonadaceae)的相對(duì)豐度分別提高了6%、3%。秸稈還田后細(xì)菌科水平前10中新增加了鹽厭氧菌科(Halanaerobiaceae)、厭氧繩菌科(Anaerolineaceae)、硝化螺旋菌科(Nitrospiraceae)，相對(duì)豐度分別為14%、8%、4%。秸稈還田后的新增加的硝化螺旋菌科對(duì)于氮素循環(huán)起著重要作用。圖4

圖4 秸稈還田土壤細(xì)菌科群落組成Fig.4 Community composition of Family level of bacteria in straw returning soil

2.5.2 土壤細(xì)菌TOP10 屬群落結(jié)構(gòu)對(duì)比

研究表明，對(duì)照土樣與秸稈還田土樣在細(xì)菌屬群落構(gòu)成類型有所差異，鹽胞菌屬(Halocella)、鹽厭氧菌屬(Halanaerobium)、半角藻屬(Haliangium)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、梭狀桿菌屬(Clostridium)代替德沃斯氏菌屬(Devosia)、短波單胞菌屬(Brevundimonas)、嗜鹽囊菌屬(Haliangium)、馬賽菌屬(Massilia)、固氮弓菌屬(Azoarcus)成為秸稈還田后的土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌屬。秸稈還田后芽孢桿菌屬仍是優(yōu)勢(shì)菌屬，相對(duì)豐度增加了3%，鹽胞菌屬(Halocella)、鹽厭氧菌屬(Halanaerobium)、半角藻屬(Haliangium)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、梭狀桿菌屬(Clostridium)為新增加的前10菌屬，相對(duì)豐度分別為12%、10%、4%、4%、2%。圖5

圖5 秸稈還田土壤細(xì)菌屬群落組成Fig.5 Community composition of Genus level of bacteria in straw returning soil

2.5.3 土壤細(xì)菌TOP10 種群落結(jié)構(gòu)對(duì)比

研究表明，對(duì)照土樣與秸稈還田土樣在細(xì)菌種群落構(gòu)成上類型有所差異，農(nóng)研所芽孢桿菌(Bacillusniabensis)、堿性桿菌(Bacillusalkalitelluris)、硒砷芽孢桿菌(Bacillusselenatarsenatis)、痤瘡丙酸桿菌(Halocellacellulosilytica)、產(chǎn)蛋白酶中度嗜鹽菌(Thalassobacillusdevorans)代替黏著劍菌(ensiferadhaerens)、地中海短波單胞菌(Brevundimonasmediterranea)、埃氏慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumelkanii)、米蘇里游動(dòng)放線菌(Actinoplanesmissouriensis)、柯奈尼亞小單胞菌(Micromonosporachokoriensis)成為秸稈還田后的土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌屬。農(nóng)研所芽孢桿菌(Bacillusniabensis)、堿性芽孢桿菌(Bacillusalkalitelluris)、硒砷芽孢桿菌(Bacillusselenatarsenatis)為秸稈還田后新增加的前10優(yōu)勢(shì)菌種，相對(duì)豐度分別為16%、12%、11%。圖6

圖6 秸稈還田土壤細(xì)菌種水平群落組成Fig.6 Community composition of Species level of bacteria in straw returning soil

3 討 論

將秸稈直接粉碎回田仍是高效、直接且容易實(shí)現(xiàn)的方法[19]。研究測(cè)量了棉花秸稈在粉碎還田后的降解率，棉花秸稈的降解隨著還田天數(shù)的增加而上升，降解率最大可達(dá)5.01%。

在對(duì)鹽堿地進(jìn)行棉稈還田的研究表明，還田顯著增加了0～20 cm土層各時(shí)期的全氮含量，不同秸稈還田方式均能改善土壤理化性質(zhì)[21]。研究通過測(cè)定土壤理化性質(zhì)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，秸稈還田后土壤速效氮和速效鉀含量顯著增加，分別提高7.40%和32.77%。有研究發(fā)現(xiàn)，秸稈施加后會(huì)顯著增加水稻土壤速效鉀的含量[14]。

不同秸稈還田方式可增加農(nóng)田殘茬、枯落物及植物根系分泌物，導(dǎo)致土壤碳、氮增加，土壤微生物可利用碳源增加，增加土壤微生物活性[25]，增強(qiáng)土壤微生物對(duì)碳水化合物、氨基酸、胺類化合物等碳源的利用能力[26]。秸稈還田配施有機(jī)肥與微生物有機(jī)肥能顯著提高土壤微生物的數(shù)量與活性，微生物群落結(jié)構(gòu)也隨之發(fā)生變化，有利于土壤生態(tài)環(huán)境的改善，其中秸稈還田配施微生物有機(jī)肥效果最為顯著[15]。復(fù)合菌劑加上常規(guī)化肥處理能夠加速秸稈養(yǎng)分還田、改善土壤理化狀況，增強(qiáng)微生物活性[25]。土壤微生物在秸稈降解和營(yíng)養(yǎng)元素釋放過程中起著關(guān)鍵作用，同時(shí)秸稈還田方式、還田數(shù)量也會(huì)對(duì)土壤微生物產(chǎn)生較大的影響。通過微生物群落碳源利用的主成分分析表明，秸稈層能有效滯留氮素，減少土壤氮素淋失，增加土壤微生物群落功能多樣性[26]。

棉花秸桿還田使土壤中可培養(yǎng)微生物總量提高9.8%，細(xì)菌數(shù)量提高64.6%，放線菌數(shù)量提高39.3%；秸稈還田對(duì)土壤微生物多樣性有顯著影響，在科、屬、種層面的微生物菌群結(jié)構(gòu)都發(fā)生了變化。尤其是真菌的群落結(jié)構(gòu)變化顯著，麥角菌科(Clavicipitaceae)、被孢霉科(Mortierellaceae)、毛殼菌科(Chaetomiaceae)的相對(duì)豐度提高了28%、25%、13%，其中被孢霉科中有些物種可能與植物形成共生關(guān)系，對(duì)改善土壤的結(jié)構(gòu)性質(zhì)、促進(jìn)植物的生長(zhǎng)起一定的作用，毛殼菌科中的生防菌可能對(duì)植物病原菌具有抑制效果。其中被孢霉屬(Mortierella)、綠僵菌菌屬(Metarhizium)相對(duì)豐度提高了26%、29%，變化最為顯著，與真菌科水平上的變化相對(duì)應(yīng)。綠僵菌菌屬為麥角菌科，是一類重要的生防真菌，可寄生多種昆蟲，在生產(chǎn)中已得到廣泛的應(yīng)用。

4 結(jié) 論

秸稈還田能夠增加棉田土壤養(yǎng)分和可培養(yǎng)微生物的數(shù)量，秸稈還田后土壤速效氮和速效鉀含量顯著增加，分別提高7.40%和32.77%；土壤可培養(yǎng)微生物總量提高9.8%，其中細(xì)菌數(shù)量提高64.6%，放線菌數(shù)量提高39.3%；秸稈還田對(duì)土壤微生物多樣性有顯著影響。