李航婷，金明月，李諾營，莫奕雯，田 靜，楊最素

（浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 舟山 316022）

皮膚是人體最大的感覺器官，工作中容易受到意外損傷，在傷口愈合時(shí)，需要上皮組織的再生、肉芽組織的形成、瘢痕組織生成等的復(fù)雜組合，膠原蛋白的沉積和血管形成是創(chuàng)傷愈合的關(guān)鍵。傳統(tǒng)傷口敷料主要是使用脫脂棉紗布等天然纖維材料，使傷口干燥及物理隔離功能等，但換藥時(shí)容易撕拉傷口，引起再出血等不利于愈合［1］。近年來，海洋膠原蛋白、殼聚糖、海藻酸鹽的開發(fā)及用于傷口敷料的研究日益增多，而三者復(fù)合后制備的水凝膠更是被廣大學(xué)者所重視。海洋膠原蛋白具有低免疫性、高組織相容性、可降解性及創(chuàng)面止血等多種生物學(xué)性質(zhì)；而殼聚糖是一種天然的正電荷的高分子多糖，具有良好的抗菌、防黏連、促愈合等功效；海藻酸鹽具有高吸水性、成膠性、止血性，與Ca2+交聯(lián)形成海藻酸鈉水凝膠，具有良好的生物相容性和較低的細(xì)胞毒性，可為傷口提供恒溫恒濕的理想環(huán)境［2］。

鰻魚（Anguillidae）肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)價(jià)值高，除日常鮮食外，常被加工成鰻魚干、烤鰻魚片等，在加工過程中會產(chǎn)生大量的加工副產(chǎn)物。其中魚鰾除被少量食用外，大量魚鰾以廢棄物丟棄，浪費(fèi)了資源，也污染了環(huán)境。研究表明，魚鰾中含有大量的膠原蛋白［3］，因此可提取鰻魚膠原蛋白制備具有高附加值的產(chǎn)品。濕潤、透氣、抗菌的微環(huán)境能促進(jìn)細(xì)胞的增殖與遷移，有利于皮膚傷口的愈合［4］。本試驗(yàn)以鰻魚魚鰾膠原蛋白為主藥，與Ca2+分別交聯(lián)的殼聚糖和海藻酸鈉為配料制備水凝膠，探討其對小鼠皮膚傷口的愈合作用，為鰻魚魚鰾的高附加值利用和傷口敷料開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 BSA124S 型電子天平（Sartorius AG 公司）；RLPHR 1-4LD 型冷凍干燥機(jī)（德國Christ 公司）；SEM3000S 型掃描電子顯微鏡（國儀量子技術(shù)有限公司）；CX31 型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus 公司）；SpectraMax M2 型多功能酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices 公司）。

1.1.2 藥品與試劑 新鮮鰻魚魚鰾（舟山市某菜場）；魚鰾膠原蛋白（浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院自制）；卡波姆（上海麥克林生化科技有限公司）；海藻酸鈉（上海生工股份有限公司）、殼聚糖（濟(jì)南海得貝海洋生物工程有限公司）；蘇木素-伊紅（HE）染液、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MAD）、過氧化氫酶（CAT）、總抗氧化力（T-AOC）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；白介素-6（IL-6）、白介素-1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒（武漢伊萊瑞特有限公司）。

1.1.3 動(dòng)物 ICR 雄性健康小鼠，體重22～24 g，購自浙江省杭州子源實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司（許可證號SCXK（浙）2019-0004），飼養(yǎng)于浙江海洋大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房（許可證號：SYXK（浙）2019-0031）。

1.2 方法

1.2.1 鰻魚魚鰾膠原蛋白的提取 新鮮鰻魚魚鰾預(yù)處理后，脫脂，酸法提取條件為乙酸濃度0.5 mol/L、料液比（g/mL）1∶55，酸解處理20 h，透析后冷凍干燥即得酸溶性Ⅰ型膠原蛋白，置于-20 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 水凝膠的制備

1）凝膠液制備。魚鰾膠原蛋白0.20 g、卡波姆、海藻酸鈉、甘油，蒸餾水30 mL。0.60 g 海藻酸鈉加入蒸餾水室溫溶脹過夜，0.15 g 卡波姆加入蒸餾水和0.50 g 甘油加熱溶脹過夜，將所有物質(zhì)在常溫混勻后置于4 ℃中2 h 脫泡處理，即得凝膠液。

2）交聯(lián)液制備。制備0.05 mol/L 的CaCl2溶液和0.01 g/mL 的殼聚糖溶液，將兩種溶液1∶1 混合均勻，即得交聯(lián)液，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

3）水凝膠交聯(lián)。將凝膠液倒入培養(yǎng)皿，均勻平鋪薄層即可，放入4 ℃冷存2 h 后取出，將交聯(lián)劑溶液倒入模具中，使之充分交聯(lián)后，即得魚鰾膠原蛋白-殼聚糖-海藻酸鈉水凝膠。取出水凝膠片，用蒸餾水沖洗干凈后備用。

1.2.3 水凝膠掃描電鏡檢測 將水凝膠樣品冷凍干燥后切割成7 mm 的直徑大小，在20 kV 加速電壓下，濺射鍍金250 s 后，在掃描電鏡下觀察其超微結(jié)構(gòu)。使用Image J 和Origin Pro 2021 軟件（Origin Lab），每張圖像分析20 個(gè)隨機(jī)點(diǎn)，統(tǒng)計(jì)毛孔的平均直徑。

1.2.4 皮膚傷口愈合

1）皮膚傷口制作。24 只雄性ICR 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為兩組即對照組和水凝膠組。各組小鼠應(yīng)用4%的水合氯醛麻醉，剃去背毛，常規(guī)皮膚消毒，用無菌外科剪刀剪出1 cm 直徑的傷口區(qū)域。對照組傷口區(qū)域僅用0.9%生理鹽水處理，水凝膠組用水凝膠完全覆蓋，水凝膠在使用前用紫外線照射滅菌。試驗(yàn)3、7 和14 d 時(shí)觀察傷口狀態(tài)并拍照，使用Image J 軟件計(jì)算傷口面積，傷口愈合率=（初始傷口面積-特定一天傷口面積）/初始傷口面積×100%。

2）血清抗氧化水平檢測。試驗(yàn)3、7 和14 d，處死每組小鼠前進(jìn)行摘眼球取血，4 ℃下5 000 r/min 離心5 min 收集血清，使用試劑盒說明書檢測MAD 含量和CAT、SOD、T-AOC、GSH-Px 活性。

3）血清炎癥因子檢測。利用試劑盒檢測IL-6、IL-1β 及TNF-α 含量。

4）皮膚HE 染色。試驗(yàn)3、7 和14 d 時(shí)，處死小鼠后小心取下傷口區(qū)域皮膚，4%多聚甲醛固定24 h 后石蠟包埋，切片、脫蠟、水化、HE 染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察皮膚傷口的組織學(xué)結(jié)構(gòu)。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)用x±S表示，組間比較采用單因素方差分析t檢驗(yàn)，以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 水凝膠掃描電鏡

水凝膠掃描電鏡觀察如圖1 所示，水凝膠上具有高度互連多孔的結(jié)構(gòu)，水凝膠分子之間相互交聯(lián)，形成連續(xù)密集的小孔，孔徑在1～175 μm 間，水凝膠的孔隙率為（84.00±5.46）%。

圖1 水凝膠的掃描電鏡結(jié)構(gòu)

2.2 小鼠傷口愈合情況

小鼠皮膚傷口愈合如圖2A 所示，試驗(yàn)3 d 時(shí)對照組皮膚傷口的紅腫、炎癥情況較為嚴(yán)重，水凝膠組的炎癥情況較為輕微并傷口開始縮小。試驗(yàn)7 d 時(shí)對照組的傷口炎癥有所減輕，傷口開始縮小，而水凝膠組的傷口明顯縮小，炎癥反應(yīng)消失。試驗(yàn)14 d 后兩組小鼠傷口均顯示趨向愈合狀態(tài)，傷口周圍有細(xì)小的毛發(fā)長出，但對照組尚未完全愈合，且皮膚疤痕比水凝膠組的明顯。傷口愈合率結(jié)果如圖2B 所示，水凝膠組傷口愈合率明顯高于對照組。

圖2 小鼠傷口及傷口愈合率比較

2.3 血清抗氧化水平檢測結(jié)果

血清中5 個(gè)抗氧化指標(biāo)的檢測結(jié)果如圖3 所示。試驗(yàn)第3 天兩組小鼠的SOD、GSH-Px、CAT 和TAOC 4 個(gè)抗氧化指標(biāo)最低。隨著試驗(yàn)時(shí)間的延長，抗氧化水平逐漸提高，特別到第14 天時(shí)，水凝膠組抗氧化水平上升幅度更大，相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而MDA 含量，對照組第3 天時(shí)均較高，第7 天時(shí)水凝膠組下降明顯。

圖3 小鼠血清抗氧化活性檢測

2.4 血清炎癥因子檢測結(jié)果

血清中炎癥因子的檢測結(jié)果如圖4 所示。對照組IL-1β 在試驗(yàn)第3 天時(shí)較高，隨后逐漸下降；而水凝膠組的3 個(gè)時(shí)間段均低于對照組。對照組和水凝膠組IL-6 水平相差較大，后期均有不同程度的下降。TNF-α 水平在試驗(yàn)第3 天時(shí)對照組稍高于水凝膠組，在第7 天、第14 天時(shí)顯著低于對照組。

圖4 小鼠血清炎癥因子的檢測

2.5 皮膚切口HE 染色結(jié)果

皮膚切口HE 染色結(jié)果如圖5 所示。試驗(yàn)第3天時(shí)2 組皮膚切口最上方都有染成紅色的滲出物，對照組真皮及與皮下組織交界處的炎癥細(xì)胞浸潤更多。第7 天時(shí)對照組切口表面形成1～2 層的表皮細(xì)胞，真皮內(nèi)有肉芽組織形成。水凝膠組已形成2～3層的表皮細(xì)胞，真皮內(nèi)有肉芽組織形成；可見新生的皮脂腺、汗腺及導(dǎo)管。第14 天對照組切口表面形成2～3 層的表皮細(xì)胞，真皮內(nèi)有大量的膠原纖維、少量的皮脂腺，汗腺及導(dǎo)管已形成。水凝膠組第14 天切口處已形成復(fù)層扁平上皮，可見基底層、棘層、顆粒層、透明層及少量的角質(zhì)層，真皮與表皮間有明顯的乳頭層，網(wǎng)狀層結(jié)構(gòu)致密，皮脂腺、汗腺及導(dǎo)管明顯增多。

圖5 皮膚切口HE 染色結(jié)果（×200）

3 小結(jié)與討論

隨著海洋生物醫(yī)藥的發(fā)展，以海藻酸鹽膜為基底膜，配以膠原蛋白和殼聚糖混合后制備的復(fù)合敷料已有報(bào)導(dǎo)，但所選取的膠原蛋白多來源于魚皮或魚鱗，前期處理比較麻煩［5，6］。已有報(bào)導(dǎo)從日本黃姑魚魚鰾中提取的膠原蛋白具有較好的抗氧化活性，減少出血與滲出，可促進(jìn)皮膚傷口的愈合［7］，但有關(guān)以鰻魚魚鰾膠原蛋白為主藥復(fù)合材料制備的傷口敷料目前尚未見報(bào)導(dǎo)。

水凝膠敷料是一種新型的創(chuàng)傷敷料，是將水溶性的高分子材料或其單體經(jīng)加工處理后，形成具有三重網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)且不溶于水的膠狀物質(zhì)，而孔隙率和孔隙結(jié)構(gòu)是設(shè)計(jì)水凝膠劑型的關(guān)鍵因素［8］。為檢測制備的水凝膠結(jié)構(gòu)，通過掃描電鏡技術(shù)觀察制備的水凝膠是具有多孔隙的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，多孔的水凝膠有利于細(xì)胞的附著、增殖和遷移，利于新生皮膚組織的生長，因此本試驗(yàn)制備的水凝膠材料是促進(jìn)傷口愈合使用的理想材料。

在傷口愈合炎癥階段，炎癥細(xì)胞產(chǎn)生大量ROS［9，10］。過量的ROS 會導(dǎo)致細(xì)胞死亡和壞死，不利于傷口愈合，判斷氧化應(yīng)激反應(yīng)及清除自由基能力可檢測血液中的抗氧化指標(biāo)。隨著試驗(yàn)時(shí)間的延長，水凝膠組中SOD、GSH-Px、CAT 和T-AOC 的活性比對照組的更高；而MDA 是主要的脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物，卻隨著時(shí)間的延長而含量逐漸降低，表明水凝膠能較好地清除體內(nèi)自由基，增加過氧化物酶的活性，提高血清總抗氧化能力，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)。

皮膚創(chuàng)面愈合中伴隨著炎癥反應(yīng)，是創(chuàng)面修復(fù)的起始環(huán)節(jié)，如何促進(jìn)創(chuàng)傷愈合、減輕炎癥反應(yīng)是醫(yī)藥界需要解決的難題［11］，也是傷口敷料是否合格的標(biāo)志。研究表明，IL-1β、IL-6 和TNF-α 具有介導(dǎo)炎癥反應(yīng)發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)特性［7］，檢測血清中炎癥因子的變化可判斷炎癥的進(jìn)展情況。結(jié)果表明，水凝膠組3 個(gè)炎癥因子指標(biāo)均低于對照組，隨著時(shí)間的延長均有下降趨勢，特別是TNF-α 下降幅度最大，二者的差異更明顯，因此認(rèn)為水凝膠可降低炎癥反應(yīng)，促進(jìn)皮膚傷口的愈合。傷口敷料是否有利于皮膚損傷后的修復(fù)，需要從組織形態(tài)學(xué)上進(jìn)行觀察。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，水凝膠組的皮膚傷口炎癥、滲出明顯減輕，肉芽組織的形成、表皮、真皮及附屬器官的再生明顯早于對照組，表明制備的水凝膠能減輕傷口的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)皮膚再生，有利于傷口的修復(fù)。

本試驗(yàn)應(yīng)用酸法制備的鰻魚魚鰾膠原蛋白，復(fù)合殼聚糖-海藻酸鈉交聯(lián)后獲得的水凝膠是個(gè)多孔隙結(jié)構(gòu)，可為傷口修復(fù)提供濕潤的接觸環(huán)境，并吸收創(chuàng)口中的滲出液、防止二次損傷等優(yōu)點(diǎn)，水凝膠能提高抗氧化能力，降低血清中的炎癥因子，促進(jìn)小鼠皮膚傷口愈合，是一種具有開發(fā)潛力的傷口敷料。