呂 靜， 崔宇煒， 張 英

(鄭州衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院，河南 鄭州 450005)

骨關(guān)節(jié)炎是臨床常見的一種慢性關(guān)節(jié)疾病，研究顯示軟骨細(xì)胞凋亡是造成骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生的重要原因之一，而微小RNA(miRNA)可調(diào)控軟骨細(xì)胞增殖及凋亡等生物學(xué)過程從而參與骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生及發(fā)展[1-3]，如何抑制軟骨細(xì)胞凋亡成為了研究熱點(diǎn)。目前臨床常用的骨關(guān)節(jié)炎治療藥物(非甾體類抗炎藥)存在較多副作用，天然植物化學(xué)物質(zhì)具有安全、有效等優(yōu)點(diǎn)，可為治療骨關(guān)節(jié)炎等炎癥性疾病提供新方向[4]。番茄紅素可抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)從而對帕金森小鼠的神經(jīng)元發(fā)揮保護(hù)作用[5]，但番茄紅素對軟骨細(xì)胞損傷的作用機(jī)制尚未完全闡明。微小RNA-374a-5p(miR-374a-5p)表達(dá)升高可抑制新生兒缺氧缺血性腦病的神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)[6]，然而番茄紅素是否通過miR-374a-5p影響白細(xì)胞介素(IL)-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎性損傷尚未明確。因此，本研究旨在探討番茄紅素在IL-1β刺激的軟骨細(xì)胞損傷模型中的調(diào)節(jié)作用和機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF級SD雄性大鼠10只，體質(zhì)量180～220 g，購自南京卡文斯生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號SCXK(寧)2016-0008。

1.2 試劑與藥物 番茄紅素購自晨光生物科技集團(tuán)股份有限公司(純度96%，批號20180623)。IL-1β購自上海江萊生物科技有限公司；IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、γ干擾素(IFN-γ)檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自美國Sigma公司；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)所需試劑盒購自廈門安普利生物工程有限公司；miR-374a-5p寡核苷酸模擬物(miR-374a-5pmimics)、陰性對照mimic NC序列(miR-NC)、miR-374a-5p特異性寡核苷酸抑制劑(anti-miR-374a-5p)、其陰性對照(anti-miR-NC)購自廣州銳博生物技術(shù)有限公司；兔抗鼠Bcl-2、Bax抗體購自美國Santa Cruz公司。

2 方法

2.1 膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)與分離 按照文獻(xiàn)[7]報(bào)道，將10只大鼠置于75%乙醇中浸泡3 min，取出關(guān)節(jié)軟骨，放入PBS溶液中洗滌4次，置于含有青霉素的小瓶中，加入Ⅱ型膠原酶溶液，剪切組織呈1 mm3碎片，置于37 ℃水浴鍋內(nèi)消化30 min，棄懸浮液，加入DMEM漂洗2次，棄上清，加入10倍量Ⅱ型膠原酶溶液，37 ℃水浴鍋內(nèi)消化30 min，收集上懸液，4 ℃、1 000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞沉淀，PBS清洗并加入DMEM懸浮細(xì)胞，將分離的軟骨細(xì)胞置于25 cm2培養(yǎng)皿進(jìn)行培養(yǎng)。以第3代細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象。

2.2 分組及給藥 在96孔板每孔中接種100 μL對數(shù)生長期軟骨細(xì)胞(密度為1×105/mL)，隨機(jī)分為對照組(常規(guī)培養(yǎng)基)、IL-1β組(10 ng/mL IL-1β)[8]和IL-1β+番茄紅素低、中、高劑量組(10 ng/mL IL-1β+2.5、5、10 μmol/L番茄紅素)[9]，培養(yǎng)24 h。后續(xù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置IL-1β+miR-NC組(10 ng/mL IL-1β+轉(zhuǎn)染miR-NC)、IL-1β+miR-374a-5p組(10 ng/mL IL-1β+轉(zhuǎn)染miR-374a-5pmimics)及IL-1β+番茄紅素+anti-miR-NC組(10 ng/mL IL-1β+10 μmol/L番茄紅素+轉(zhuǎn)染anti-miR-NC)、IL-1β+番茄紅素+anti-miR-374a-5p組(10 ng/mL IL-1β+10 μmol/L番茄紅素+轉(zhuǎn)染anti-miR-374a-5p)，培養(yǎng)24 h。

2.3 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測細(xì)胞上清液IL-6、TNF-α、IFN-γ水平 按“2.2”項(xiàng)下方法分組及給藥，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞及其培養(yǎng)液，4 ℃、3 000 r/min離心6 min，收集上清液，根據(jù)試劑盒說明書檢測IL-6、TNF-α、IFN-γ水平。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 按“2.2”項(xiàng)下方法分組及給藥，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，4 ℃、3 000 r/min離心6 min，根據(jù)凋亡試劑盒說明書，加入5 μL Annexin V-FITC、10 μL PI，室溫避光孵育20 min，通過CytoFLEX流式細(xì)胞儀分析。

2.5 RT-qPCR檢測細(xì)胞中miR-374a-5p表達(dá) 將Trizol試劑添加到軟骨細(xì)胞中提取總RNA，通過Nanodrop2000c光度計(jì)檢測RNA濃度，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA制備。取2 μL cDNA，10×PCR Buffer、MgSO4、dNTPs各2.5 μL、正反向引物各0.5 μL，與RNase-Free ddH2O配制25 μL RT-qPCR擴(kuò)增體系進(jìn)行反應(yīng)。miR-374a-5p正向5′-GACG ACTGTAGCTGATGATCG-3′，反向5′-TCCATACGATCGA CTAGCTCA-3′；內(nèi)參U6正向5′-GCTTCGGCAG CACATATACT-3′，反向5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′。采用2-ΔΔCT法計(jì)算miR-374a-5p相對表達(dá)量。

2.6 Western blot檢測細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白表達(dá) 按“2.2”項(xiàng)下方法分組及給藥，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液以提取總蛋白，蛋白變性后通過SDS-PAGE蛋白電泳，轉(zhuǎn)膜，室溫封閉2 h，分別加入一抗(1∶1 000)與內(nèi)參(1∶1 000)稀釋液，4 ℃孵育24 h，加入二抗稀釋液(1∶2 000)，室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光試劑顯影，采用Image J軟件分析各條帶灰度值。

3 結(jié)果

3.1 番茄紅素對IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞炎性反應(yīng)的影響 與對照組比較，IL-1β組細(xì)胞IL-6、TNF-α、IFN-γ水平升高(P<0.01)；與IL-1β組比較，IL-1β+番茄紅素各劑量組細(xì)胞IL-6、TNF-α、IFN-γ水平降低(P<0.01)，并呈劑量依賴性，見表1。

表1 番茄紅素對IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞炎性反應(yīng)的影響

3.2 番茄紅素對IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響 與對照組比較，IL-1β組細(xì)胞凋亡率升高(P<0.01)，Bcl-2蛋白表達(dá)降低(P<0.01)，Bax蛋白表達(dá)升高(P<0.01)；與IL-1β組比較，IL-1β+番茄紅素各劑量組細(xì)胞凋亡率降低(P<0.01)，Bcl-2蛋白表達(dá)升高(P<0.01)，Bax蛋白表達(dá)降低(P<0.01)，并呈劑量依賴性，見圖1、表2。

表2 番茄紅素對IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響

圖1 番茄紅素對IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡(A)及Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)(B)的影響

3.3 番茄紅素對IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞中miR-374a-5p表達(dá)的影響 與對照組比較，IL-1β組細(xì)胞中miR-374a-5p表達(dá)降低(P<0.01)；與IL-1β組比較，IL-1β+番茄紅素各劑量組細(xì)胞中miR-374a-5p表達(dá)升高(P<0.01)，并呈劑量依賴性，見表3。

表3 番茄紅素對IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞中miR-374a-5p表達(dá)的影響

3.4miR-374a-5p過表達(dá)對IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞炎性反應(yīng)的影響 與IL-1β+miR-NC組比較，IL-1β+miR-374a-5p組細(xì)胞IL-6、TNF-α、IFN-γ水平降低(P<0.01)，見表4。

表4 miR-374a-5p過表達(dá)對IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞炎性反應(yīng)的影響

3.5miR-374a-5p過表達(dá)對IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響 與IL-1β+miR-NC組比較，IL-1β+miR-374a-5p組細(xì)胞凋亡率降低(P<0.01)，Bcl-2蛋白表達(dá)升高(P<0.01)，Bax蛋白表達(dá)降低(P<0.01)，見圖2、表5。

圖2 miR-374a-5p過表達(dá)對IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡(A)及Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)(B)的影響

3.6 干擾miR-374a-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)番茄紅素對IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞炎性損傷的作用 與IL-1β+番茄紅素+anti-miR-NC組比較，IL-1β+番茄紅素+anti-miR-374a-5p組細(xì)胞IL-6、TNF-α、IFN-γ水平升高(P<0.01)，細(xì)胞凋亡率升高(P<0.01)，Bcl-2蛋白表達(dá)降低(P<0.01)，Bax蛋白表達(dá)升高(P<0.01)，見圖3、表6。

表6 干擾miR-374a-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)番茄紅素對IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞炎性損傷的作用

圖3 干擾miR-374a-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)番茄紅素對IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡(A)及Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)(B)的作用

表5 miR-374a-5p過表達(dá)對IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響

4 討論

軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡等均能促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生，天然藥物具有抗炎、抗氧化等作用，并可以抑制軟骨細(xì)胞凋亡[10-11]，但關(guān)于天然藥物在骨關(guān)節(jié)炎治療中的作用機(jī)制尚未完全闡明。

番茄紅素可以通過抑制心肌細(xì)胞凋亡從而減輕心肌細(xì)胞氧化損傷[12]，還可預(yù)防神經(jīng)系統(tǒng)性疾病的發(fā)生[13]。研究發(fā)現(xiàn)，番茄紅素可以抑制糖尿病大鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng)并改善視網(wǎng)膜線粒體損傷[14]。本研究中，IL-1β使軟骨細(xì)胞IL-6、TNF-α、IFN-γ水平升高，與文獻(xiàn)[15]報(bào)道結(jié)果相似，提示模型建立成功。使用2.5、5、10 μmol/L番茄紅素處理后，軟骨細(xì)胞IL-6、TNF-α、IFN-γ水平隨著番茄紅素劑量的增加而降低，表明番茄紅素可降低IL-1β引起的軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)，且呈劑量依賴性。軟骨細(xì)胞凋亡在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用，通過增加Bcl-2水平及降低Bax水平有助于減輕軟骨細(xì)胞的凋亡[16]。本研究中，軟骨細(xì)胞在IL-1β刺激后發(fā)生凋亡，而番茄紅素降低凋亡率，并上調(diào)Bcl-2表達(dá)，下調(diào)Bax表達(dá)，表明番茄紅素對IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡具有抑制作用，且呈劑量依賴性。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，番茄紅素可上調(diào)IL-1β處理的軟骨細(xì)胞miR-374a-5p表達(dá)，且呈劑量依賴性，提示番茄紅素保護(hù)軟骨細(xì)胞損傷的作用可能與上調(diào)miR-374a-5p有關(guān)。miR-374a-5p表達(dá)上調(diào)對神經(jīng)系統(tǒng)[17]、暴露于低氧的神經(jīng)細(xì)胞損傷[18]起保護(hù)作用。本研究中，miR-374a-5p過表達(dá)可降低IL-6、TNF-α、IFN-γ水平，還可上調(diào)Bcl-2、下調(diào)Bax來抑制細(xì)胞凋亡，提示miR-374a-5p過表達(dá)可抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡。為探究番茄紅素是否通過調(diào)控miR-374a-5p的表達(dá)而發(fā)揮作用，本研究將anti-miR-374a-5p轉(zhuǎn)染至軟骨細(xì)胞，分別使用IL-1β與番茄紅素共同處理，結(jié)果顯示IL-6、TNF-α、IFN-γ水平、凋亡率均升高，提示番茄紅素保護(hù)軟骨細(xì)胞IL-1β?lián)p傷的作用可能是通過上調(diào)miR-374a-5p來實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，番茄紅素可抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎性損傷及細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能是通過上調(diào)miR-374a-5p的表達(dá)，可為骨關(guān)節(jié)炎的治療提供潛在靶點(diǎn)。