田雨青， 任宏麗*， 梁阿娟

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203；2.上海市同濟(jì)醫(yī)院，上海 200065)

妊娠期糖尿病是妊娠期發(fā)生的一種嚴(yán)重疾病，其中超重、肥胖、高齡產(chǎn)婦等是關(guān)鍵危險(xiǎn)因素[1]。該病是指在妊娠期發(fā)生或首次發(fā)現(xiàn)的對(duì)糖耐受性降低，會(huì)出現(xiàn)早產(chǎn)、流產(chǎn)、巨大兒等，對(duì)母嬰健康帶來嚴(yán)重影響[2]。滋養(yǎng)層細(xì)胞是胚胎發(fā)育而來的，可以直接與子宮內(nèi)膜的細(xì)胞接觸，在維持胚胎早期著床、母胎物質(zhì)交換和排除代謝物等方面具有重要的作用，若滋養(yǎng)層細(xì)胞發(fā)生異常則易引起流產(chǎn)、早產(chǎn)等[3-4]。

黃芩苷是從黃芩中提取出的黃酮類化合物，具有抗腫瘤、抑菌、利尿等活性[5]，可降低妊娠期大鼠模型的血壓、尿蛋白，其作用機(jī)制與sFIT-1、PLGF表達(dá)有關(guān)[6]；能抑制腫瘤壞死因子α(TNF-α)誘導(dǎo)人早孕絨毛細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞的凋亡，但在高糖環(huán)境下的研究尚不明確[7]。miRNA是非編碼RNA，廣泛參與多種疾病的發(fā)展，包括妊娠期糖尿病[8]。梁小娟等[9]報(bào)道，它在妊娠期糖尿病患者外周血中表達(dá)上調(diào)，與胰島素抵抗指數(shù)呈正相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)在高糖環(huán)境下體外培養(yǎng)人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞，探討黃芩苷通過調(diào)控miR-451影響高糖誘導(dǎo)滋養(yǎng)層細(xì)胞的活力、凋亡和氧化應(yīng)激。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑 人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/Svneo購于美國ATCC典藏中心。胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購于上海語純生物科技有限公司；葡萄糖購于美國Sigma公司；黃芩苷購于南京青澤醫(yī)藥有限公司；anti-miR-NC、anti-miR-451、miR-NC、miR-451購于上海吉瑪制藥有限公司；Lipofectamine 3000試劑盒、Trizol試劑盒購于美國Thermo Fisher公司；CCK8試劑盒、凋亡試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；cleaved-caspase3抗體、Bax抗體、GAPDH抗體購于英國Abcam公司；辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗購于武漢博士德生物工程有限公司；LDH、MDA、SOD試劑盒購于南京建成生物工程研究所；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒購于日本TaKaRa公司；引物購于廣州銳博生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 從液氮內(nèi)取出人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/Svneo，培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)，置于培養(yǎng)箱中，在37 ℃、5% CO2下每2 d換1次培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)融合至80%時(shí)，加入胰酶消化培養(yǎng)。

1.3 分組及給藥 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)狀態(tài)良好的人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/Svneo，用5.5、25 mmol/L葡萄糖處理，作為對(duì)照組和高糖組；用含25、100 μmol/L黃芩苷和25 mmol/L葡萄糖處理細(xì)胞，作為高糖+黃芩苷低、高劑量組；將anti-miR-NC和anti-miR-451轉(zhuǎn)染人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/Svneo后進(jìn)行高糖處理，作為高糖+anti-miR-NC組、高糖+anti-miR-451組；將miR-NC和miR-451轉(zhuǎn)染人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/Svneo后，采用25 mmol/L葡萄糖和100 μmol/L黃芩苷處理細(xì)胞，作為高糖+黃芩苷+miR-NC組、高糖+黃芩苷+miR-451組。參照Lipofectamine 3000試劑盒說明書進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，48 h后收集細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 CCK8檢測(cè)細(xì)胞活性 取人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/Svneo，重懸后接種在96孔細(xì)胞板中，培養(yǎng)48 h后每孔加入10 μL CCK8溶液，室溫下反應(yīng)2 h，在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度，計(jì)算細(xì)胞活性。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/Svneo，接種在6孔細(xì)胞板中，離心后除去上清，加入400 μL結(jié)合緩沖液吹打后加入Annexin V-FITC、PI各5 μL，避光反應(yīng)15 min，在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.6 Western blot檢測(cè)cleaved-caspase3、Bax蛋白表達(dá) 取人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/Svneo，加RIPA蛋白裂解液提取總蛋白并檢測(cè)濃度，100 ℃煮沸變性5 min，取40 μg在SDS-PAGE上進(jìn)行電泳分離處理，轉(zhuǎn)膜，加入脫脂奶粉封閉培養(yǎng)2 h，加入cleaved-caspase3、Bax、GAPDH抗體，在4 ℃下過夜培養(yǎng)，洗膜3次，加入辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗，室溫培養(yǎng)2 h，洗膜3次，加入ECL發(fā)光液，顯影，以GAPDH為內(nèi)參，采用Image J軟件掃描分析蛋白條帶的灰度值。

1.7 試劑盒檢測(cè)MDA水平及LDH、SOD活性 取人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/Svneo，清洗后加入裂解液，離心取細(xì)胞上清液，參照相關(guān)試劑盒說明書分別檢測(cè)MDA水平及LDH、SOD活性。

1.8 RT-qPCR檢測(cè)miR-451表達(dá) 取人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/Svneo，加入Trizol試劑進(jìn)行總RNA提取，采用分光度計(jì)檢測(cè)260、280 nm波長(zhǎng)處RNA濃度，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，將cDNA滅活后參照熒光定量試劑說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法檢測(cè)miR-451表達(dá)。miR-451正向引物序列5′-AAACCGTTACCATTACTGAGTT-3′，反向引物序列5′-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3′；U6正向引物序列5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，反向引物序列5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度黃芩苷對(duì)高糖誘導(dǎo)滋養(yǎng)層細(xì)胞活性和凋亡的影響 與對(duì)照組比較，高糖組細(xì)胞活性降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率、cleaved-caspase3和Bax蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與高糖組比較，高糖+黃芩苷低、高劑量組細(xì)胞活性升高(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率、cleaved-caspase3和Bax蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，見圖1、表1。

圖1 各組細(xì)胞凋亡率(A)、凋亡相關(guān)蛋白(B)(Ⅰ)

表1 不同濃度黃芩苷對(duì)高糖誘導(dǎo)滋養(yǎng)層細(xì)胞活性和凋亡的影響

2.2 不同濃度黃芩苷對(duì)高糖誘導(dǎo)滋養(yǎng)層細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 與對(duì)照組比較，高糖組細(xì)胞LDH活性、MDA水平升高(P<0.05)，SOD活性降低(P<0.05)；與高糖組比較，高糖+黃芩苷低、高劑量組細(xì)胞LDH活性、MDA水平降低(P<0.05)，SOD活性升高(P<0.05)，見表2。

表2 不同濃度黃芩苷對(duì)高糖誘導(dǎo)滋養(yǎng)層細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

2.3 不同濃度黃芩苷對(duì)高糖誘導(dǎo)滋養(yǎng)層細(xì)胞miR-451表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，高糖組細(xì)胞miR-451表達(dá)升高(P<0.05)；與高糖組比較，高糖+黃芩苷低、高劑量組細(xì)胞miR-451表達(dá)降低(P<0.05)，見表3。

表3 各組細(xì)胞miR-451表達(dá)比較

2.4 干擾miR-451對(duì)高糖誘導(dǎo)滋養(yǎng)層細(xì)胞活性和凋亡的影響 與高糖+anti-miR-NC組比較，高糖+anti-miR-451組細(xì)胞miR-451表達(dá)、細(xì)胞凋亡率及cleaved-caspase3、Bax蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，細(xì)胞活性升高(P<0.05)，見圖2、表4。

表4 干擾miR-451對(duì)高糖誘導(dǎo)滋養(yǎng)層細(xì)胞活性和凋亡的影響

圖2 各組細(xì)胞凋亡率(A)、凋亡相關(guān)蛋白(B)(Ⅱ)

2.5 干擾miR-451對(duì)高糖誘導(dǎo)滋養(yǎng)層細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 與高糖+anti-miR-NC組比較，高糖+anti-miR-451組細(xì)胞LDH活性、MDA水平降低(P<0.05)，SOD活性升高(P<0.05)，見表5。

表5 干擾miR-451對(duì)高糖誘導(dǎo)滋養(yǎng)層細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

2.6 黃芩苷對(duì)高糖誘導(dǎo)滋養(yǎng)層細(xì)胞活性、凋亡、氧化應(yīng)激的影響 與高糖+黃芩苷+miR-NC組比較，高糖+黃芩苷+miR-451組細(xì)胞miR-451表達(dá)、細(xì)胞凋亡率、LDH活性、MDA水平及cleaved-caspase3、Bax蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，細(xì)胞活性、SOD活性降低(P<0.05)，見圖3、表6。

圖3 各組細(xì)胞凋亡率(A)、凋亡相關(guān)蛋白(B)(Ⅲ)

表6 黃芩苷對(duì)高糖誘導(dǎo)滋養(yǎng)層細(xì)胞活性、凋亡、氧化應(yīng)激的影響

3 討論

糖代謝異常是妊娠期糖尿病發(fā)生的主要原因，高糖能夠使滋養(yǎng)層細(xì)胞、心肌細(xì)胞等發(fā)生凋亡，抑制細(xì)胞的增殖[10]。高糖處理滋養(yǎng)層細(xì)胞，能夠使滋養(yǎng)層細(xì)胞的微絨毛排列紊亂和出現(xiàn)破壞、疏密不均等現(xiàn)象[11]，促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞的凋亡、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[12-13]。本研究中用25 mmol/L葡萄糖處理人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞，抑制細(xì)胞的活力，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡率，上調(diào)cleaved-caspase3和Bax蛋白表達(dá)，LDH活性、MDA水平升高，SOD活性降低。黃芩具有瀉火排毒、止血和安胎等功效，黃芩苷是從黃芩內(nèi)提取分離的黃酮類化合物，在抗炎、抗氧化、降血壓等多種藥理活性[14]。人早孕絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞經(jīng)過TNF-α處理后，黃芩苷促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞細(xì)胞的增殖，效果優(yōu)于黃芩水提取物[15]。黃芩苷能夠抑制TNF-α誘導(dǎo)的人蛻膜細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖[16]。本研究選取25、100 μmol/L黃芩苷作用人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞后，促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞活性，抑制細(xì)胞凋亡率，下調(diào)cleaved-caspase3和Bax蛋白表達(dá)，LDH活性、MDA水平降低，SOD活性升高，說明黃芩苷能夠減緩高糖誘導(dǎo)的人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞的凋亡和氧化應(yīng)激，促進(jìn)細(xì)胞的活力。

miRNA是一種高度保守的單鏈非編碼RNA分子，通過調(diào)控下游mRNA，參與滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖、凋亡等多種生物學(xué)作用[17]。Zhou等[18]研究顯示，miR-384在胚胎和血漿、滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo中表達(dá)上調(diào)，miR-384通過靶向負(fù)調(diào)控PTBP3能夠抑制滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo的增殖。曹文超等[19]研究顯示，過表達(dá)miR-205-5p在滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/Svneo中表達(dá)上調(diào)，過表達(dá)miR-205-5p可以抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/Svneo的增殖和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。本研究顯示，高糖處理人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞后，miR-451表達(dá)上調(diào)，經(jīng)過25、100 μmol/L黃芩苷處理后，miR-451表達(dá)下調(diào)，干擾miR-451能夠促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞的活力，抑制細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激。過表達(dá)的miR-451部分恢復(fù)，說明黃芩苷可能通過調(diào)控miR-451減緩高糖誘導(dǎo)的人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞氧化損傷。

綜上所述，高糖條件下miR-451表達(dá)上調(diào)，黃芩苷能夠通過下調(diào)miR-451的表達(dá)減緩高糖誘導(dǎo)的人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞的凋亡和氧化應(yīng)激，促進(jìn)細(xì)胞的活力，起到保護(hù)細(xì)胞的作用。