張翠翠， 李永川， 孫文萍

(青海紅十字醫(yī)院產科，青海 西寧 810000)

近年來，空氣污染導致的胚胎發(fā)育異常已經成為國內外研究的熱點。苯并芘(BaP)廣泛存在于空氣和水中，屬于多環(huán)芳烴類化合物，BaP是一種常見的空氣污染物，能夠引發(fā)早產、胎兒生長受限等不良妊娠[1-2]。絨毛滋養(yǎng)層細胞是胎盤功能發(fā)揮和胚胎成功著床的主要因素，而其過度凋亡和侵襲受阻是不良妊娠發(fā)生的關鍵[3]。枸杞多糖是枸杞的有效成分，是由酸性雜多糖、多肽、蛋白質組成的復合多糖，具有抗氧化、抗衰老、增強免疫力等功效[4]。研究表明，枸杞多糖能夠保護生殖系統(tǒng)，可減輕氧化損傷并促進絨毛滋養(yǎng)層細胞生長和分泌人絨毛膜促性腺激素[5]。目前，枸杞多糖對BaP誘導人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞凋亡和侵襲的影響尚不明確。本實驗以人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞為體外研究對象，通過流式細胞術、Transwell小室探討枸杞多糖對BaP誘導人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞凋亡和侵襲能力的影響，以期為枸杞多糖在不良妊娠中的作用提供參考。

1 材料

1.1 細胞 人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞購自上海弘順生物科技有限公司。

1.2 試劑與藥物 Bcl-2相關X蛋白(Bax)抗體購自深圳市豪地華拓生物科技有限公司；B細胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)抗體購自武漢艾美捷科技有限公司；膜聯(lián)蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)細胞凋亡檢測試劑盒購自上海雅吉生物科技有限公司；苯并芘(BaP)購自無錫美贊化學品有限公司；基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)抗體、p65抗體購自武漢友聯(lián)特生物技術有限公司；p65激活劑佛波酯(PMA)購自美國Sigma公司。枸杞多糖(純度90%)購自北京索萊寶科技有限公司。

2 方法

2.1 細胞分組與處理 人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640細胞培養(yǎng)液中，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2。人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞分為對照組、模型組及枸杞多糖低、中、高劑量組，對照組細胞不做處理；模型組細胞用含20 μmol/L BaP的細胞培養(yǎng)液進行培養(yǎng)；枸杞多糖低、中、高劑量組細胞分別用含20 μmol/L BaP和80、160、240 μg/mL枸杞多糖的細胞培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。

2.2 流式細胞術測定細胞凋亡 培養(yǎng)24 h后，收集各組細胞，用PBS溶液將各組細胞密度調整為1×106/mL，吸取1 mL細胞懸浮液，1 000×g離心10 min，棄上清，在細胞中添加500 μL Binding buffer溶液，充分混合，添加PI、Annexin V-FITC染色液各5 μL，避光孵育20 min，用流式細胞儀檢測凋亡。

2.3 Transwell小室檢測細胞侵襲能力 首先將8 μm Transwell小室放入24孔板中，每孔中添加300 μL不含血清的細胞培養(yǎng)液，室溫孵育30 min，棄培養(yǎng)液，用不含血清的細胞培養(yǎng)液調整細胞密度為1×105/mL，在Transwell小室的下室中加入500 μL含10%胎牛血清的細胞培養(yǎng)液，然后在上室中加入200 μL細胞懸液，培養(yǎng)24 h后，用4%多聚甲醛固定，結晶紫染色20 min，PBS洗滌小室3次，顯微鏡下觀察細胞穿膜數目即為細胞侵襲數目，隨機選擇5個視野，取平均值。

2.4 Western blot檢測MMP-9、Bax、Bcl-2、p65蛋白表達

培養(yǎng)24 h后，收集各組細胞，加入細胞裂解液，轉移到1.5 mL EP管中，置于冰上超聲粉碎，4 ℃裂解30 min，15 000×g離心10 min，吸取上清，即為細胞總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。配制5%上層濃縮膠和10%下層分離膠，每孔蛋白上樣量為30 μg，100 V恒壓電泳，90 V轉膜90 min。將PVDF膜取出并放在5%牛血清白蛋白中，常溫孵育1 h，再依次放在一抗、二抗溶液中結合反應，ECL顯色，使用Image J軟件分析條帶灰度值，并計算目的蛋白相對表達。

2.5 p65激活劑對枸杞多糖干預BaP誘導人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞的作用 細胞分為為枸杞多糖中劑量組(20 μmol/L BaP+160 μg/mL枸杞多糖)和枸杞多糖中劑量+PMA組(20 μmol/L BaP+160 μg/mL枸杞多糖+2 ng/mL p65激活劑PMA)，加藥培養(yǎng)24 h后收集細胞，流式細胞術檢測細胞凋亡，Transwell小室檢測細胞侵襲，Western blot檢測MMP-9、Bax、Bcl-2、p65蛋白表達。

3 結果

3.1 枸杞多糖對BaP誘導人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞凋亡的影響 與對照組比較，模型組細胞凋亡率升高(P<0.05)；與模型組比較，枸杞多糖各劑量組細胞凋亡率降低(P<0.05)，并呈劑量依賴性，結果見圖1、表1。由此可知，枸杞多糖抑制BaP誘導人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞凋亡。

圖1 各組細胞凋亡

表1 枸杞多糖對細胞凋亡的影響

3.2 枸杞多糖對BaP誘導人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞侵襲的影響 與對照組比較，模型組細胞侵襲數減少(P<0.05)；與模型組比較，枸杞多糖各劑量組細胞侵襲數增加(P<0.05)，并呈劑量依賴性，結果見表2。由此可知，枸杞多糖促進BaP誘導人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞侵襲。

表2 枸杞多糖對細胞侵襲的影響

3.3 枸杞多糖對BaP誘導人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞MMP-9、Bax、Bcl-2蛋白表達的影響 與對照組比較，模型組細胞MMP-9、Bcl-2蛋白表達降低(P<0.05)，Bax蛋白表達升高(P<0.05)；與模型組比較，枸杞多糖各劑量組細胞MMP-9、Bcl-2蛋白表達升高(P<0.05)，Bax蛋白表達降低(P<0.05)，并呈劑量依賴性，見圖2、表3。

圖2 各組細胞MMP-9、Bax、Bcl-2蛋白表達

表3 枸杞多糖對細胞MMP-9、Bax、Bcl-2蛋白表達的影響

3.4 枸杞多糖對BaP誘導人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞p65蛋白表達的影響 與對照組比較，模型組細胞p65蛋白表達升高(P<0.05)；與模型組比較，枸杞多糖各劑量組細胞p65蛋白表達降低(P<0.05)，并呈劑量依賴性，見圖3、表4。

圖3 各組細胞p65蛋白表達

表4 枸杞多糖對細胞p65蛋白表達的影響

3.5 PMA逆轉枸杞多糖對BaP誘導人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞p65蛋白表達的影響 各劑量枸杞多糖對人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞均有作用，選擇中劑量初步探討其作用機制。與枸杞多糖中劑量組比較，枸杞多糖中劑量+PMA組細胞p65蛋白表達升高(P<0.05)，結果見圖4、表5。由此可知，PMA逆轉枸杞多糖對人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞p65蛋白表達影響。

圖4 PMA對細胞p65蛋白表達的影響

表5 PMA逆轉枸杞多糖對細胞p65蛋白表達的影響

3.6 PMA逆轉枸杞多糖對BaP誘導人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞凋亡率、侵襲數以及MMP-9、Bax、Bcl-2蛋白表達的影響 與枸杞多糖中劑量組比較，枸杞多糖中劑量+PMA組細胞凋亡率、細胞侵襲數及細胞中Bax、MMP-9蛋白表達均降低(P<0.05)，Bax蛋白表達升高(P<0.05)，見圖5、表6。

圖5 各組細胞凋亡(A)和MMP-9、Bcl-2、Bax蛋白表達(B)

表6 PMA對細胞凋亡率、侵襲數及MMP-9、Bax、Bcl-2蛋白表達的影響

4 討論

環(huán)境污染是影響人類生殖系統(tǒng)正常功能的重要原因，其可誘發(fā)子宮內膜異位癥、月經紊亂、多囊卵巢綜合征等疾病[6]。絨毛滋養(yǎng)層細胞成功侵入子宮內膜是成功妊娠的基礎[7]。BaP是一個典型的多環(huán)芳烴類化合物，可誘導DNA損傷、畸形和突變[8]。BaP處理可以誘導人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞過度凋亡和侵襲能力下降，所以常作為體外研究絨毛滋養(yǎng)層細胞損傷的誘導因子[9]。Bax和Bcl-2均屬于Bcl-2蛋白家族成員，分別在細胞凋亡過程中發(fā)揮促進和抑制作用[10]。MMP-9是細胞侵襲促進因子，其水平的高低與細胞侵襲能力正相關[11]。本實驗結果表明，BaP處理后的人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞凋亡率升高，細胞侵襲能力下降，細胞中Bax蛋白表達升高，Bcl-2、MMP-9蛋白表達下降，說明BaP抑制人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞侵襲并誘導細胞凋亡，提示成功構建了人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞體外損傷模型。

枸杞是我國傳統(tǒng)中藥，具有明目、補肝腎等功效。枸杞多糖是枸杞的關鍵活性成分，具有抗腫瘤、抗氧化、調節(jié)免疫力、降血脂、抗輻射等作用[12-14]。研究顯示，枸杞多糖具有保護生殖系統(tǒng)的作用，可以降低生殖系統(tǒng)損傷，枸杞多糖灌胃后，實驗性高血壓妊娠小鼠胎盤明顯改善[15-17]。本實驗發(fā)現(xiàn)，枸杞多糖能夠降低BaP處理后的人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞凋亡，促進人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞侵襲，降低細胞中促凋亡蛋白Bax的表達，增加細胞中抗凋亡蛋白Bcl-2和促細胞轉移蛋白MMP-9的表達，提示枸杞多糖可以抑制BaP誘導人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞凋亡并促進細胞侵襲。

p65是NF-κB信號激活的必需調控因子，其表達升高標志著NF-κB信號激活水平升高[18-21]。研究顯示，NF-κB參與人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞損傷，在細胞損傷發(fā)生時過度激活，而下調其激活水平可以促進人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞侵襲并降低細胞凋亡發(fā)生[22]。本實驗表明，枸杞多糖可以降低BaP處理后的人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞中p65蛋白表達，而p65激活劑可以逆轉枸杞多糖對人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞凋亡和侵襲的作用。

綜上所述，枸杞多糖可能通過降低BaP誘導人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞凋亡、促進細胞侵襲而發(fā)揮保護作用，其機制可能與p65有關。目前對于枸杞多糖調控p65下游機制和體內作用還不清楚，仍需進一步探討。