袁向科， 江 瑞

(1.河南省中醫(yī)院周?chē)芸?，河?鄭州 450002；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院老年病科，河南 鄭州 450003)

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是心腦血管疾病的共同病理基礎(chǔ)，可由高血壓、高血糖、高血脂等多種因素引發(fā)，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康[1-2]。氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)是早期動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展的重要因素，其誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮損傷能促進(jìn)泡沫細(xì)胞的形成，釋放大量炎性反應(yīng)因子，進(jìn)而加重該病病程[3]。因此，減少ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮損傷是預(yù)防和治療動(dòng)脈粥樣硬化的有效途徑。

目前，黃酮類(lèi)化合物因其抗炎、抗氧化等功能[4-5]在防治動(dòng)脈粥樣硬化方面受到廣泛的關(guān)注[6-7]。葛根素6″-O-木糖苷是葛根中的主要異黃酮[8]，具有顯著的抗腫瘤[9-10]、抗骨質(zhì)疏松[11]活性，但該成分對(duì)血管內(nèi)皮損傷的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究采用ox-LDL誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)損傷，探討葛根素6″-O-木糖苷對(duì)HUVECs活性、凋亡、炎性損傷及NF-κB信號(hào)通路的影響。

1 材料

HUVECs購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；ox-LDL、維生素E購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。葛根素6″-O-木糖苷(純度大于98%)購(gòu)自上海同田生物科技有限公司。MTT試劑盒、IL-1β、TNF-α ELISA試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物有限公司；caspase-3活性檢測(cè)試劑盒、RIPA細(xì)胞裂解液、PMSF、BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；cleaved caspase-3、ICAM1、VCAM1、p-p65、p-IκB-α、GAPDH等一抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司和武漢博士德生物工程有限公司；二抗購(gòu)自北京中衫金橋生物有限公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及給藥 將HUVECs置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%時(shí)，用0.25%胰酶進(jìn)行消化傳代培養(yǎng)。將HUVECs隨機(jī)分為6組，分別為對(duì)照組，正常培養(yǎng)48 h；ox-LDL組，正常培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，100 μg/mL ox-LDL處理24 h；葛根素6″-O-木糖苷10、20、40 μmol/L組，10、20、40 μmol/L葛根素6″-O-木糖苷處理24 h后，100 μg/mL ox-LDL處理24 h；維生素E組，200 μg/L維生素E處理24 h后，100 μg/mL ox-LDL處理24 h。

2.2 MTT檢測(cè)細(xì)胞活性 將細(xì)胞接種到96孔板上，按“2.1”項(xiàng)下方法處理，每孔加入10 μL MTT(0.5 mg/mL)，在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育4 h，棄去培養(yǎng)基，每孔加入150 μL二甲基亞砜溶液，振蕩15 min, 在490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)光密度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞活性。

2.3 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞caspase-3活性 將細(xì)胞接種到6孔板上，按“2.1”項(xiàng)下方法處理，胰酶消化貼壁細(xì)胞，4 ℃離心5 min收集細(xì)胞，按caspase-3活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，在405 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)OD值，計(jì)算caspase-3相對(duì)活性。

2.4 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液IL-1β、TNF-α水平 按“2.1”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞，離心收集細(xì)胞上清液，按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)IL-1β、TNF-α水平。

2.5 Western blot 檢測(cè)細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá) 將細(xì)胞接種到24孔板上，按“2.1”項(xiàng)下方法處理，每孔加入RIPA裂解液與PMSF的混合液(100∶1)裂解細(xì)胞15 min，離心收集上清，即為總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量，取適量樣本進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，采用半干轉(zhuǎn)方法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗，在4 ℃下過(guò)夜孵育，再加入二抗，室溫孵育1 h，采用紅外激光成像系統(tǒng)掃描。以GAPDH為內(nèi)參，分析蛋白相對(duì)表達(dá)。

3 結(jié)果

3.1 葛根素6″-O-木糖苷對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞活性的影響 如圖1A所示，0、10、20、30、40 μmol/L葛根素6″-O-木糖苷處理HUVECs后，細(xì)胞活性無(wú)明顯變化(P>0.05)，表明該成分無(wú)細(xì)胞毒性。如圖1B所示，與對(duì)照組比較，ox-LDL可導(dǎo)致HUVECs的細(xì)胞活性下降(P<0.05)；與ox-LDL組比較，葛根素6″-O-木糖苷呈劑量依賴(lài)性地抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞活性下降(P<0.05)。

3.2 葛根素6″-O-木糖苷對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞caspase-3表達(dá)的影響 如圖2A所示，與對(duì)照組比較，ox-LDL組細(xì)胞caspase-3活性升高(P<0.05)；與ox-LDL組比較，葛根素6″-O-木糖苷組呈劑量依賴(lài)性地抑制ox-LDL誘導(dǎo)的caspase-3活性升高(P<0.05)。如圖2B所示，與對(duì)照組比較，ox-LDL組細(xì)胞cleaved caspase-3蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與ox-LDL組比較，葛根素6″-O-木糖苷呈劑量依賴(lài)性地抑制ox-LDL誘導(dǎo)的cleaved caspase-3表達(dá)升高(P<0.05)。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與ox-LDL組比較，#P<0.05。圖2 各組HUVECs細(xì)胞caspase-3表達(dá)

3.3 葛根素6″-O-木糖苷對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞上清液中炎性因子的影響 如圖3所示，與對(duì)照組比較，ox-LDL組細(xì)胞上清液中IL-1β(圖3A)、TNF-α(圖3B)水平升高(P<0.05)；與ox-LDL組比較，葛根素6″-O-木糖苷呈劑量依賴(lài)性地抑制ox-LDL誘導(dǎo)的IL-1β、TNF-α水平升高(P<0.05)。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與ox-LDL組比較，#P<0.05。圖3 各組HUVECs細(xì)胞上清液中炎性因子水平

3.4 葛根素6″-O-木糖苷對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞中黏附分子的影響 如圖4所示，與對(duì)照組比較，ox-LDL組細(xì)胞中ICAM1(圖4A)、VCAM1(圖4B)蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與ox-LDL組比較，葛根素6″-O-木糖苷呈劑量依賴(lài)性地抑制ox-LDL誘導(dǎo)的ICAM1、VCAM1表達(dá)升高(P<0.05)。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與ox-LDL組比較，#P<0.05。圖4 各組HUVECs細(xì)胞中黏附分子的表達(dá)

3.5 葛根素6″-O-木糖苷對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞NF-κB通路的影響 如圖5A所示，與對(duì)照組比較，ox-LDL組細(xì)胞p-p65蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與ox-LDL組比較，葛根素6″-O-木糖苷呈劑量依賴(lài)性地抑制ox-LDL誘導(dǎo)的p-p65蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。如圖5B所示，與對(duì)照組比較，ox-LDL組細(xì)胞p-IκB-α表達(dá)升高(P<0.05)；與ox-LDL組比較，葛根素6″-O-木糖苷呈劑量依賴(lài)性地抑制ox-LDL誘導(dǎo)的p-IκB-α蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與ox-LDL組比較，#P<0.05。圖5 各組HUVECs細(xì)胞NF-κB通路蛋白表達(dá)

4 討論

血管內(nèi)皮損傷是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展的始動(dòng)環(huán)節(jié)[12]，在該病病灶部位中ox-LDL水平升高。HUVEC具有與動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞相似的生物學(xué)特征，用ox-LDL體外誘導(dǎo)HUVECs，可以模擬體內(nèi)血管內(nèi)皮損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，葛根素6″-O-木糖苷能夠抵抗ox-LDL 誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞損傷，提高細(xì)胞活性，抑制細(xì)胞凋亡和炎性反應(yīng)。

在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中存在廣泛的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，損傷的內(nèi)皮細(xì)胞能夠誘導(dǎo)IL-1β、IL-6和TNF-α等炎性因子和VCAM1、ICAM1等黏附分子的產(chǎn)生，加速白細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞的黏附和級(jí)聯(lián)炎性反應(yīng)[13]。通過(guò)ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs，使得HUVEC細(xì)胞活性下降，caspase-3活性和表達(dá)提高，且IL-1β、TNF-α、VCAM1和ICAM1表達(dá)升高。Bhaskar等[14]發(fā)現(xiàn)槲皮素降低ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs中VCAM1、ICAM1、MCP-1和IL-6等炎性介質(zhì)表達(dá)。槲皮素和蘆丁調(diào)節(jié)JAK2通路抑制ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[15]。芳香新塔花總黃酮抑制炎癥反應(yīng)來(lái)保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞[16]。本研究中葛根素6″-O-木糖苷能夠呈劑量依賴(lài)性地抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞損傷，包括提高細(xì)胞活性，降低caspase-3表達(dá)，且下調(diào)IL-1β、TNF-α、VCAM1和ICAM1表達(dá)。

NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，廣泛參與癌癥、炎癥和免疫疾病的發(fā)展[17-18]，其信號(hào)通路的激活與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展進(jìn)程密切相關(guān)[19-21]。Bhaskar等[14]發(fā)現(xiàn)槲皮素通過(guò)調(diào)控NF-κB信號(hào)通路減少動(dòng)脈粥樣硬化炎性和黏附分子的表達(dá)。Deng等[22]發(fā)現(xiàn)葛根素通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路可抵抗LPS誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮損傷。本研究發(fā)現(xiàn)ox-LDL處理導(dǎo)致HUVECs細(xì)胞中p-p65和p-IκB-α表達(dá)升高，激活NF-κB信號(hào)通路；而葛根素6″-O-木糖苷處理能夠呈劑量依賴(lài)性地抑制ox-LDL誘導(dǎo)的p-p65和p-IκB-α表達(dá)升高。

綜上所述，本研究證實(shí)了葛根素6″-O-木糖苷在ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞中發(fā)揮重要的作用，包括提高細(xì)胞活性，抑制細(xì)胞凋亡，降低炎性因子和黏附分子水平，與抑制NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。