張翠翠, 李永川, 孫文萍
(青海紅十字醫(yī)院產科,青海 西寧 810000)
近年來,空氣污染導致的胚胎發(fā)育異常已經成為國內外研究的熱點。苯并芘(BaP)廣泛存在于空氣和水中,屬于多環(huán)芳烴類化合物,BaP是一種常見的空氣污染物,能夠引發(fā)早產、胎兒生長受限等不良妊娠[1-2]。絨毛滋養(yǎng)層細胞是胎盤功能發(fā)揮和胚胎成功著床的主要因素,而其過度凋亡和侵襲受阻是不良妊娠發(fā)生的關鍵[3]。枸杞多糖是枸杞的有效成分,是由酸性雜多糖、多肽、蛋白質組成的復合多糖,具有抗氧化、抗衰老、增強免疫力等功效[4]。研究表明,枸杞多糖能夠保護生殖系統(tǒng),可減輕氧化損傷并促進絨毛滋養(yǎng)層細胞生長和分泌人絨毛膜促性腺激素[5]。目前,枸杞多糖對BaP誘導人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞凋亡和侵襲的影響尚不明確。本實驗以人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞為體外研究對象,通過流式細胞術、Transwell小室探討枸杞多糖對BaP誘導人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞凋亡和侵襲能力的影響,以期為枸杞多糖在不良妊娠中的作用提供參考。
1.1 細胞 人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞購自上海弘順生物科技有限公司。
1.2 試劑與藥物 Bcl-2相關X蛋白(Bax)抗體購自深圳市豪地華拓生物科技有限公司;B細胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)抗體購自武漢艾美捷科技有限公司;膜聯(lián)蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)細胞凋亡檢測試劑盒購自上海雅吉生物科技有限公司;苯并芘(BaP)購自無錫美贊化學品有限公司;基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)抗體、p65抗體購自武漢友聯(lián)特生物技術有限公司;p65激活劑佛波酯(PMA)購自美國Sigma公司。枸杞多糖(純度90%)購自北京索萊寶科技有限公司。
2.1 細胞分組與處理 人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640細胞培養(yǎng)液中,培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2。人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞分為對照組、模型組及枸杞多糖低、中、高劑量組,對照組細胞不做處理;模型組細胞用含20 μmol/L BaP的細胞培養(yǎng)液進行培養(yǎng);枸杞多糖低、中、高劑量組細胞分別用含20 μmol/L BaP和80、160、240 μg/mL枸杞多糖的細胞培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。
2.2 流式細胞術測定細胞凋亡 培養(yǎng)24 h后,收集各組細胞,用PBS溶液將各組細胞密度調整為1×106/mL,吸取1 mL細胞懸浮液,1 000×g離心10 min,棄上清,在細胞中添加500 μL Binding buffer溶液,充分混合,添加PI、Annexin V-FITC染色液各5 μL,避光孵育20 min,用流式細胞儀檢測凋亡。
2.3 Transwell小室檢測細胞侵襲能力 首先將8 μm Transwell小室放入24孔板中,每孔中添加300 μL不含血清的細胞培養(yǎng)液,室溫孵育30 min,棄培養(yǎng)液,用不含血清的細胞培養(yǎng)液調整細胞密度為1×105/mL,在Transwell小室的下室中加入500 μL含10%胎牛血清的細胞培養(yǎng)液,然后在上室中加入200 μL細胞懸液,培養(yǎng)24 h后,用4%多聚甲醛固定,結晶紫染色20 min,PBS洗滌小室3次,顯微鏡下觀察細胞穿膜數目即為細胞侵襲數目,隨機選擇5個視野,取平均值。
2.4 Western blot檢測MMP-9、Bax、Bcl-2、p65蛋白表達
培養(yǎng)24 h后,收集各組細胞,加入細胞裂解液,轉移到1.5 mL EP管中,置于冰上超聲粉碎,4 ℃裂解30 min,15 000×g離心10 min,吸取上清,即為細胞總蛋白,BCA法檢測蛋白濃度。配制5%上層濃縮膠和10%下層分離膠,每孔蛋白上樣量為30 μg,100 V恒壓電泳,90 V轉膜90 min。將PVDF膜取出并放在5%牛血清白蛋白中,常溫孵育1 h,再依次放在一抗、二抗溶液中結合反應,ECL顯色,使用Image J軟件分析條帶灰度值,并計算目的蛋白相對表達。
2.5 p65激活劑對枸杞多糖干預BaP誘導人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞的作用 細胞分為為枸杞多糖中劑量組(20 μmol/L BaP+160 μg/mL枸杞多糖)和枸杞多糖中劑量+PMA組(20 μmol/L BaP+160 μg/mL枸杞多糖+2 ng/mL p65激活劑PMA),加藥培養(yǎng)24 h后收集細胞,流式細胞術檢測細胞凋亡,Transwell小室檢測細胞侵襲,Western blot檢測MMP-9、Bax、Bcl-2、p65蛋白表達。
3.1 枸杞多糖對BaP誘導人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞凋亡的影響 與對照組比較,模型組細胞凋亡率升高(P<0.05);與模型組比較,枸杞多糖各劑量組細胞凋亡率降低(P<0.05),并呈劑量依賴性,結果見圖1、表1。由此可知,枸杞多糖抑制BaP誘導人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞凋亡。
圖1 各組細胞凋亡
表1 枸杞多糖對細胞凋亡的影響
3.2 枸杞多糖對BaP誘導人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞侵襲的影響 與對照組比較,模型組細胞侵襲數減少(P<0.05);與模型組比較,枸杞多糖各劑量組細胞侵襲數增加(P<0.05),并呈劑量依賴性,結果見表2。由此可知,枸杞多糖促進BaP誘導人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞侵襲。
表2 枸杞多糖對細胞侵襲的影響
3.3 枸杞多糖對BaP誘導人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞MMP-9、Bax、Bcl-2蛋白表達的影響 與對照組比較,模型組細胞MMP-9、Bcl-2蛋白表達降低(P<0.05),Bax蛋白表達升高(P<0.05);與模型組比較,枸杞多糖各劑量組細胞MMP-9、Bcl-2蛋白表達升高(P<0.05),Bax蛋白表達降低(P<0.05),并呈劑量依賴性,見圖2、表3。
圖2 各組細胞MMP-9、Bax、Bcl-2蛋白表達
表3 枸杞多糖對細胞MMP-9、Bax、Bcl-2蛋白表達的影響
3.4 枸杞多糖對BaP誘導人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞p65蛋白表達的影響 與對照組比較,模型組細胞p65蛋白表達升高(P<0.05);與模型組比較,枸杞多糖各劑量組細胞p65蛋白表達降低(P<0.05),并呈劑量依賴性,見圖3、表4。
圖3 各組細胞p65蛋白表達
表4 枸杞多糖對細胞p65蛋白表達的影響
3.5 PMA逆轉枸杞多糖對BaP誘導人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞p65蛋白表達的影響 各劑量枸杞多糖對人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞均有作用,選擇中劑量初步探討其作用機制。與枸杞多糖中劑量組比較,枸杞多糖中劑量+PMA組細胞p65蛋白表達升高(P<0.05),結果見圖4、表5。由此可知,PMA逆轉枸杞多糖對人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞p65蛋白表達影響。
圖4 PMA對細胞p65蛋白表達的影響
表5 PMA逆轉枸杞多糖對細胞p65蛋白表達的影響
3.6 PMA逆轉枸杞多糖對BaP誘導人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞凋亡率、侵襲數以及MMP-9、Bax、Bcl-2蛋白表達的影響 與枸杞多糖中劑量組比較,枸杞多糖中劑量+PMA組細胞凋亡率、細胞侵襲數及細胞中Bax、MMP-9蛋白表達均降低(P<0.05),Bax蛋白表達升高(P<0.05),見圖5、表6。
圖5 各組細胞凋亡(A)和MMP-9、Bcl-2、Bax蛋白表達(B)
表6 PMA對細胞凋亡率、侵襲數及MMP-9、Bax、Bcl-2蛋白表達的影響
環(huán)境污染是影響人類生殖系統(tǒng)正常功能的重要原因,其可誘發(fā)子宮內膜異位癥、月經紊亂、多囊卵巢綜合征等疾病[6]。絨毛滋養(yǎng)層細胞成功侵入子宮內膜是成功妊娠的基礎[7]。BaP是一個典型的多環(huán)芳烴類化合物,可誘導DNA損傷、畸形和突變[8]。BaP處理可以誘導人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞過度凋亡和侵襲能力下降,所以常作為體外研究絨毛滋養(yǎng)層細胞損傷的誘導因子[9]。Bax和Bcl-2均屬于Bcl-2蛋白家族成員,分別在細胞凋亡過程中發(fā)揮促進和抑制作用[10]。MMP-9是細胞侵襲促進因子,其水平的高低與細胞侵襲能力正相關[11]。本實驗結果表明,BaP處理后的人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞凋亡率升高,細胞侵襲能力下降,細胞中Bax蛋白表達升高,Bcl-2、MMP-9蛋白表達下降,說明BaP抑制人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞侵襲并誘導細胞凋亡,提示成功構建了人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞體外損傷模型。
枸杞是我國傳統(tǒng)中藥,具有明目、補肝腎等功效。枸杞多糖是枸杞的關鍵活性成分,具有抗腫瘤、抗氧化、調節(jié)免疫力、降血脂、抗輻射等作用[12-14]。研究顯示,枸杞多糖具有保護生殖系統(tǒng)的作用,可以降低生殖系統(tǒng)損傷,枸杞多糖灌胃后,實驗性高血壓妊娠小鼠胎盤明顯改善[15-17]。本實驗發(fā)現(xiàn),枸杞多糖能夠降低BaP處理后的人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞凋亡,促進人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞侵襲,降低細胞中促凋亡蛋白Bax的表達,增加細胞中抗凋亡蛋白Bcl-2和促細胞轉移蛋白MMP-9的表達,提示枸杞多糖可以抑制BaP誘導人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞凋亡并促進細胞侵襲。
p65是NF-κB信號激活的必需調控因子,其表達升高標志著NF-κB信號激活水平升高[18-21]。研究顯示,NF-κB參與人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞損傷,在細胞損傷發(fā)生時過度激活,而下調其激活水平可以促進人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞侵襲并降低細胞凋亡發(fā)生[22]。本實驗表明,枸杞多糖可以降低BaP處理后的人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞中p65蛋白表達,而p65激活劑可以逆轉枸杞多糖對人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞凋亡和侵襲的作用。
綜上所述,枸杞多糖可能通過降低BaP誘導人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞凋亡、促進細胞侵襲而發(fā)揮保護作用,其機制可能與p65有關。目前對于枸杞多糖調控p65下游機制和體內作用還不清楚,仍需進一步探討。