劉云章，何佳遠，肖 蕓，陳麗珍，王建龍

（1. 中北大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，山西 太原 030051；2. 湖北東方化工有限公司，湖北 襄陽 441404）

1 引言

1，3?二氯?2，4，6?三硝基苯（DCTNB）是一種淺黃色片狀晶體，易溶于二氯甲烷等有機溶劑，但不溶于水［1］。由于硝基的影響，苯環(huán)上位于硝基鄰位或?qū)ξ坏柠u原子比較活潑，容易發(fā)生親核取代反應(yīng)，硝基越多，鹵原子就越活潑。因此它是一種重要的含能化合物中間體，能夠與鹵代芳香硝基化合物發(fā)生Ullmann反應(yīng)，生成具有較高熔點的多硝基聯(lián)苯類耐熱炸藥，如二 氨 基 六 硝 基 聯(lián) 苯（DIPAM）［2］、九 硝 基 三 聯(lián) 苯（NONA）［3］等，還可與含有氨基的化合物進行偶聯(lián)得到性能優(yōu)異的含能化合物。

純度是含能化合物中間體品質(zhì)評價的重要指標(biāo)之一，對后續(xù)合成各種含能化合物的品質(zhì)會產(chǎn)生重大的影響。純度的常用測試方法主要包括滴定法［4］、凝固點下降法［5］、差熱分析法（DSC）［6］、核磁共振氫譜法（1H NMR）［7］和高效液相色譜法（HPLC）［8］等。HPLC因其樣品用量少、靈敏度高、重現(xiàn)性好及自動化程度高等優(yōu)勢而廣泛應(yīng)用于含能化合物的純度分析［9-13］，是含能化合物定性定量分析的重要方法之一。

近年來，關(guān)于DCTNB 的研究工作主要集中在合成工藝優(yōu)化及晶體結(jié)構(gòu)鑒定［14-16］，缺乏相應(yīng)的純度分析方法研究，不利于其合成過程的純度檢測與質(zhì)量控制。 為此，本研究基于反相高效液相色譜法（RP?HPLC），對DCTNB 與其合成過程中產(chǎn)生的雜質(zhì)（1，5?二氯?2，4?二硝基苯（DCDNB）和2，3，4?三氯?1，5?二硝基苯（TCDNB））進行分離，探究最優(yōu)色譜條件，通過建立DCTNB 及其合成過程中雜質(zhì)的高效液相色譜分析方法，為DCTNB 的純度分析和質(zhì)量控制提供可靠的參考。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀（包括P1100 系列恒流泵A/B、GM1100 梯度混合器、D1100 紫外可見檢測器、O1100 色譜柱恒溫箱、Elitapex 色譜數(shù)據(jù)工作站），Agress1100 型，大連依利特分析儀器有限公司。色譜柱，Hypersil ODS2（250 mm×4.6 mm，5 μm），大連依利特分析儀器有限公司。電子天平，AL104 型，精確度0.0001 g，梅特勒—托利多集團。超聲清洗儀，KQ5200M 型，東莞市科橋有限公司。紫外分光光度計，UV?2802S 型，尤尼柯（上海）儀器有限公司。

DCDNB，DCTNB 及TCDNB，分別在無水乙醇中多次重結(jié)晶，純度均大于99.0%，實驗室自制。無水乙醇，分析純，純度大于99.5%，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。甲醇（MeOH），色譜純，純度大于99.9%，薩恩化學(xué)技術(shù)（上海）有限公司。乙腈（ACN），色譜純，純度大于99.9%，薩恩化學(xué)技術(shù)（上海）有限公司。

2.2 樣品的處理

準(zhǔn)確稱取20.00 mg 的DCTNB 粗品，置于100 mL的棕色容量瓶中，使用乙腈溶解樣品并定容至容量瓶刻度線處，然后使用超聲震蕩使其完全溶解，配置成200 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液。準(zhǔn)確稱取25.00 mg 的DCTNB 純 品，12.50 mg 的DCDNB 純 品 及12.50 mg的TCDNB 純品，分別加入到三個50 mL 的棕色容量瓶中，使用乙腈溶解樣品并定容至容量瓶刻度線處，然后使用超聲震蕩使其完全溶解，配置成標(biāo)準(zhǔn)儲備液；再分別對上述標(biāo)準(zhǔn)儲備液進行稀釋，配置成500，250，100，50，20，10，5 mg·L-1等不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用于標(biāo)準(zhǔn)工作曲線及檢測限等相關(guān)研究。所有樣品在進行HPLC 分析前，都經(jīng)過孔徑為0.45 μm 的尼龍66 過濾膜過濾，避光保存。

2.3 HPLC 方法的優(yōu)化

以乙腈為溶劑，配制濃度約為10 mg·L-1的DCD?NB，DCTNB 及TCDNB 乙腈溶液，采用紫外可見分光光度計進行掃描，掃描波長范圍設(shè)置為200～800 nm，得到三種化合物的最大紫外吸收波長，進而確定檢測波長。HPLC 分析方法的研究主要在大連依利特Agress1100 高效液相色譜儀上進行，使用標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液進行高效液相色譜分析，對流動相體系及比例、流速、柱溫及進樣量等影響色譜分析的因素進行選擇，確定最優(yōu)色譜條件。HPLC 分析、數(shù)據(jù)采集及定量分析均在Elitapex 色譜數(shù)據(jù)工作站上進行。

2.4 HPLC 方法的驗證

建立DCTNB 高效液相色譜分析方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過分析靈敏度、精密度、重復(fù)性及準(zhǔn)確度等參數(shù)，對建立的HPLC 分析方法進行驗證。

基于不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液來建立相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，以信噪比S/N=3 時的濃度為檢出限（LOD）來分析該方法的檢出限，以信噪比S/N=10 時的濃度為定量限（LOQ）來分析該方法的定量限，以此來評價該方法的靈敏度。

在最優(yōu)色譜條件下，對樣品溶液進行三次平行測定，間隔5 h 后對樣品溶液再次進行三次平行測定，分析DCDNB，DCTNB 及TCDNB 的保留時間和峰面積等相關(guān)參量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），評估該方法的精密度與重復(fù)性。

為驗證方法的準(zhǔn)確性，在未知濃度的樣品中添加不同濃度（25，50，100 mg·L-1）的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在最佳色譜條件下，每個添加平行進樣三次并計算加標(biāo)回收率，以評價該方法的準(zhǔn)確度。

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜條件的選擇與優(yōu)化

3.1.1 檢測波長

DCDNB，DCTNB 及TCDNB 在乙腈溶液的紫外光 譜 如 圖1 所 示。由 圖1 可 知，DCDNB，DCTNB 和TCDNB 的最大吸收波長均在240 nm 附近，即三種化合物在240 nm 波長處均有較強的紫外吸收響應(yīng)，基質(zhì)干擾較少，滿足殘留檢測的要求。因此，選用240 nm 為檢測波長。

圖1 DCDNB，DCTNB 及TCDNB 在乙腈溶液中的紫外吸收光譜圖Fig.1 UV absorption spectra of DCDNB，DCTNB and TCDNB in acetonitrile solution

3.1.2 流動相體系

由于DCDNB，DCTNB 及TCDNB 在甲醇和乙腈中均可溶解，因此選用純乙腈溶解樣品，分別選用甲醇/水，乙腈/水作為流動相進行檢測，結(jié)果如圖2 所示。由圖2 可知，在甲醇/水，乙腈/水這兩種流動相體系中，三種化合物紫外吸收峰的分離度均較大，分離效果良好，但在乙腈/水流動相體系中三種化合物的響應(yīng)值明顯較強，且TCDNB 在乙腈/水體系中的保留時間明顯小于在甲醇/水體系中的保留時間。因此在乙腈/水體系下能夠更快實現(xiàn)三種化合物的分離，提高分離效率，并且當(dāng)乙腈作為流動相的有機相時可以有效避免溶劑對分析造成的干擾［17］。因此，本實驗選用乙腈/水作為流動相體系。

圖2 DCDNB，DCTNB及TCDNB在不同流動相體系中的色譜圖Fig.2 Chromatograms of DCDNB，DCTNB and TCDNB in different mobile phase systems

3.1.3 流動相比例

由于DCTNB 及其合成過程中的雜質(zhì)均不溶于水，流動相中的水相的占比不宜過大。因此，選取VACN/VWater分別為40/60，50/50，60/40，70/30，80/20，90/10 等不同比例的乙腈/水為流動相研究樣品的液相色譜分離情況，結(jié)果如圖3 所示。由圖3 可知，隨著流動相中乙腈比例的增大，流動相的洗脫能力增強，三種化合物的保留時間也相應(yīng)的縮短。在VACN/VWater為40/60，50/50，60/40 時，DCDNB，DCTNB 和TCDNB依次出峰，實現(xiàn)了三種化合物的分離，但VACN/VWater為60/40 時，DCDNB 與DCTNB 兩 化 合 物 的 紫 外 吸 收 峰相連；而VACN/VWater為70/30，80/20，90/10 時，DCDNB與DCTNB 的紫外吸收峰重合，未能實現(xiàn)分離。隨后對VACN/VWater進行了微調(diào)，最終選用流動相VACN/VWater=55/45作為DCTNB高效液相色譜分析條件，在該條件下各組分均可實現(xiàn)基線分離，峰型對稱，分離效果良好。

圖3 DCDNB，DCTNB 和TCDNB 在不同比例乙腈/水體系中的色譜圖Fig.3 Chromatograms of DCDNB，DCTNB and TCDNB in acetonitrile/water system with different ratio

3.1.4 流動相流速

流動相流速對被分析物的保留時間有較大的影響，適宜的流速能有效的減少保留時間，提高分離效率。分別考察了流動相流速為0.6，0.8，1.0，1.2，1.5 mL·min-1對分離效果的影響，結(jié)果如圖4 所示。由圖4 可知，DCDNB，DCTNB 和TCDNB 依次出峰，隨著流速的增加，三種化合物的保留時間呈現(xiàn)縮短趨勢，由0.6 mL·min-1時的17.63～26.98 min縮短至1.5 mL·min-1時的7.48～11.57 min，同時分離度也逐漸減小。雖然選用的五種不同流速均能滿足液相色譜的分離要求，但流速越大，色譜柱的柱壓越高，儀器的穩(wěn)定性變差［18］，并且長時間的高柱壓工作會對色譜柱的使用壽命造成影響，而流速較低時，三種化合物紫外吸收峰的峰寬變大，保留時間較長，使得實驗分析的誤差較大且效率較低。綜合考慮柱壓與保留時間，最終選擇流動相流速為1.2 mL·min-1，在此流速下，三種化合物能夠?qū)崿F(xiàn)基線分離，分離效果良好，峰形對稱，柱壓適中，對儀器與色譜柱的影響較小，保留時間為9.20～14.17 min。

圖4 DCDNB，DCTNB 和TCDNB 在不同流速下的色譜圖Fig.4 Chromatograms of DCDNB，DCTNB and TCDNB at different flow rate

3.1.5 柱溫

為減少色譜柱的溫度對DCTNB 的色譜分析產(chǎn)生的影響，實驗分別考察了樣品在25，30，35，40，45 ℃等柱溫下的分離效果，結(jié)果如圖5 所示。結(jié)果表明，DCDNB，DCTNB 和TCDNB 依次出峰，隨著柱溫的升高，各組分的保留時間縮短，由25 ℃時的9.20～14.17 min 縮短至45 ℃時的8.44～13.37 min，但分離度下降，并且柱溫過高會降低色譜柱的使用壽命。因此，為保護色譜柱以及操作的便捷，并參考實驗室環(huán)境溫度，選擇室溫25 ℃作為DCTNB 色譜分析的柱溫。

圖5 DCDNB，DCTNB 和TCDNB 在不同柱溫下的液相色譜圖Fig.5 Chromatograms of DCDNB，DCTNB and TCDNB at different column temperature

3.1.6 進樣量

由于進樣量的大小會對色譜的峰高和峰面積產(chǎn)生影響，進而影響分離效果。實驗分別考察了樣品進樣量為5，10，15，20 μL 時的分離效果，結(jié)果如圖6 所示。結(jié)果表明，當(dāng)進樣量為10 μL 時，三種化合物的分離效果良好，峰形對稱，各吸收峰響應(yīng)值適中；當(dāng)進樣量減少為5 μL 時，雖然分離效果良好，但各峰的響應(yīng)值過低；而當(dāng)進樣量增加至15 或20 μL 時，峰形出現(xiàn)前延現(xiàn)象，分離效果明顯下降。因此，選擇體積10 μL 為DCTNB 色譜分析的進樣量。

圖6 DCDNB，DCTNB 和TCDNB 在不同進樣量下的液相色譜圖Fig.6 Chromatograms of DCDNB，DCTNB and TCDNB un?der different sample size

3.1.7 最優(yōu)色譜分析條件

綜上，本研究建立了DCTNB 純度的高效液相色譜分析方法，并獲得了最優(yōu)色譜分析條件，色譜柱為Hypersil ODS2 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），紫外檢測波長為240 nm，流動相為VACN/VWater=55∶45，流速為1.2 mL·min-1，柱溫為25 ℃，進樣量為10 μL。最優(yōu)色譜條件下DCTNB 樣品的高效液相色譜圖如圖7 所示，DCDNB，DCTNB 和TCDNB 依次出 峰，保留時間分別為9.20，10.50，14.17 min，各峰的分離度（R）均大于3.70，分離效果良好，最優(yōu)色譜條件下三種化合物的分離參數(shù)如表1 所示。

圖7 最優(yōu)HPLC 條件下DCDNB，DCTNB 和TCDNB 的高效液相色譜圖Fig.7 Chromatograms of DCDNB，DCTNB and TCDNB under optimum condition of HPLC

表1 最優(yōu)HPLC條件下DCDNB，DCTNB和TCDNB的分離參數(shù)Table 1 The separation parameters of DCDNB，DCTNB and TCDNB under optimum condition of HPLC

3.2 DCTNB 方法的驗證

3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與靈敏度

在最優(yōu)色譜條件下，對不同濃度范圍內(nèi)的DCDNB，DCTNB 和TCDNB 標(biāo)準(zhǔn)溶液進行高效液相色譜分析，從低濃度到高濃度依次進樣，每個濃度進樣三次，使用外標(biāo)法結(jié)合峰面積定量，獲得三種化合物的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線如圖8 所示。由圖8 可知，在5～250 mg·L-1的范圍內(nèi)，DCDNB 的濃度與色譜峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性方程為Y=27044.63X-43.70，R2=0.99942；在5～500 mg·L-1的范圍內(nèi)，DCTNB 的濃度與色譜峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性方程為Y=27863.51X-7.11，R2=0.99989；在5～250 mg·L-1的范圍內(nèi)，TCDNB的濃度與色譜峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性方程為Y=21548.70X-17.57，R2=0.99997。將5 mg·L-1的DCDNB，DCTNB 和TCDNB 標(biāo) 準(zhǔn) 溶 液 逐步稀釋，分別在最優(yōu)色譜條件下進行分析，測得檢出限分別為0.47，0.68，0.85 mg·L-1，定量限分別為1.58，2.28，2.82 mg·L-1，表明該方法具有良好的靈敏度。

圖8 DCDNB，DCTNB 和TCDNB 的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.8 Standard curves of DCDNB，DCTNB and TCDNB

3.2.2 精密度與重復(fù)性

將DCDNB，DCTNB 和TCDNB 按比例（1∶1∶1）配制成總濃度為100 mg·L-1的混合樣品溶液，在最佳色譜條件下，對樣品溶液進行3 次平行的色譜分析，間隔6 h 后對該樣品再次進行3 次平行的色譜分析，實驗測得數(shù)據(jù)及各組分保留時間與峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）計算結(jié)果見表2。由表2 可知，樣品中三種化合物的RSD 均小于1.27%，說明該方法的精密度與重復(fù)性較好，滿足高效液相色譜定性及定量分析的要求。

表2 DCDNB，DCTNB 和TCDNB 的保留時間及峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 2 The relative standard deviations of retention time and peak area of DCDNB，DCTNB and TCDNB

3.2.3 準(zhǔn)確度

采用加標(biāo)回收率實驗來定量分析方法的準(zhǔn)確度，回收率越接近100%，該方法的準(zhǔn)確度越高。向未知濃度的樣品溶液中分別加入濃度為25.00，50.00，100.00 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在最優(yōu)色譜條件下，未知濃度樣品和每個添加水平平行進樣3 次，求得平均回收率，結(jié)果見表3。由表3 可知，DCDNB，DCTNB 和TCDNB 的加標(biāo)回收率在98.82%～102.13%之間，說明該方法具有良好的準(zhǔn)確度。

表3 DCDNB，DCTNB 和TCDNB 的加標(biāo)回收率Table 3 The standard recovery rate of DCDNB，DCTNB and TCDNB

4 結(jié)論

對于DCTNB 的合成及應(yīng)用對于純度分析的需求，進行了基于高效液相色譜法的DCTNB 純度分析方法的建立與驗證。

（1）通過探索檢測波長，流動相體系及比例 流速、柱溫和進樣量等相關(guān)因素對DCDNB，DCTNB 和TCDNB 的分離效果的影響，建立了對于DCTNB 純度分析的反相高效液相色譜分析方法。優(yōu)化后的最優(yōu)色譜條件為：Hypersil ODS2 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），紫外檢測波長240 nm，流動相為VACN/VWater=55∶45，流速1.2 mL·min-1，柱溫25 ℃，進樣量10 μL。實驗結(jié)果表明，在最優(yōu)色譜條件下，DCDNB，DCTNB和TCDNB 的保留時間依次為9.20，10.50，14.17 min，且三種化合物紫外吸收峰的分離度可達3.70 以上，能夠?qū)CDNB，DCTNB 和TCDNB 達到良好的分離和分析。

（2）對所建立的分析方法進行了系統(tǒng)的驗證，采用外標(biāo)法對DCDNB，DCTNB 和TCDNB 進行了定量分析，在5～250 mg·L-1的范圍內(nèi)，DCDNB 的濃度與色譜峰面積均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系；在5～500 mg·L-1的范圍內(nèi)，DCTNB 的濃度與色譜峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系；在5～250 mg·L-1的范圍內(nèi)，TCDNB 的濃度與色譜峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。DCDNB，DCTNB和TCDNB 的檢出限分別為0.47，0.68，0.85 mg·L-1，定量限分別為1.58，2.28，2.82 mg·L-1，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于1.27%，加標(biāo)回收率98.82%～102.13%。

結(jié)果表明，本研究建立的DCTNB 色譜分析方法具有良好的靈敏度、精密度、重復(fù)性與準(zhǔn)確度，可用于DCTNB 的純度分析、含量檢測和質(zhì)量控制等研究。