李小雪， 陳 昕， 蘇海波， 方延廷， 李屹龍， 俞佳利， 孫琳潔， 薛金貴*

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院心內(nèi)科，上海 201203；2.上海雷允上藥業(yè)有限公司，上海 201499)

動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病是嚴(yán)重威脅人類健康的一類疾病，發(fā)病率和死亡率一直居高不下，給家庭和國家醫(yī)療衛(wèi)生帶來了沉重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。雖然近些年來動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病的預(yù)防和治療已取得重大進(jìn)展，但仍由許多動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病患者不適合有創(chuàng)性血運(yùn)重建，或血運(yùn)重建后存在殘余狹窄，迫切需要其它創(chuàng)新的治療方法加以補(bǔ)充[1]。治療性血管新生已被證明可以重建缺血心臟組織的血管，減少組織梗死的進(jìn)展，并避免侵入性外科手術(shù)或組織/器官移植，是動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病患者治療的有益補(bǔ)充[2]。中藥丹參中含有的藥效成分是內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌、心肌細(xì)胞和免疫細(xì)胞中許多受體的潛在靶點(diǎn)，通過影響細(xì)胞的增殖、分化、遷移或分泌，發(fā)揮預(yù)防、抑制早期事件以及改善動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病發(fā)展的作用[3-4]。本實(shí)驗(yàn)研究雷氏丹參片在斑馬魚模型上促血管新生作用，為雷氏丹參片活血化瘀、改善微循環(huán)、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞等治療心腦血管病提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)Tg(fli-1a：EGFP)y1斑馬魚、野生型斑馬魚，由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院斑馬魚實(shí)驗(yàn)室提供并飼養(yǎng),實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(滬)2018-0004。

1.2 試劑與藥物 雷氏丹參片浸膏粉(上海雷允上藥業(yè)有限公司,批號(hào)180718),1 g雷氏丹參片浸膏粉相當(dāng)于1.10～1.16 g生藥量。PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(endothelial cell growth receptor tyrosine kinase inhibitorⅡ,VRI)(美國Selleck公司, 批號(hào)S1040)；TRIpure(批號(hào)1166716500)、cDNA合成試劑盒(批號(hào)4897030001)、SYBR Green Master(批號(hào)4913914001)均購自上海羅氏制藥有限公司。

1.3 儀器 斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)(北京愛生科技發(fā)展有限公司)；熒光倒置顯微鏡(日本尼康公司)；熒光定量PCR儀(上海羅氏公司)；多功能酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)。

2 方法

2.1 雷氏丹參片毒性實(shí)驗(yàn) 使用正常健康受精24 h的野生型斑馬魚，放入每孔含1 mL飼養(yǎng)液的24孔板中,每組10條。用胚胎培養(yǎng)液稀釋雷氏丹參片，制成質(zhì)量濃度為0.1、1、3、10、30、100、300 μg/mL的混懸液,分別加入24孔板中,于28.5 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),以僅加培養(yǎng)液組為空白對(duì)照組,培養(yǎng)5 d,每天定時(shí)使用熒光倒置顯微鏡下拍照觀察斑馬魚的狀態(tài)并記錄。

2.2 雷氏丹參片干預(yù)斑馬魚腸下血管新生實(shí)驗(yàn) 使用正常健康受精24 h的Tg(fli-1a：EGFP)y1斑馬魚,鑷子除去胚胎軟殼,將其飼養(yǎng)于24孔板中,每孔8條,每組2個(gè)復(fù)孔。用胚胎培養(yǎng)液稀釋雷氏丹參片至3、10、30、100 μg/mL，作為加藥組,以僅加培養(yǎng)液組為空白對(duì)照組，放入28.5 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,吸棄舊培養(yǎng)液,重新加入培養(yǎng)液和不同質(zhì)量濃度的雷氏丹參片，培養(yǎng)48 h后在熒光倒置顯微鏡下觀察雷氏丹參片在不同質(zhì)量濃度下對(duì)斑馬魚腸下靜脈血管(SIVs)的影響。斑馬魚腸下血管出芽數(shù)=血管出芽數(shù)×1,斑馬魚腸下血管交叉數(shù)=血管交叉數(shù)×1。

2.3 雷氏丹參片干預(yù)VRI誘導(dǎo)斑馬魚腸下血管損傷實(shí)驗(yàn) 使用正常健康受精24 h的Tg(fli-1a：EGFP)y1斑馬魚幼魚,將其飼養(yǎng)于24孔板中,每孔8條,每組3個(gè)復(fù)孔。以100 nmol/L VRI為培養(yǎng)液,然后用培養(yǎng)液稀釋雷氏丹參片質(zhì)量濃度為3、10、30、100 μg/mL，為加藥組,放入28.5 ℃培養(yǎng)箱中,以不加VRI的培養(yǎng)液組為空白對(duì)照組，藥物干預(yù)24 h后觀察雷氏丹參片在對(duì)斑馬魚SIVs的影響。

2.4 雷氏丹參片干預(yù)VRI誘導(dǎo)斑馬魚節(jié)間血管損傷實(shí)驗(yàn) 使用正常健康受精24 h的Tg(fli-1a：EGFP)y1斑馬魚幼魚,將其飼養(yǎng)于24孔板中,每孔8條,每組2個(gè)復(fù)孔。按“2.3”項(xiàng)下方法分組，藥物干預(yù)24 h后在熒光倒置顯微鏡下觀察雷氏丹參片在對(duì)斑馬魚節(jié)間血管的影響。斑馬魚節(jié)間血管統(tǒng)計(jì)方法=完整血管數(shù)×1+不完整血管數(shù)×0.5。

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測斑馬魚體內(nèi)mRNA的表達(dá) 選擇正常健康受精24 h的斑馬魚幼魚，飼養(yǎng)于24孔板中,每組12條，分為空白對(duì)照組、模型組、VRI+雷氏丹參片組和雷氏丹參片組，以100 nmol/L VRI為培養(yǎng)液,然后用培養(yǎng)液稀釋雷氏丹參片質(zhì)量濃度為100 μg/mL。藥物作用24 h后,使用TRIpure提取各組斑馬魚總RNA,轉(zhuǎn)錄因子cDNA合成試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為模板,SYBR Green Master進(jìn)行定量PCR。擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性20 s，60 ℃退火30 s,72 ℃延伸15 s,40個(gè)循環(huán)。檢測VEGF、flt-l、kdr、kdrlmRNA表達(dá),以GAPDH為內(nèi)參基因,2-△△CT法計(jì)算相對(duì)表達(dá)，引物序列見表1。

表1 引物序列

3 結(jié)果

3.1 雷氏丹參片對(duì)斑馬魚生存率的影響 使用不同質(zhì)量濃度雷氏丹參片進(jìn)行培養(yǎng),當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到300 μg/mL時(shí),培養(yǎng)到第3天后斑馬魚開始出現(xiàn)死亡,到第5天全部死亡,其他質(zhì)量濃度斑馬魚正常存活,說明雷氏丹參片的安全劑量為100 μg/mL及100 μg/mL以下，見圖1。

3.2 雷氏丹參片對(duì)正常斑馬魚腸下血管的影響 與空白對(duì)照組比較,各劑量雷氏丹參片組出芽數(shù)和交叉點(diǎn)均無明顯變化(P>0.05)；各劑量雷氏丹參片可促進(jìn)斑馬魚直徑生長(P<0.05)，見圖2、表2～3。

圖2 雷氏丹參片對(duì)正常斑馬魚腸下血管的影響(×4.5)

表2 雷氏丹參片對(duì)正常斑馬魚腸下血管直徑的影響

3.3 雷氏丹參片對(duì)VRI抑制斑馬魚腸下血管生長障礙的影響 與空白對(duì)照組比較,模型組斑馬魚腸下血管出芽數(shù)及直徑無明顯變化(P>0.05)，交叉點(diǎn)數(shù)減少(P<0.05)；與模型組比較,各劑量雷氏丹參片組斑馬魚腸下血管出芽數(shù)無明顯變化(P>0.05)，交叉點(diǎn)數(shù)和直徑增加(P<0.05)，見圖3、表4～5。

圖3 雷氏丹參片對(duì)VRI抑制斑馬魚腸下血管生長障礙的影響(×4.5)

表3 雷氏丹參片對(duì)正常斑馬魚腸下血管出芽數(shù)和交叉點(diǎn)的影響[M(QL,QU)]

表4 雷氏丹參片對(duì)VRI抑制斑馬魚腸下血管直徑的影響

3.4 雷氏丹參片對(duì)VRI抑制斑馬魚節(jié)間血管生長障礙的影響 與空白對(duì)照組比較,模型組和0.1 μg/mL雷氏丹參片組斑馬魚節(jié)間血管直徑減少(P<0.01)，1、10、100 μg/mL雷氏丹參片組無明顯變化(P>0.05)；與模型組比較,1、10、100 μg/mL雷氏丹參片組斑馬魚節(jié)間血管直徑增加(P<0.01),0.1 μg/mL雷氏丹參片組無明顯變化(P>0.05)，見圖4～5。

圖4 雷氏丹參片對(duì)VRI抑制斑馬魚節(jié)間血管生長障礙的影響(×4.5)

表5 雷氏丹參片對(duì)VRI抑制斑馬魚腸下血管出芽數(shù)和交叉點(diǎn)的影響[M(QL,QU)]

3.5 雷氏丹參片對(duì)VRI抑制斑馬魚中VEGF及其受體表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組比較，模型組斑馬魚中kdr、flt-1 mRNA表達(dá)降低(P<0.05)；與模型組比較, VRI+雷氏丹參片組和雷氏丹參片組斑馬魚中kdr、flt-1 mRNA表達(dá)均升高(P<0.01),VRI+雷氏丹參片組斑馬魚中VEGF、kdrlmRNA表達(dá)無明顯變化(P>0.05),雷氏丹參片組斑馬魚中kdrlmRNA表達(dá)升高(P<0.05),見圖6。

注：與空白對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01; 與模型組比較,##P<0.01。圖5 雷氏丹參片對(duì)VRI抑制斑馬魚節(jié)間血管生長障礙的影響

注：與空白對(duì)照組比較,**P<0.01; 與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01。圖6 雷氏丹參片對(duì)VRI抑制斑馬魚VEGF、kdrl、kdr、flt-1 mRNA表達(dá)的影響

4 討論

血管新生作為冠心病的內(nèi)科治療手段,已成為治療冠心病的一種可能,并在心血管疾病中表現(xiàn)出了積極的治療作用[5]。斑馬魚作為一種整體動(dòng)物模型,基于其成本低廉、與人類基因同源性高、方便快速篩選等特點(diǎn),已成為心血管研究領(lǐng)域的理想動(dòng)物模型[6]。丹參作為傳統(tǒng)中藥,其有效成分具有抗凝血、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、改善微循環(huán)等多種藥理作用,被廣泛用于治療心血管疾病,包括心肌梗死、心絞痛和動(dòng)脈粥樣硬化等,能夠改善患者的臨床癥狀[7-9]。丹參及其成分參與調(diào)控血管新生, 徐杰等[10]研究發(fā)現(xiàn)丹參水溶性有效成分丹參多酚酸鹽，能夠促進(jìn)單核細(xì)胞誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞遷移，并促進(jìn)單核細(xì)胞合成和分泌VEGF、bFGF。丹參素可增強(qiáng)缺血后的新生血管形成,以及血管內(nèi)皮生長因子和堿性成纖維細(xì)胞生長因子標(biāo)記蛋白的表達(dá)[11]。丹酚酸B可增加心肌組織VEGF、Nrf2和HO-1的表達(dá)促進(jìn)大鼠缺血心肌血管再生[12]。丹參酮ⅡA可通過VEGF信號(hào)通路在缺血性斑馬魚模型中發(fā)揮促血管新生和血管保護(hù)作用[13]。雷氏丹參片采取水、醇雙提取工藝,提取其水溶性的丹參酚酸類和脂溶性的丹參酮類成分, 在臨床冠心病心絞痛患者的治療中具有顯著療效[14]，張春伶等[15]系統(tǒng)分析聯(lián)合雷氏丹參片治療冠心病安全有效, 且具有調(diào)節(jié)血脂的作用，但是關(guān)于雷氏丹參片治療冠心病的具體作用機(jī)制的研究仍較缺乏。

本實(shí)驗(yàn)以中醫(yī)理論為指導(dǎo),研究雷氏丹參片在斑馬魚模型上的促血管新生作用及其作用機(jī)制,發(fā)現(xiàn)雷氏丹參片質(zhì)量濃度在100 μg/mL及100 μg/mL以下是安全可靠的；雷氏丹參片可以促進(jìn)斑馬魚腸下血管的生長,斑馬魚腸下血管的出芽數(shù)和直徑均增加,具有促進(jìn)血管新生的作用,不管是新生毛細(xì)血管的數(shù)量還是管腔直徑均增加；在藥物抑制血管生長模型中,加入雷氏丹參片后斑馬魚腸下血管交叉點(diǎn)的數(shù)量增加；對(duì)于斑馬魚節(jié)間血管生成不足的模型,給予不同質(zhì)量濃度丹參片,均能夠促進(jìn)斑馬魚節(jié)間血管的生長。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在一定條件下,雷氏丹參片對(duì)受損血管具有修復(fù)與保護(hù)作用。對(duì)斑馬魚體內(nèi)VEGF受體檢測結(jié)果顯示,雷氏丹參片組和VRI+雷氏丹參片組均表現(xiàn)了對(duì)flt1、kdr、kdrl的促表達(dá)作用,說明雷氏丹參片促血管新生作用,可能與干預(yù)VEGF/VEGFR信號(hào)通路有關(guān)。