謝 明，李國攀，胡基雄，張志翔，艾笑揚，陳帝斯，李 楊，尹俊翔，榮 俊

（長江大學生命科學學院，湖北 荊州 434020）

腺病毒根據(jù)宿主范圍可分為哺乳動物腺病毒屬和禽腺病毒屬，禽腺病毒根據(jù)抗原性可分為3 個亞群（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ亞群），Ⅰ群已經(jīng)鑒定了5 個禽腺病毒種（A 種-E 種），根據(jù)交叉中和試驗分為12 個血清型（1-7 和8a、8b、9-11）［1］。禽腺病毒血清4 型（Fowl Adenovirus serotype 4，F(xiàn)AdV-4）屬于Ⅰ群C 種血清型4［2］。流行病學研究表明，雞群主要FAdV 流行毒株之一為高致病性血清4 型禽腺病毒（Fowl adenovirus serotype 4，F(xiàn)AdV-4），該病主要發(fā)生于3～5 周齡雛雞，以肝炎-心包積液綜合征（HHS）為主，并伴隨著包涵體肝炎等臨床癥狀［3］，不僅能通過垂直傳播傳給下一代，也可通過呼吸道消化道黏膜排出的分泌物在雞群間水平傳播［4］，死亡率30%～80%［5］，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失［6］。

FAdV 是二十面體無囊膜的雙鏈DNA 病毒，衣殼蛋白由Penton、Hexon 和Fiber 3 種主要蛋白構(gòu)成［7］。研究表明，F(xiàn)iber 蛋白的羧基端頭部區(qū)域是特異性受體結(jié)合位點，也是病毒早期吸附宿主細胞的必需位點，具有抗原性，可影響病毒毒力［8］；此外FAdV-4 的兩條Fiber 蛋白（Fiber-1 和Fiber-2）長度差異顯著，表明重組Fiber-2 蛋白不僅比Fiber-1 蛋白活性更好，對FAdV-4 的保護作用更強［9］，而且Fiber2 蛋白還具有型和亞群特異性抗原決定簇［10］，可誘導機體產(chǎn)生主要的型特異性中和抗體［11］。因此Fiber-2 蛋白是目前被公認為FAdV-4 的一種重要保護性抗原，能夠誘導中和抗體，是疫苗研制和疾病防控的主要研究方向之一。

目前，國內(nèi)還未有批準上市的亞單位疫苗，對該病的防控主要采用禽腺病毒滅活疫苗較多［12］，但全病毒滅活苗需要借助雞胚或細胞繁殖病毒，生產(chǎn)成本較高，且活毒操作存在一定的生物安全隱患，重組亞單位疫苗因其具有安全、高效等特點，從而具有更加良好的開發(fā)和應用前景［13］。而評價疫苗免疫效果的有效方法一般是監(jiān)測其抗體水平［14］，建立能夠反映疫苗免疫后雞群抗體水平變化趨勢的監(jiān)測手段對該病的防控具有重要意義［15］。目前常用的禽腺病毒診斷技術(shù)有病毒分離、中和試驗、瓊脂擴散試驗、PCR 和ELISA 等［16］，而ELISA 相比于其他檢測方法具有靈敏度高、特異性強、樣本處理簡單和通量大等優(yōu)點，是目前最受青睞的檢測技術(shù)之一［17］。其中單克隆抗體由于其特異性強、交叉反應少等優(yōu)點被廣泛運用于檢測抗原抗體的ELISA 試劑盒中［18］。

本研究利用原核系統(tǒng)表達重組FAdV-4 Fiber2蛋白，免疫小鼠并制備針對Fiber2 蛋白的單克隆抗體，旨在為禽腺病毒4 型的早期診斷和疫苗的評估提供參考，為檢測試劑盒的商品化研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

FAdV-4C Fiber2 的原核表達載體為課題組前期構(gòu)建、保存；Ni-NTA 樹脂親合層析柱購自上海七海復泰生物科技有限公司；6×His Tag Mouse Monoclonal antibody 購自美國Proteintech 公司；HRP 標記的羊抗小鼠IgG 購自美國Jackson 公司；ECL 化學發(fā)光超敏顯色試劑盒購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；高結(jié)合力酶標板購自無錫耐思生命科技股份有限公司；SPF 級BALB/c 小鼠由實驗室引種自繁；弗氏完全佐劑與弗氏不完全佐劑購自北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司；淋巴細胞分離液購自北京達科為生物技術(shù)有限公司；PEG-1450 購自北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司；RPMI 1640、HAT（次黃嘌呤鈉、氨基蝶呤和胸苷混合液）、HT（次黃嘌呤鈉和胸苷混合液）、FBS（胎牛血清）等細胞培養(yǎng)基中所需溶液均購自格來賽生命科技（上海）有限公司；FITC 標記的羊抗小鼠IgG 熒光二抗購自北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 重組FAdV-4 Fiber2 將誘導表達后的菌體用PBS 溶液（0.05 mmol/L，pH 7.4，下同）緩沖液按照1∶10（m∶V）充分重懸，用超聲破碎處理后8 000 r/min離心10 min 收集上清。用0.22 μm 濾膜過濾上清，獲得預處理后的蛋白液。用Ni-NTA 樹脂親合層析柱純化，PBS 溶液作為緩沖液，用含50 mmol/L 咪唑的PBS 溶液洗脫目的蛋白；用SDS-PAGE 電泳對純化后的蛋白進行測定。

1.2.2 Western blot 鑒定 對純化后的目的蛋白進行SDS-PAGE 凝膠電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至NC 纖維膜上，用含5%脫脂奶粉的PBS 溶液作為封閉液在37 ℃孵育1 h；6×His Tag Mouse Monoclonal antibody作為一抗（1∶10 000），37 ℃中孵育1 h；用1×PBST 溶液（含0.05%Tween-20 的PBS 溶液，下同）清洗5 次，5 min/次；HRP 標記的羊抗小鼠IgG 作為二抗（1∶20 000），37 ℃中孵育1 h；用1×PBST 溶液清洗5 次，5 min/次。用ECL 化學發(fā)光超敏顯色試劑盒進行顯色處理，并用凝膠成像儀進行化學發(fā)光成像并拍照分析。

1.2.3 間接ELISA 方法的建立 用碳酸緩沖液（0.05 mol/L，pH 9.5）將純化的FAdV-4 Fiber2 蛋白稀釋至5 μg/mL，混合均勻后按100 μL/孔加入酶標板中，在25 ℃中孵育5 h；棄去板中液體并拍干，按200 μL/孔加入封閉液，在37 ℃中封閉2 h；棄去板中液體并拍干備用。以按照100 μL/孔的劑量加入稀釋后的一抗樣品，同時設(shè)置陰性對照，在37 ℃恒溫箱中孵育30 min；棄去板中液體并用1×PBST 溶液洗板；用HRP 標記的羊抗小鼠IgG 作二抗（1∶10 000），100 μL/孔，并在37 ℃中孵育30 min；棄去板中液體并用1×PBST 溶液洗板；加入顯色液100 μL/孔，在37 ℃中避光孵育10 min 后加入終止液（2 mmol/L H2SO4），100 μL/孔；測定各孔在波長450 nm 處的OD值。當陰性對照的OD值＜0.2 時，試驗成立；當S/N（待檢樣品OD值/陰性對照OD值）≥2.1 時，判定為陽性；當S/N＜1.6 時，判定為陰性；2.1＞S/N≥1.6 為可疑；在測定效價時，將S/N值等于2.1 時所對應的稀釋倍數(shù)定為其效價。

1.2.4 小鼠免疫 選用3 只4～6 周齡BALB/c 小鼠，將純化后的FAdV-4 Fiber2 蛋白稀釋至100 μg/mL并與弗氏完全佐劑等體積混合并充分乳化，按照200 μL/只腹腔注射；一免后第14 天，將目的蛋白與弗氏不完全佐劑等體積乳化后二次腹腔注射免疫小鼠；第28 天按相同劑量加強免疫。于加強免疫后第3 天采血檢測血清抗體效價，選擇抗體效價高于105的小鼠進行細胞融合。

1.2.5 雜交瘤細胞的篩選及亞克隆

1）細胞融合。3 次免疫后的BALB/c 小鼠采血后頸椎脫臼法處死，無菌取脾臟，研磨制成單細胞懸液，70 μm 細胞篩網(wǎng)過濾后，用淋巴細胞分離液分離淋巴細胞，并用RPMI1640將細胞稀釋成1×108個/mL，在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)備用。取培養(yǎng)至對數(shù)期的SP2/0 小鼠骨髓瘤細胞，稀釋為1×107個/mL，與脾臟淋巴細胞按照1∶10 的體積混合于25 mL 無血清培養(yǎng)基中，400 r/min 離心10 min 后棄去上清。輕拍管底打散沉淀，將離心管于37 ℃水浴中保溫至融合開始。在1 min 內(nèi)勻速加入37 ℃1 mL PEG-1450 溶液，期間不停攪拌，37 ℃水浴90 s，每隔2 min 分別加入37 ℃1、3、10 mL 不完全培養(yǎng)液，終止PEG 作用，并在37 ℃水浴中孵育5 min，300 r/min 離心5～10 min，棄 去 上 清。用1×HAT 培 養(yǎng) 基（RPMI1640+20%FBS+1×HAT+谷氨酰胺+丙酮酸鈉）將沉淀細胞重懸，并接種于96 孔板中，每孔200 μL，將培養(yǎng)板放入37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2）雜交瘤細胞的篩選及亞克隆。當細胞長至孔底面積約50%時，取100 μL 上清用“1.2.3”中間接ELISA 方法檢測。選擇OD值大于1.0 的孔，采用有限稀釋法進行3 次亞克隆，并換用1×HT 培養(yǎng)液（RPMI1640+20%FBS+1×HT+谷氨酰胺+丙酮酸鈉）培養(yǎng)，直至單克隆孔的細胞上清檢測陽性率為100%，即獲得穩(wěn)定、可分泌單抗且增殖的細胞株。

1）腹水的制備及效價測定。取4～6周齡的BALB/c雌性小鼠，腹腔注射腹水制備用佐劑0.5 mL/只；第15 天，每只小鼠腹腔注射1 mL 雜交瘤細胞（1×106～5×106個/mL）；第22～25 天，小鼠腹部明顯膨脹后抽取腹水，2 000 r/min 離心10 min 取上清液，倍比稀釋后用“1.2.3”間接ELISA 方法檢測，檢測結(jié)果為陽性的孔對應的最高稀釋度為腹水的抗體效價。

1.2.6 單克隆抗體的鑒定

1）Dot blot 斑點雜交。取攻毒FAdV-4 的雞肝組織，按照1∶10（m∶V）加入PBS 溶液研磨，4 000 r/min離心5 min 取上清；平行處理健康雞肝組織。在NC膜上依次點入2 μL 大腸桿菌裂解液、1 μL 純化的Fiber2 蛋白、1 μL 攻毒雞肝組織研磨液、1 μL 健康雞肝組織研磨液，放入37 ℃恒溫箱中干燥。待樣品吸收完全后，將NC 膜完全浸泡在含5%脫脂奶粉的PBST 溶液中，37 ℃封閉1 h；用1×PBST 溶液清洗5次，5 min/次；制備的單抗作為一抗（1∶10 000），37 ℃中孵育1 h；用1×PBST 溶液清洗5 次，5 min/次；HRP標記的羊抗小鼠IgG 作為二抗（1∶10 000），37 ℃中孵 育1 h；用1×PBST 溶液 清 洗5 次，5 min/次。用ECL 化學發(fā)光超敏顯色試劑盒進行顯色處理，并用凝膠成像儀成像并拍照分析結(jié)果。

英藏敦煌文獻指斯坦因（M.A.Stein）于1906—1908年第二次中亞考察和1913—1916年第三次中亞考察在莫高窟藏經(jīng)洞所獲敦煌文獻，起初分別收藏在大英博物館和設(shè)在倫敦的印度事務部圖書館；絹、紙繪畫則被當時的英印政府設(shè)在印度新德里的中亞古物博物館和大英博物館分割收藏。1973年，大英博物館圖書部與博物館分離，與印度事務部圖書館等合并建立了大英圖書館，原大英博物館和印度事務部圖書館收藏的敦煌文獻均被移交給大英圖書館收藏。

2）間接免疫熒光試驗鑒定。將雞肝癌細胞LMH 鋪于24 孔板中，待LMH 細胞生長至底部80%～90%后，用MOI 為0.01 的FAdV-4 病毒量進行感染，同時設(shè)立正常細胞為陰性對照。FAdV-4 感染24 h后，棄去細胞上清，用預冷的4%甲醛固定液在室溫下固定細胞20 min，并用PBS 溶液洗滌3 次；用0.1%TritonX-100 在室溫下通透細胞膜10 min，并PBS 溶液洗滌3 次；用含10%胎牛血清的PBS 溶液在室溫下封閉1 h，并用PBS 溶液洗滌3 次；將適當稀釋的小鼠IgG 和制備的抗FAdV-4 Fiber2 蛋白的單克隆抗體與固定的LMH 細胞在37 ℃中孵育1 h，PBS 溶液洗滌3 次，再加入FITC 標記的山羊抗小鼠IgG（1∶1 000），37 ℃避光孵育1 h 后用PBS 溶液洗3次；加入DAPI 染色試劑，室溫中避光孵育10 min，PBS 溶液洗3 次后用雙蒸水洗3 次；最后用封片劑封片后放置于熒光顯微鏡下觀察拍照并分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組FAdV-4 Fiber2 蛋白的純化與Western blot鑒定

將長江大學生命科學學院構(gòu)建表達的重組FAdV-4 Fiber2 蛋白進行鎳柱親和層析后SDSPAGE 電泳，結(jié)果如圖1A 所示。蛋白大小為28 ku，與預期大小相符，純度為95%，經(jīng)測量蛋白濃度為0.582 mg/mL。將純化的FAdV-4 Fiber2 蛋白進行Western blot鑒定，結(jié)果如圖1B 所示，純化的FAdV-4 Fiber2 蛋白能與His 單克隆抗體特異性結(jié)合，表明純化所得蛋白是構(gòu)建表達的重組FAdV-4 Fiber2蛋白。

圖1 重組蛋白純化及Western blot 鑒定

2.2 小鼠血清ELISA 效價測定

利用FAdV-4 Fiber2 蛋白免疫BALB/c 小鼠，將3 免后第3 天的小鼠經(jīng)尾靜脈取血后進行間接ELISA 方法檢測其抗體分泌水平，ELISA 檢測結(jié)果如圖2 所示。3 只免疫后的小鼠血清中所含F(xiàn)iber2 抗體水平較高，且血清稀釋至204 800 倍后OD450nm仍高于0.2，且S/N值大于2.1，即認為小鼠血清效價高于2×105。為提高融合成功率，便于后續(xù)陽性雜交瘤細胞株的篩選，選取效價最高的195 號小鼠進行細胞融合。

圖2 間接ELISA 檢測免疫小鼠血清中Fiber2 抗體

2.3 雜交瘤細胞的篩選及亞克隆

取96 孔中的雜交瘤細胞的上清100 μL，按照“1.2.4”的間接ELISA 方法檢測其在波長450 nm 處的OD值，選取OD值最高的孔中陽性細胞采用有限稀釋法進行亞克隆，經(jīng)過3 次亞克隆篩選后獲得10 株能穩(wěn)定分泌FAdV-4 Fiber2 蛋白單克隆抗體的陽性雜交瘤細胞，分別命名為1B5F1、1B5G11、1B5C1、1B5D2、1B5E3、1B5F3、1B5E4、1B5G4、1B5A8、1B5G8。10 株雜交瘤細胞經(jīng)間接ELISA 方法檢測其上清中所含抗體，結(jié)果如圖3 所示。10 株雜交瘤細胞的上清液在波長450 nm 處的OD值均大于1 且S/N值遠大于2.1，即成功篩選出10 株陽性雜交瘤細胞。該10 株細胞均能穩(wěn)定分泌單抗并且能穩(wěn)定傳代，傳代3 d 后即能鋪滿T25 瓶底50%以上；細胞株系在液氮凍存60 d 后復蘇，對其分泌抗體和傳代均無影響，表明該細胞株系的穩(wěn)定性較好。為保證所獲取的小鼠腹水的效價相對較高，選擇細胞上清中所含抗體水平最高的1B5F1 制備腹水。

圖3 間接ELISA 檢測雜交瘤細胞上清抗體

2.4 腹水的制備及效價測定

將所取的小鼠腹水離心取上清液后按照“1.2.4”間接ELISA 方法檢測其抗體含量并進行效價測定，根據(jù)GraphPad 曲線擬合結(jié)果如圖4 所示，當稀釋倍數(shù)為6.2×105倍時，S/N等于2.1 且其在波長450 nm處的OD值仍高于0.2，即認為所制備的腹水效價是6.2×105。

圖4 間接ELISA 檢測小鼠腹水效價

2.5 FAdV-4 Fiber2 蛋白單克隆抗體的鑒定

2.5.1 Dot blot 斑點雜交鑒定 間接ELISA 試驗中，純化的重組蛋白能與制備的單克隆抗體進行識別，表明制備的單克隆抗體具有特異性，但卻在Western blot 中無明顯的雜交顯色，分析原因后可能是Western blot 試驗中SDS-PAGE 蛋白電泳導致重組蛋白變性，改變了其空間結(jié)構(gòu)，而制備的單克隆抗體不具備線性識別位點，進行Dot blot，不破壞重組蛋白的空間結(jié)構(gòu)。Dot blot 結(jié)果如圖5A，制備的單克隆抗體能與純化的重組蛋白雜交顯色，而與大腸桿菌對照無雜交顯色，表明制備的單抗能與FAdV-4 Fiber2 重組蛋白進行特異性識別，且識別與其空間結(jié)構(gòu)有關(guān)；而圖5C 中，單抗能與攻毒雞肝組織研磨液雜交顯色，而與健康雞肝組織研磨液無雜交顯色，表明雖然構(gòu)建的Fiber2 是截斷片段，但是也能識別出全長病毒，證明制備的單抗也可用于病毒檢測中。將不同濃度的重組蛋白與制備的單抗進行Dot blot雜交，結(jié)果如圖5B 所示。隨著蛋白濃度的降低，單抗的雜交顯色反應稍有下降，但不明顯，分析原因可能是蛋白濃度過高，單抗特異性識別蛋白的下限可能在1×10-12級，表明其特異性和靈敏性較高。將不同拷貝數(shù)的染毒雞肝組織研磨液與制備單抗進行雜交顯色，結(jié)果如圖5C 所示，隨著病毒拷貝數(shù)的降低，雜交顯色反應呈明顯的線性下降趨勢，表明單抗能檢測到的最低病毒拷貝數(shù)為6.25×105個。制備的單克隆抗體不僅能特異性識別重組蛋白，也能識別出全長病毒，特異性及靈敏性都較高。

圖5 斑點雜交檢測單抗特異性

2.5.2 間接免疫熒光試驗鑒定 為進一步驗證制備的單克隆抗體的特異性，對感染FAdV-4 的雞肝癌細胞進行間接免疫熒光試驗IFA 分析。將正常培養(yǎng)的雞肝癌細胞感染FAdV-4 后培養(yǎng)24 h，顯微鏡下觀察結(jié)果如圖6C 所示，雞肝癌細胞開始有明顯的病變，表明雞肝癌細胞具有正常的生物學活性，并且感染雞肝癌細胞的FAdV-4 具備一定的毒力。在染毒24 h 后加入制備的單克隆抗體，檢測結(jié)果如圖6A 所示，單抗與染毒FAdV-4 的雞肝癌細胞呈現(xiàn)出特異性免疫反應，在熒光顯微鏡下可見綠色熒光；而未加單克隆抗體反應后無可見熒光如圖6B。制備的單抗具有針對FAdV-4 Fiber2 的良好特異性。

圖6 IFA 檢測單克隆抗體特異性

3 小結(jié)與討論

目前，國內(nèi)對于FAdV-4 的研究多集中于病毒的分離鑒定及生物學特性研究，對其蛋白的結(jié)構(gòu)與功能的研究多集中于Hexon［24］。其中哈爾濱獸醫(yī)研究所通過反向遺傳技術(shù)，首次證實了Hexon 基因的188 位氨基酸可以決定禽腺病毒的致病性［25］；而除Hexon 外，F(xiàn)iber2 基因在病毒感染和致死率中也發(fā)揮重要作用［24］。Fiber2 作為FAdV-4 的結(jié)構(gòu)蛋白，其抗原表位具有主要的型特異性和亞屬特異性，能有效誘導中和抗體產(chǎn)生［26］；并且流行病學研究調(diào)查結(jié)果指出Fiber2 不僅是中國高致病性流行FAdV-4 毒力的關(guān)鍵毒力因子［24］，而且還可以對FAdV-4 的高致病性感染提供有效的保護［9］。國內(nèi)文獻報道的重組Fiber2 表達蛋白多由于空間結(jié)構(gòu)異常而形成包涵體［10，27］，影響表達蛋白的生物學活性及構(gòu)象，在純化時需要經(jīng)過變性與復性后才能變成具有一定活性的蛋白，且純化操作繁瑣［28］；獲得可溶性的Fiber2 蛋白會增加蛋白的生物學活性，有利于FAdV-4 的檢測和疫苗的研發(fā)［5，29-31］?？扇苄暂^好的Fiber2 蛋白，利用鎳柱純化后能得到大量且純度較高的具有生物學活性的Fiber2 蛋白，并以此為基礎(chǔ)制備了禽腺病毒4型的亞單位疫苗［32］。

目前，單克隆抗體制備常采用重組蛋白抗原和合成抗原多肽；用合成多肽做抗原相比于重組蛋白抗原，不用考慮包涵體引起的蛋白不可溶，減少了純化條件的探究以及蛋白純度的要求，但是合成多肽做抗原時需選取多個不同序列的肽段，避免因肽段選擇不合適造成的免疫原性弱或者無反應原性的風險。選擇FAdV-4 Fiber2 重組蛋白做抗原，利用其抗原決定簇來檢測目的蛋白，通過大腸桿菌的表達體系可以在較短時間內(nèi)獲得大量的基因表達產(chǎn)物，且所需的成本相對較低，有利于后續(xù)商品化的生產(chǎn)；獲得的重組蛋白可溶性較好，且經(jīng)純化后得蛋白純度能達到95%以上，保證了免疫后所獲得的抗體的特異性。本研究中間接ELISA 能夠檢測出腹水中的抗體，證明制備的單抗具備特異性；但是在Western blot 中卻沒有雜交反應，但能通過Dot blot 斑點雜交呈現(xiàn)出特異性的雜交條帶。經(jīng)分析后認為在Western blot 中的SDS-PAGE 蛋白電泳中蛋白變性導致蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，由三維空間結(jié)構(gòu)變?yōu)榫€性條帶，致使蛋白的識別位點發(fā)生變化，從而導致制備的單抗無法與重組蛋白特異性識別，Western blot 中無特異性雜交條帶。同時單抗與染毒雞肝組織研磨液Dot blot 雜交試驗結(jié)果表明，所制備的單抗不僅能與重組蛋白發(fā)生特異性反應，也能特異性識別出完整的病毒。Dot blot 和IFA 試驗結(jié)果均可檢測到制備的單抗與FAdV-4 特異性反應，證明雖然構(gòu)建的重組蛋白是Fiber2 的截短片段，但是制備的FAdV-4 Fiber2 蛋白單克隆抗體針對Fiber2 蛋白的構(gòu)象表位，為進一步研究Fiber2 蛋白在禽病發(fā)病機制中的作用提供了一定的基礎(chǔ)，同時也為禽腺病毒4 型的檢測與防控，以及疫苗的評估提供了技術(shù)支持。

通過構(gòu)建表達的FAdV-4 Fiber2 蛋白制備了單克隆抗體，效價高、特異性強，針對Fiber2 蛋白的構(gòu)象表位，且具有良好的IFA 和Dot blot 反應原性，能特異性識別禽腺病毒4 型，同時也具有一定的中和活性，為禽腺病毒的檢測、監(jiān)測及預防提供了一定的參考，為檢測試劑盒的研制及疫苗的評估奠定了基礎(chǔ)。