韓玲麗 卜華琴 劉璐瑤 曾玉媛 姚海麗 王曉川 孫金嶠

T、B細(xì)胞在過(guò)敏性疾病的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。其中Th1/Th2失衡是目前公認(rèn)并研究較為深入的調(diào)控食物過(guò)敏的機(jī)制，Th2細(xì)胞在過(guò)敏性疾病的發(fā)生中起啟動(dòng)作用，可分泌IL-4、IL-9等細(xì)胞因子，促進(jìn)B細(xì)胞分化為漿母細(xì)胞并發(fā)生類別轉(zhuǎn)換產(chǎn)生IgE抗體，而IgE抗體可促使嗜堿性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞表面FcεRI交聯(lián)，使得胞內(nèi)產(chǎn)生組胺等炎癥介質(zhì)產(chǎn)生，促進(jìn)過(guò)敏的發(fā)生[1-3]。而近年來(lái)發(fā)現(xiàn)IgE+長(zhǎng)壽漿細(xì)胞和記憶B 細(xì)胞的存在可能是過(guò)敏性疾病持續(xù)甚至延續(xù)終生的主要原因[4-6]。盡管T、B細(xì)胞在過(guò)敏性疾病中的機(jī)制研究較為深入，但關(guān)于過(guò)敏兒童淋巴細(xì)胞精細(xì)分型特征研究較少。本研究對(duì)過(guò)敏兒童和正常健康兒童行T/B淋巴細(xì)胞檢測(cè)并做精細(xì)分型，期望對(duì)臨床診斷過(guò)敏性疾病提供新的標(biāo)志物。

1 方法

1.1 過(guò)敏性疾病組納入標(biāo)準(zhǔn) 納入2021年3～11月于復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院(我院)臨床免疫科就診的過(guò)敏性疾病(食物過(guò)敏或呼吸道過(guò)敏)，且年齡>28 d的患兒。食物過(guò)敏：有明確的某項(xiàng)食物攝入后過(guò)敏反應(yīng)病史，回避過(guò)敏原癥狀緩解，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室檢查(嗜酸性粒細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)、總IgE及血清特異性IgE檢測(cè))確診；呼吸道過(guò)敏：呼吸道過(guò)敏癥狀(如咳嗽、鼻癢、喘息等)，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室檢查(嗜酸性粒細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)、總IgE及血清特異性IgE檢測(cè))確診。

1.2 健康對(duì)照組納入和排除標(biāo)準(zhǔn) ①與過(guò)敏性疾病組同時(shí)期在我院體檢正常且年齡>28 d兒童；②性別和年齡與過(guò)敏性疾病組匹配；③排除有過(guò)敏疾病史和其他疾病史。

1.3 淋巴細(xì)胞精細(xì)分型檢測(cè)

1.3.1 外周血單個(gè)核細(xì)胞分離 1 mL新鮮外周血與等體積磷酸鹽緩沖液(PBS)在15 mL離心管中混勻，緩慢將1 mL ficoll加入管底，2 000 rpm離心20 min。取中間白膜層至新的離心管，加入10 mL PBS洗去ficoll，1 mL PBS重懸，計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，分別取5×105個(gè)細(xì)胞用于T/B細(xì)胞流式染色。

1.3.2 T和B淋巴細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 5×105個(gè)外周血單個(gè)核細(xì)胞標(biāo)記抗體(PerCP5.5 anti-human CD3, FITC anti-human CD4, PE-Cy7 anti-human-CD45RA, PE anti-human-CCR6, APCanti-human-CCR4, Brilliant Violet 421TManti-human-CXCR3 Biolegend)，用于檢測(cè)Th1(T helper 1 cells CD3+CD4+CD45RA-CCR6-CCR4-CXCR3+)和Th2 (T helper 2 cells CD3+CD4+CD45RA-CCR6-CCR4+CXCR3-)。

另取5×105個(gè)外周血單個(gè)核細(xì)胞標(biāo)記抗體(Brilliant Violet 605TManti-human CD19，PE/Cyanine7 anti-human CD21，F(xiàn)ITC anti-human CD38， Brilliant Violet 421TManti-human CD27，PerCP/Cyanine5.5 anti-human IgM，Brilliant Violet 510TManti-human IgD，APC anti-human IgE Biolegend)用于檢測(cè)成熟B細(xì)胞(CD19+CD21+)。IgE+漿母細(xì)胞(CD19+CD21+CD38highIgM-IgD-IgE+)和IgE+記憶B細(xì)胞(CD19+CD21+CD38dimIgD-IgM-IgE+CD27-和CD19+CD21+CD38dimIgD-IgM-IgE+CD27+)。

用BECKMAN CytoFLEX Quanta收集4×104～2×105個(gè)細(xì)胞，流式結(jié)果用FlowJo_V10分析。

1.4 其他實(shí)驗(yàn)室檢查 全自動(dòng)血液分析儀檢測(cè)嗜酸性粒細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)、UniCAP診斷系統(tǒng)檢測(cè)外周血總IgE濃度、ImunnoCAP(Thermo Phadia 250)診斷系統(tǒng)檢測(cè)血清特異性IgE濃度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)結(jié)果采用Graphpad Prism統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以xˉ±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 符合本文納入和排除標(biāo)準(zhǔn)的過(guò)敏性疾病患兒30例，男19例，女11例，平均年齡3.6(0.7～10.6)歲，總IgE 631.9(23.9～3 043.2) kU·L-1，嗜酸性粒細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)(548.9 ± 57.7)個(gè)/μL。健康對(duì)照組27名，男19名，女8名，平均年齡4.1 (0.8～11) 歲，嗜酸性粒細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)(110.8±18.9)個(gè)/μL。兩組年齡、性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P分別為0.616和0.574)。

2.2 過(guò)敏性疾病組兒童臨床表現(xiàn) 食物過(guò)敏16例，男10例，女6例，主要臨床表現(xiàn)為濕疹和特應(yīng)性皮炎；過(guò)敏原：雞蛋81.3%，牛奶58.8%，花生31.3%，小麥25.0%，大豆12.5%，芝麻6.2%。呼吸道過(guò)敏14例，男9例，女5例，主要臨床表現(xiàn)為過(guò)敏性咳嗽、過(guò)敏性鼻炎和哮喘；過(guò)敏原：塵螨92.3%，真菌23.1%，動(dòng)物皮屑15.4%。

2.3 T淋巴細(xì)胞亞群 圖1和表1顯示，過(guò)敏性疾病組與健康對(duì)照組CD3 T細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)、CD4 T細(xì)胞比例、CD4 T細(xì)胞絕對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)、Th1細(xì)胞比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，過(guò)敏性疾病組Th2細(xì)胞占效應(yīng)輔助T細(xì)胞比例和Th2/Th1比值高于健康對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 B淋巴細(xì)胞亞群 表1和圖2顯示，過(guò)敏性疾病組成熟B細(xì)胞比例及絕對(duì)計(jì)數(shù)、漿母細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)、IgE+漿母細(xì)胞比例、IgE+記憶B細(xì)胞比例高于健康對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 過(guò)敏性疾病兒童和健康對(duì)照兒童淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)情況比較

3 討論

近幾十年來(lái)，過(guò)敏性疾病的發(fā)生率日益增長(zhǎng)，已經(jīng)成為全球關(guān)注的焦點(diǎn)問(wèn)題[7-10]。IgE介導(dǎo)是過(guò)敏性疾病發(fā)生的主要機(jī)制，而IgE的產(chǎn)生依賴于發(fā)生類別轉(zhuǎn)換后的漿母細(xì)胞，IgE+記憶B細(xì)胞可增殖分化不斷補(bǔ)充生成新的IgE+漿母細(xì)胞，這或?yàn)檫^(guò)敏性疾病持續(xù)終生的主要原因[4, 5, 11, 12]。臨床上，過(guò)敏性疾病的診斷缺乏明確的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，主要依賴于病史，而過(guò)敏緩解期，在無(wú)過(guò)敏原刺激情況下，患者無(wú)臨床癥狀，診斷更加困難。因此，本研究比較分析了過(guò)敏兒童淋巴細(xì)胞亞群特征，為輔助診斷過(guò)敏提供新的標(biāo)志物依據(jù)。

本研究共納入30例過(guò)敏兒童和27名健康對(duì)照兒童。T細(xì)胞流式精細(xì)分型結(jié)果發(fā)現(xiàn)盡管總T細(xì)胞、CD4輔助性T細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)過(guò)敏兒童和健康對(duì)照差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，然而過(guò)敏兒童Th2細(xì)胞占效應(yīng)輔助性T細(xì)胞比例均較對(duì)照明顯增高，且Th2/Th1比值過(guò)敏兒童也明顯高于健康對(duì)照，表明過(guò)敏兒童體內(nèi)存在Th2極化。而B(niǎo)淋巴細(xì)胞精細(xì)分型比較發(fā)現(xiàn)，過(guò)敏兒童成熟B細(xì)胞比例、成熟B細(xì)胞和漿母細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)均高于健康對(duì)照，IgE+漿母細(xì)胞和IgE+記憶B細(xì)胞比例較對(duì)照也明顯增高，上述結(jié)果表明過(guò)敏兒童T、B淋巴細(xì)胞精細(xì)分型與健康對(duì)照存在明顯差異。盡管本研究樣本量偏少，但對(duì)臨床診斷過(guò)敏性疾病的診斷及鑒別診斷仍有部分提示意義，豐富了過(guò)敏兒童T、B淋巴細(xì)胞表型。

目前研究認(rèn)為嬰幼兒期起始的食物過(guò)敏和后續(xù)可以持續(xù)終生的呼吸道過(guò)敏如過(guò)敏性鼻炎、哮喘等被認(rèn)為是一個(gè)“過(guò)敏接力”過(guò)程[7, 8, 13]。盡管Th1/Th2失衡機(jī)制可解釋大多數(shù)過(guò)敏性疾病的發(fā)生發(fā)展，然而卻無(wú)法解釋早期的食物過(guò)敏為何會(huì)發(fā)生過(guò)敏原耐受和過(guò)渡到呼吸道過(guò)敏兩種不同的臨床轉(zhuǎn)歸。而IgE+漿母細(xì)胞和IgE+記憶B 細(xì)胞的長(zhǎng)期存在或可解釋食物過(guò)敏為何會(huì)進(jìn)展到后續(xù)的呼吸道過(guò)敏?；贗gE+漿母細(xì)胞和IgE+記憶B細(xì)胞一旦產(chǎn)生，在體內(nèi)可長(zhǎng)期穩(wěn)定存活，在過(guò)敏緩解期無(wú)過(guò)敏原刺激情況下IgE+漿母細(xì)胞和IgE+記憶B細(xì)胞也長(zhǎng)期穩(wěn)定存在于體內(nèi)，故推測(cè)IgE+漿母細(xì)胞和記憶B細(xì)胞或許可以作為過(guò)敏緩解期的診斷指標(biāo)。

綜上所述，過(guò)敏兒童和健康對(duì)照淋巴細(xì)胞精細(xì)分型比較結(jié)果表明過(guò)敏兒童存在Th2細(xì)胞比例增高和特異性的IgE+漿母細(xì)胞和IgE+記憶B細(xì)胞比例增加，可作為輔助診斷過(guò)敏性疾病的標(biāo)志物。IgE+漿母細(xì)胞和IgE+記憶B細(xì)胞可以輔助過(guò)敏緩解期過(guò)敏性疾病的診斷。