余文權(quán)，李鑫磊，鐘秋生，林鄭和，單睿陽(yáng)，陳志輝，陳常頌

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所 福州 350012）

烏龍茶是我國(guó)獨(dú)有的一種茶類(lèi)，起源于福建，有閩北、閩南、廣東及臺(tái)灣四大產(chǎn)區(qū)。近年來(lái)烏龍茶產(chǎn)業(yè)得到迅猛地發(fā)展，深受?chē)?guó)內(nèi)外消費(fèi)者的喜愛(ài)。春閨【Camellia sinensis （L.） O.Kuntze】是從黃旦自然雜交后代中采用單株育種法育成的烏龍茶新品種（閩審茶2015001），屬灌木型，小葉類(lèi)，晚生種。春閨生長(zhǎng)勢(shì)較強(qiáng)，持嫩性較強(qiáng)，產(chǎn)量較高，抗性強(qiáng)。制烏龍茶，有特殊香氣且濃郁持久，味醇、湯中有香[1]，區(qū)試點(diǎn)連續(xù)3年品質(zhì)高于對(duì)照黃旦[2]。代謝組學(xué)技術(shù)是一種高效多靶點(diǎn)地研究小分子物質(zhì)及其動(dòng)態(tài)變化的技術(shù)[3]。代謝組學(xué)技術(shù)可分為靶向技術(shù)與非靶向技術(shù)。近年來(lái)，靶向與非靶向代謝組學(xué)技術(shù)聯(lián)合廣泛應(yīng)用于茶葉代謝物發(fā)現(xiàn)和動(dòng)態(tài)變化研究[4-5]。目前，尚未有針對(duì)春閨品種制得的烏龍茶品質(zhì)特點(diǎn)的代謝組學(xué)研究。鐵觀(guān)音是閩南烏龍茶的最重要品種，成茶具有香高、持久等特點(diǎn)。本文采用春閨與鐵觀(guān)音鮮葉為原料，按照閩南烏龍茶工藝分別制成春閨與鐵觀(guān)音烏龍茶成茶。采用頂空固相微萃取結(jié)合全二維氣相飛行時(shí)間質(zhì)譜（HS-SPME/GC×GC-TOF-MS） 和超高效液相串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF-MS）技術(shù)分析春閨烏龍茶與鐵觀(guān)音烏龍茶之間揮發(fā)性與非揮發(fā)性代謝物差異，探明春閨品種制作烏龍茶的成茶特征及其形成機(jī)理，為進(jìn)一步指導(dǎo)烏龍茶生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

春閨品種鮮葉 （CGX） 和鐵觀(guān)音品種鮮葉（TGYX）均于2017年5月采自福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所福安市社口鎮(zhèn)茶園。液氮取樣，凍干，待測(cè)。按照閩南烏龍茶工藝將上述茶樹(shù)品種鮮葉分別制成春閨毛茶（CGM）和鐵觀(guān)音毛茶（TGYM），凍干、待測(cè)[6]，每個(gè)處理均取3 份作為技術(shù)重復(fù)。

色譜級(jí)乙腈、甲醇和甲酸，德國(guó)Merck 公司；無(wú)水乙醚，上海阿拉丁公司；表兒茶素沒(méi)食子酸酯（ECG）、表兒茶素（EC）、沒(méi)食子兒茶素（GC）、色氨酸、谷氨酸、異亮氨酸、伽馬氨基丁酸（γ-Aminobutyric acid，GABA）、亮氨酸、天門(mén)冬氨酸、苯丙氨酸、腺苷、山柰酚-3-O-半乳糖苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷和牡荊素，美國(guó)Sigma 公司；去離子水，美國(guó)Millipore 公司。

1.2 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

Pegasus 4D 全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜（GC×GC），美國(guó)LECO 公司；Agilent 7890A-5975C 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 （GC-MS）、Infinity 1290 超高效液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（UHPLC-Q-TOF-MS）、C18 色譜柱 【Zorbax Eclipse Plus（150 mm×3.0 mm，1.8 μm）】，美國(guó)Agilent 公司；A11 多功能高速粉碎機(jī)，德國(guó)IKA 公司。

1.3 樣品前處理

1.3.1 揮發(fā)性組分 2018年3～5月，在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所進(jìn)行樣品前處理。采用頂空固相微萃取法（HS-SPME）提取烏龍茶樣品的香氣成分。具體操作步驟：精確稱(chēng)取10 g 茶粉，加入15 μL 2 mg/mL 癸酸乙酯和100 mL 沸蒸餾水于450 r/min 條件下攪拌，放入烘箱中5 min，接著吸附40 min 后進(jìn)行GC×GC-TOF-MS 及GC-MS 檢測(cè)。每個(gè)樣品做3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.3.2 非揮發(fā)性組分 采用多功能高速粉碎機(jī)對(duì)上述茶樣進(jìn)行粉碎。稱(chēng)取每個(gè)茶葉樣品0.3 g 于50 mL 離心管中，以45 mL 100 ℃蒸餾水浸提5 min，每隔1 min 對(duì)離心管上、下?lián)u晃，然后用高速離心機(jī)（轉(zhuǎn)速8 000 r/min）離心10 min，，取2 mL上清液，過(guò)0.22 μm 濾膜，基于UHPLC-Q-TOFMS 進(jìn)行代謝組學(xué)分析。

1.4 分析條件

1.4.1 GC×GC-TOF-MS GC×GC 條件見(jiàn)表1。質(zhì)譜：EI；電離能量：-70 eV；質(zhì)量掃描范圍：33～600 m/z；離子源溫度：220 ℃。

表1 全二維色譜條件Table 1 Experiment conditions of GC×GC

1.4.2 UHPLC-Q-TOF-MS 流動(dòng)相A 為0.1%甲酸-水，B 為甲醇；進(jìn)樣量2 μL。流速0.4 mL/min。柱溫40 ℃。采用梯度洗脫方式：0～3.5 min，使用10%流動(dòng)相B；3.5～5.5 min，使用15%流動(dòng)相B；5.5～7 min，使用32%流動(dòng)相B；7～12 min，使用55%流動(dòng)相B；12～15.5 min，使用75%流動(dòng)相B；15.5～18 min，使用95%流動(dòng)相B；18～18.1 min，使用10%流動(dòng)相B；18.1～23 min，使用10%流動(dòng)相B。質(zhì)譜：電噴霧離子化（ESI），掃描方式為正離子模式，毛細(xì)管電壓3 500 V，干燥氣溫度300 ℃，流速8 L/min，霧化氣壓強(qiáng)241 kPa，鞘氣溫度300℃，流速11 L/min，質(zhì)譜掃描范圍100～1 000 m/z。

2 結(jié)果與分析

2.1 春閨和鐵觀(guān)音鮮葉及制成的閩南烏龍茶毛茶揮發(fā)性組分特征

茶葉中揮發(fā)性組分含量雖低，但對(duì)茶葉品質(zhì)影響大，特別是烏龍茶。采用HS-SPME-GC×GCTOFMS 技術(shù)分析春閨和鐵觀(guān)音鮮葉以及制成的閩南烏龍茶毛茶的香氣組分，結(jié)合質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)匹配、化合物保留時(shí)間、結(jié)構(gòu)譜圖及峰面積等方法共鑒定出572 種揮發(fā)性代謝產(chǎn)物。對(duì)這些產(chǎn)物進(jìn)行主成分分析，如圖1所示：第1 主成分為53.9%，第2 主成分為18.5%，共計(jì)72.4%，包含樣本的大部分揮發(fā)物信息。春閨和鐵觀(guān)音鮮葉及相應(yīng)毛茶在揮發(fā)性組分方面表現(xiàn)出良好的分離度，鮮葉樣本均位于第1 主成分負(fù)軸，毛茶樣本均位于第1主成分正軸。

圖1 春閨與鐵觀(guān)音揮發(fā)性組分主成分分析Fig.1 Principle component analysis plots of Chungui and Tieguanyin volatiles

從主成分分析載荷圖（圖2）可以看出，根據(jù)坐標(biāo)位置推測(cè)春閨鮮葉中代表性組分為香葉醇、芳樟醇、苯乙醇、α-蒎烯等，鐵觀(guān)音鮮葉中的代表性組分為乙酸葉醇酯、水楊酸甲酯、反式芳樟醇氧化物等。春閨和鐵觀(guān)音毛茶中的揮發(fā)性組分整體較接近，代表性物質(zhì)為十一烷、十烷、吲哚、β-羅勒烯、苯乙醛、6-甲基-5-庚烯-2-酮、橙花叔醇、茉莉內(nèi)酯、脫氫芳樟醇、1-辛烯-3-醇、α-法尼烯等。

圖2 春閨與鐵觀(guān)音揮發(fā)性組分載荷圖Fig.2 Loading plots of Chungui and Tieguanyin volatiles

2.2 春閨和鐵觀(guān)音鮮葉及其毛茶主要揮發(fā)性組分相對(duì)含量的差異

橙花叔醇、吲哚、法尼烯、β-羅勒烯、茉莉內(nèi)酯、脫氫芳樟醇等為烏龍茶重要揮發(fā)性代謝產(chǎn)物，呈現(xiàn)特征花果香氣[7-11]。圖3顯示春閨和鐵觀(guān)音鮮葉及其毛茶之間主要揮發(fā)性組分相對(duì)含量的差異。春閨鮮葉中相對(duì)含量最高的揮發(fā)物為香葉醇（9.28%），香葉醇和α-蒎烯含量顯著高于鐵觀(guān)音鮮葉。鐵觀(guān)音鮮葉中相對(duì)含量最高的揮發(fā)物為乙酸葉醇酯（10.47%），鐵觀(guān)音鮮葉反式芳樟醇氧化物、脫氫芳樟醇和乙酸葉醇酯顯著高于春閨鮮葉。

圖3 春閨和鐵觀(guān)音烏龍茶中主要揮發(fā)性組分差異Fig.3 Differences of important volatile components in CG and TGY oolong tea

春閨毛茶中相對(duì)含量最高的化合物為吲哚（11.13%），吲哚在一定濃度條件下表現(xiàn)為茉莉花香，吲哚、茉莉內(nèi)酯、1-辛烯-3-醇、α-法尼烯、β-羅勒烯、己酸葉醇酯等顯著高于鐵觀(guān)音毛茶。鐵觀(guān)音毛茶中相對(duì)含量最高的化合物為吲哚（3.89%）和脫氫芳樟醇（3.84%），僅脫氫芳樟醇相對(duì)含量顯著高于春閨毛茶。春閨毛茶和鐵觀(guān)音毛茶中6-甲基-5-庚烯-2-酮、橙花叔醇和苯甲醛含量無(wú)顯著差異。

2.3 春閨和鐵觀(guān)音鮮葉及制成的閩南烏龍茶毛茶非揮發(fā)性組分特征

采用UHPLC-QTOF-MS 技術(shù)測(cè)定春閨和鐵觀(guān)音鮮葉及制成的閩南烏龍茶毛茶非揮發(fā)性代謝組分，共獲得2 897 個(gè)化合物信號(hào)，對(duì)上述組分進(jìn)行主成分分析。如圖4所示，第1 主成分為25.9%，第2 主成分為23.1%，共計(jì)49%，包含樣本一半左右的信息。樣品間表現(xiàn)出良好的分離度，從第1 主成分看，春閨鮮葉與毛茶均位于第1 主成分正軸，鐵觀(guān)音鮮葉與毛茶均位于第1 主成分負(fù)軸，說(shuō)明第1 主成分體現(xiàn)不同品種間的差異物質(zhì)；從第2主成分看，春閨與鐵觀(guān)音鮮葉位于第2 主成分正軸，春閨與鐵觀(guān)音毛茶位于第2 主成分負(fù)軸，說(shuō)明第2 主成分體現(xiàn)加工前、后的差異物質(zhì)。對(duì)上述非揮發(fā)性代謝組分離子進(jìn)行差異化合物篩選 【P<0.05、變量投影重要性 （VIP）>1、倍數(shù)變化（Fold Change）>1.5】和鑒定，共鑒定出33 種差異代謝產(chǎn)物，見(jiàn)表2。兒茶素與兒茶素二聚體8 種，黃酮醇或黃酮糖苷7 種，游離氨基酸組分12 種，酚酸2種，香氣糖苷前體1 種，其它3 種。

圖4 春閨與鐵觀(guān)音非揮發(fā)性組分主成分分析Fig.4 Principle component analysis plots of Chungui and Tieguanyin non-volatiles

表2 春閨烏龍茶與鐵觀(guān)音烏龍茶非揮發(fā)性差異代謝物Table 2 Differential non-volatile metabolites identified in CG oolong tea and TGY oolong tea

從圖5主成分分析載荷圖可看出，第1 主成分上，正軸分布全部黃酮醇或黃酮糖苷類(lèi)組分、纈氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸、4-O-p-香豆酰奎寧酸和芳樟醇櫻草糖苷等為春閨品種代表性組分；負(fù)軸分布全部?jī)翰杷嘏c兒茶素二聚體、γ-氨基丁酸、谷氨酸、茶氨酸、茶氨酸葡萄糖苷、3-O-p-香豆?？鼘幩帷⒙辄S素、茶沒(méi)食子素和茶堿等，為鐵觀(guān)音品種代表性組分。

圖5 春閨與鐵觀(guān)音烏龍茶非揮發(fā)性組分載荷圖Fig.5 Loading plots of non-volatiles components of Chungui and Tieguanyin oolong tea

2.4 春閨和鐵觀(guān)音鮮葉及其毛茶主要非揮發(fā)性組分相對(duì)含量差異分析

兒茶素是茶葉中最主要的次級(jí)代謝產(chǎn)物，占茶樹(shù)鮮葉干重的12%～24%[12]。表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）、ECG、表沒(méi)食子兒茶素（EGC）和EC 為茶葉中主要的兒茶素組分。圖6顯示，差異兒茶素組分為C、EC、ECG、EGC、GC 和EGCG，二聚兒茶素組分為原矢車(chē)菊素B1 和原矢車(chē)菊素B3。由于春閨品種鮮葉的EC、ECG 和原矢車(chē)菊素B1 相對(duì)含量均顯著低于鐵觀(guān)音鮮葉，因此其毛茶兒茶素組分均明顯低于鐵觀(guān)音品種。

黃酮或黃酮醇糖苷類(lèi)物質(zhì)與兒茶素組分含有相同的前體，包括槲皮素、山柰酚、楊梅素及其相應(yīng)糖苷。黃酮或黃酮醇糖苷類(lèi)物質(zhì)占茶樹(shù)鮮葉的總酚類(lèi)物質(zhì)最高達(dá)13%左右[14]。圖6顯示，差異黃酮或黃酮醇糖苷組分為山柰酚-3-O-葡萄糖苷、山柰酚-3-O-半乳糖苷、山柰酚-3-O-葡萄糖基蕓香糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖基蕓香糖苷、芹菜素-6-阿拉伯糖-8-葡萄糖苷和芹菜素-6-葡萄糖-8-阿拉伯糖苷。黃酮或黃酮醇糖苷類(lèi)物質(zhì)無(wú)論在鮮葉還是毛茶中，春閨品種均明顯高于鐵觀(guān)音品種。

茶葉中富含多種氨基酸，目前，從茶葉中共鑒定出的氨基酸類(lèi)型有26 種，其中20 種為蛋白質(zhì)氨基酸，6 種為非蛋白質(zhì)氨基酸[13]。氨基酸組分是茶湯鮮甜滋味的來(lái)源和部分香氣前體，圖6顯示，差異氨基酸組分為γ-氨基丁酸、谷氨酸、茶氨酸、茶氨酸葡萄糖苷、纈氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、天冬氨酸和蘇氨酸。春閨品種鮮葉中γ-氨基丁酸、谷氨酸和茶氨酸葡萄糖苷顯著高于鐵觀(guān)音品種，僅色氨酸顯著低于鐵觀(guān)音鮮葉。

酚酸是一類(lèi)含有酚環(huán)的有機(jī)酸。圖6顯示，差異酚酸組分為3-O-p-香豆酰奎寧酸和4-O-p-香豆?？鼘幩帷４洪|烏龍茶酚酸組分相對(duì)含量均顯著低于鐵觀(guān)音烏龍茶。春閨品種鮮葉和毛茶中3-O-p-香豆酰奎寧酸顯著低于鐵觀(guān)音品種，4-O-p-香豆?？鼘幩犸@著高于鐵觀(guān)音品種。

圖6顯示，麻黃素和芳樟醇櫻草糖苷在春閨與鐵觀(guān)音品種之間無(wú)顯著差異，春閨品種鮮葉和毛茶的茶沒(méi)食子素顯著低于鐵觀(guān)音品種，茶堿在鐵觀(guān)音鮮葉中明顯富集。

圖6 從春閨與鐵觀(guān)音烏龍茶中鑒定出的物質(zhì)豐度熱圖Fig.6 Heat map of components abundance identified from Chungui and Tieguanyin oolong tea

3 討論

前人感官審評(píng)表明，用春閨品種制成的烏龍茶具有花香濃郁、持久的特點(diǎn)[1，6]。本研究發(fā)現(xiàn)，春閨烏龍茶揮發(fā)性香氣組分整體與鐵觀(guān)音烏龍茶相近，且吲哚、橙花叔醇和茉莉內(nèi)酯等烏龍茶特征性組分顯著高于鐵觀(guān)音烏龍茶。吲哚是春閨烏龍茶相對(duì)含量最高的組分，由吲哚-3-磷酸甘油在色氨酸合成酶催化下形成，烏龍茶搖青工序引起色氨酸合成酶2 的β 亞基顯著表達(dá)，吲哚積累，吲哚會(huì)進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為色氨酸與氧化吲哚[16]。本研究顯示，吲哚的次級(jí)代謝物色氨酸含量顯著低于鐵觀(guān)音品種，可能與春閨品種中控制吲哚轉(zhuǎn)化為色氨酸相應(yīng)酶類(lèi)基因表達(dá)不高，引起吲哚大量積累有關(guān)，結(jié)果還需進(jìn)一步驗(yàn)證。另外，橙花叔醇和茉莉內(nèi)酯在機(jī)械力、低溫等多種脅迫條件下高表達(dá)，由法呢基焦磷酸形成橙花叔醇[17]，茉莉內(nèi)酯由α-亞麻酸與亞油酸在茶樹(shù)脂氧合酶1 作用下轉(zhuǎn)化而來(lái)[18]，因在春閨品種中，上述揮發(fā)性組分前體或相應(yīng)基因的高表達(dá)而積累，其機(jī)理有待探究。

春閨品種制成的烏龍茶具有滋味醇爽的特點(diǎn)[1]。本研究表明，與鐵觀(guān)音品種制成的烏龍茶相比，春閨品種鮮葉和毛茶中大部分兒茶素單體和二聚體低于鐵觀(guān)音品種，而黃酮醇或黃酮糖苷類(lèi)物質(zhì)明顯富集，兒茶素組分與黃酮醇或黃酮糖苷類(lèi)物質(zhì)具有共同前體，因此，春閨品種中，前體可能更多地轉(zhuǎn)化為黃酮醇或黃酮糖苷類(lèi)物質(zhì)，使兒茶素組分含量降低。兒茶素組分在茶湯中表現(xiàn)為苦味，黃酮醇或黃酮糖苷的澀味閾值較低[19]，表現(xiàn)為澀味，構(gòu)成春閨品種的醇爽滋味。