劉同方，沈起兵，張翼飛，李淑娟，張國文，于燕波

深圳市綠航星際太空科技研究院（深圳 518117）

膠原蛋白肽，是以富含膠原蛋白的新鮮動(dòng)物組織（包括皮、骨、筋、腱、鱗等）為原料，經(jīng)過提取、水解、精制生產(chǎn)的，相對(duì)分子質(zhì)量低于10 000的產(chǎn)品[1]。膠原蛋白肽具有分子量小、易吸收、生物活性高、載體運(yùn)輸能力強(qiáng)等典型特征[2]，多項(xiàng)研究證實(shí)，膠原蛋白肽具有顯著的美容[3-4]、促進(jìn)骨骼關(guān)節(jié)健康[5-6]、控制體重[7]、增強(qiáng)免疫力[8]等功效。因其顯著的生理活性廣泛應(yīng)用于特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品、保健食品、化妝品和藥品。

在中國，膠原蛋白肽市場是一個(gè)新興市場，國內(nèi)膠原蛋白肽生產(chǎn)企業(yè)大部分都于2005年以后成立，由于早期國內(nèi)相關(guān)法規(guī)不健全、不同生產(chǎn)商的產(chǎn)品質(zhì)量差距較大。而關(guān)于膠原蛋白肽產(chǎn)品的品質(zhì)與原料來源方面關(guān)系的爭論也主要集中在兩方面，一是不同動(dòng)物來源的原料，二是不同部位來源的原料。從品質(zhì)（主要指生理功效）來看，國內(nèi)外研究尚未證明孰優(yōu)孰劣，有研究提出以皮膠原為原料制備的膠原蛋白多肽美肌效果好，或以骨膠原為原料制備的膠原蛋白肽健骨效果更好等觀點(diǎn)，但尚無這方面研究的系統(tǒng)數(shù)據(jù)[9]。由于不同動(dòng)物不同部位的膠原蛋白組成結(jié)構(gòu)不同，其酶解產(chǎn)物中肽的構(gòu)成不同，很難統(tǒng)一結(jié)論，而膠原蛋白肽產(chǎn)品具有典型的氨基酸組成，氨基酸組成是表征膠原蛋白肽產(chǎn)品質(zhì)量最重要指標(biāo)之一[10]。

試驗(yàn)篩選11種市售膠原蛋白肽產(chǎn)品，主要原料來源分別為牛皮、牛骨、豬皮、魚皮、牦牛骨。對(duì)其17種氨基酸含量進(jìn)行測定，分析和比較不同產(chǎn)品的氨基酸組成，采用世界衛(wèi)生組織/聯(lián)合國糧農(nóng)組織（WHO/FAO）頒布的理想蛋白質(zhì)必須氨基酸模式譜[11-12]，對(duì)檢測的樣品進(jìn)行氨基酸營養(yǎng)評(píng)價(jià)，為膠原蛋白肽的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2.5 mmol/mL的17種混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液、L-羥脯氨酸（≥98%）標(biāo)準(zhǔn)品（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；硫酸、鹽酸、檸檬酸鈉、氫氧化鈉（均為優(yōu)級(jí)純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

表1 膠原蛋白肽樣品來源及原產(chǎn)國

1.2 儀器與設(shè)備

S7130型全自動(dòng)氨基酸分析儀[塞卡姆（德國）]；UV-1100型紫外可見分光光度計(jì)（上海美析儀器有限公司）；AUW120D型分析天平（日本島津）；ST 3100/F型pH計(jì)[奧豪斯儀器（常州）有限公司]；DHG-9140B型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海申賢恒溫設(shè)備廠）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品水分測定

按照GB 5009.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測定》中直接干燥法對(duì)膠原蛋白肽樣品水分進(jìn)行測定。

1.3.2 氨基酸含量測定

按照GB/T9695.23—2008《肉與肉制品 羥脯氨酸含量測定》和GB 5009.124—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測定》要求，樣品經(jīng)酸水解后，分別對(duì)樣品中羥脯氨酸、天門冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、賴氨酸和精氨酸共17種氨基酸進(jìn)行含量測定。

1.3.3 營養(yǎng)評(píng)價(jià)

除了蛋白質(zhì)含量高低以外，食物蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價(jià)值主要取決于其必需氨基酸的組成和比例，如果必需氨基酸組成接近于人體必需氨基酸模式，可有效提高蛋白質(zhì)的吸收利用率及應(yīng)用價(jià)值。計(jì)算氨基酸總量（T）、必需氨基酸總量（EAA）、非必需氨基酸總量（NEAA）、必需氨基酸占總氨基酸的百分比（E/T）和必需氨基酸占非必需氨基酸的百分比（E/NE）。根據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（FAO）和世界衛(wèi)生組織（WHO）提出的評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)營養(yǎng)價(jià)值的必需氨基酸模式和全雞蛋蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)價(jià)分析。

氨基酸比值（ratio of amino acid，RAA）計(jì)算如式（1）。

式中：CV為RC的變異系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 膠原蛋白肽樣品水分

由于不同廠家生產(chǎn)環(huán)境控制及儲(chǔ)存環(huán)境的差異性，導(dǎo)致最終產(chǎn)品的水分也會(huì)有較大差異，為了排除水分對(duì)氨基酸含量的影響，采用直接干燥法測定膠原蛋白肽產(chǎn)品中水分，氨基酸含量均采用以干基計(jì)，數(shù)據(jù)如表2。

表2 膠原蛋白肽樣品水分測定值

2.2 膠原蛋白肽氨基酸組成

參照國標(biāo)檢測方法，羥脯氨酸、天門冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、賴氨酸和精氨酸共17種氨基酸含量檢測結(jié)果如表3。

蛋白質(zhì)質(zhì)量高低在于其所含氨基酸種類及對(duì)應(yīng)氨基酸含量[13]，而膠原蛋白肽具有很特殊的氨基酸組成，羥脯氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷氨酸和精氨酸是構(gòu)成膠原蛋白最重要的幾種氨基酸，缺少胱氨酸和色氨酸[14]，羥脯氨酸是膠原蛋白生物合成及形成穩(wěn)定三重螺旋結(jié)構(gòu)所必需的，在自然界中幾乎無游離的羥脯氨酸存在。因此，選擇膠原蛋白肽產(chǎn)品時(shí)，不僅要看總的蛋白質(zhì)含量，還要看對(duì)構(gòu)建膠原蛋白最有效的氨基酸含量。由表3中數(shù)據(jù)可以看出，氨基酸總量（以干基計(jì)）在101.26%～111.73%范圍內(nèi)，氨基酸總量均超過100%，這主要是由于膠原蛋白肽是由2個(gè)以上，大至由數(shù)百個(gè)氨基酸通過肽鍵連接而成，是介于氨基酸與蛋白質(zhì)之間的分子聚合物，其中蛋白質(zhì)中氨基酸平均相對(duì)分子質(zhì)量約為128[10]。在氨基酸檢測方法中，樣品需要進(jìn)行水解處理，氨基酸殘基增加[OH]-和[H]+，得到游離氨基酸，總體來看，相對(duì)分子量較膠原蛋白肽有較大增加，這也解釋了膠原蛋白肽氨基酸總量（以干基計(jì)）檢測結(jié)果超過100%的原因。

表3 11種膠原蛋白肽樣品氨基酸組成及含量

所測11種膠原蛋白肽樣品中，甘氨酸含量最高，均超過24%，羥脯氨酸和脯氨酸含量相近，均超過10%。谷氨酸和丙氨酸，含量均在10%左右，丙氨酸在人體內(nèi)20種基本氨基酸中含量僅次于賴氨酸，作為非必需氨基酸，丙氨酸通常作為各處理間等氮平衡的首選氨基酸。在所測樣品中精氨酸含量均超過7%，蛋氨酸和酪氨酸含量較低，部分樣品中未檢出。總體來看，11種樣品中氨基酸絕大部分是非必須氨基酸，必須氨基酸含量范圍為11.81%～13.55%，不同原料和產(chǎn)地來源的膠原蛋白肽產(chǎn)品中氨基酸含量，數(shù)據(jù)基本一致，差異不大。

2.3 氨基酸營養(yǎng)評(píng)價(jià)

2.3.1 以必須氨基酸模式譜評(píng)價(jià)

食物中的氨基酸模式與人體氨基酸模式越接近，才能為機(jī)體充分利用，其營養(yǎng)價(jià)值也相對(duì)越高。雞蛋與人體氨基酸模式最接近，通常以其作為參考。所以，通過與必需氨基酸模式譜及雞蛋氨基酸模式譜進(jìn)行比較，可以對(duì)不同膠原蛋白肽的營養(yǎng)價(jià)值進(jìn)行分析比較[15]。

由表4可知，在FAO/WHO推薦值下，11種膠原蛋白肽產(chǎn)品中必需氨基酸占總氨基酸比例均低于推薦值。在全雞蛋模式下，除賴氨酸的值與參考值相接近外，其余均低于參考值，其中ZP-2和ZP-3這2個(gè)樣品的賴氨酸的值高于參考值。在2種模式下蛋氨酸+胱氨酸均顯著低于推薦值，所以11種膠原蛋白肽產(chǎn)品的第一限制氨基酸均為蛋氨酸+胱氨酸。通過必需氨基酸模式比較可以得出，11種膠原蛋白肽產(chǎn)品的氨基酸模式都不符合FAO/WHO模式譜和全雞蛋模式，除賴氨酸外，必需氨基酸與推薦值都相差較大。必需氨基酸模式譜評(píng)價(jià)的結(jié)果顯示，11種膠原蛋白肽產(chǎn)品營養(yǎng)價(jià)值相對(duì)有限。

表4 11種膠原蛋白肽樣品必需氨基酸所占比例與WHO/FAO推薦氨基酸模式譜的比較 單位：%

2.3.2 以理想蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)

根據(jù)FAO/WHO提出的理想蛋白模式，質(zhì)量較好的氨基酸組成為必需氨基酸與氨基酸總量的比例在40%左右，而必需氨基酸總量與非必需氨基酸總量的比例在60%以上。表3中數(shù)據(jù)顯示，11種膠原蛋白肽產(chǎn)品中必需氨基酸占總氨基酸的百分比范圍為11.45%～13.02%，必需氨基酸占非必需氨基酸的百分比范圍為12.94%～14.97%。必需氨基酸總量與氨基酸總量的比例及必需氨基酸總量與非必需氨基酸總量的比例，與理想蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)比較，都未達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)。

2.3.3 不同膠原蛋白肽樣品中氨基酸比值系數(shù)分

食物中氨基酸組成比例合理，越接近 FAO/WHO氨基酸模式要求，則說明該營養(yǎng)價(jià)值越高。按照式（1）～（3）分別計(jì)算不同產(chǎn)地菊花的RAA、RC和SRC。RC值越接近1，說明食品中氨基酸組成比例越接近FAO/WHO模式蛋白氨基酸。當(dāng)RC＞1時(shí)，表示該必需氨基酸相對(duì)過剩，反之則說明該必需氨基酸相對(duì)不足，RC值最小者為該食品中第一限制氨基酸。SRC值越大，則膠原蛋白肽的RC越分散，表示這些氨基酸在氮基酸平衡上做的負(fù)貢獻(xiàn)越大；若SRC越小，表示膠原蛋白肽的營養(yǎng)價(jià)值越差，如果膠原蛋白肽中氨基酸組成與氨基酸模式一致，則SRC為100[16]。由表5可知，膠原蛋白肽產(chǎn)品中的第一限制氨基酸為胱氨酸和蛋氨酸，YP-2的氨基酸比值系數(shù)分相比其他樣品最高，說明YP-2的氨基酸組成與模式氨基酸更接近，對(duì)氨基酸平衡所做的貢獻(xiàn)也較大。

表5 11種膠原蛋白肽產(chǎn)品氨基酸比值系數(shù)比較

2.3.4 功能性氨基酸評(píng)價(jià)

有些氨基酸不僅是合成蛋白質(zhì)的必需前體，而且在動(dòng)物生長、發(fā)育、免疫和代謝中發(fā)揮重要調(diào)控作用，因此又提出功能性氨基酸的概念，具體包括色氨酸、精氨酸、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸、支鏈氨基酸等，在物質(zhì)代謝和免疫功能調(diào)控中起到重要作用；其中支鏈氨基酸包括異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸，支鏈氨基酸不僅是蛋白質(zhì)合成的必需底物，還具有調(diào)控蛋白質(zhì)代謝、氧化供能、促進(jìn)糖異生、增強(qiáng)免疫力和減少負(fù)氮平衡等重要生理功能；脯氨酸能夠調(diào)控細(xì)胞內(nèi)多種生理和生化過程，同時(shí)，脯氨酸是小腸和胚胎中合成多胺的主要前體；羥脯氨酸是膠原蛋白中脯氨酰殘基經(jīng)維生素C依賴的脯氨酰羥化酶羥基化的產(chǎn)物，并且?guī)缀踔淮嬖谟谀z原蛋白中，它能夠增強(qiáng)膠原蛋白的熱穩(wěn)定性并且能夠抑制蛋白質(zhì)凝集和纖維化的發(fā)生；精氨酸是幼齡哺乳動(dòng)物的必需氨基酸，是組織蛋白中最豐富的氮載體[17]。谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含量最多的一種興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，并在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起著至關(guān)重要的作用，同時(shí)參與神經(jīng)元的發(fā)育，突觸的形成、維持和可塑性變化，進(jìn)而影響學(xué)習(xí)與記憶等高級(jí)認(rèn)知功能[18]。

由表6可知，除色氨酸在膠原蛋白肽缺少外，11種膠原蛋白肽產(chǎn)品中均含有其余所有功能性氨基酸，并且所有氨基酸中功能性氨基酸占絕大多數(shù)，含量均超過70%。其中，NG-1、NG-2、NP-1、NP-2和ZP-3的功能性氨基酸總量均超過80%。所有產(chǎn)品中，甘氨酸含量最高，均超過24%，其次是脯氨酸和羥脯氨酸，均超過10%，但魚皮中羥脯氨酸含量相對(duì)其他產(chǎn)品較低，其余功能性氨基酸含量也都在5%以上。

表6 11種膠原蛋白肽產(chǎn)品功能性氨基酸含量

3 結(jié)論

試驗(yàn)選取產(chǎn)自中國、美國、德國和法國，原料來源為牦牛骨、牛骨、牛皮、豬皮和魚皮共計(jì)11個(gè)膠原蛋白肽產(chǎn)品，分別測定17種氨基酸含量。從氨基酸組成角度來看，所測樣品中均含有7種必須氨基酸，但含量相對(duì)較低，均不超過5%，其中必需氨基酸含量最高的是賴氨酸，其次是亮氨酸和纈氨酸。非必需氨基酸占氨基酸總量絕大部分，其中甘氨酸含量最高，均超過24%。從功能性氨基酸含量分析比較，11種市售膠原蛋白肽功能性氨基酸含量均超過70%，牛皮和牛骨來源的膠原蛋白肽產(chǎn)品中功能性氨基酸含量相對(duì)高一些，其次是豬皮來源。以FAO/WHO氨基酸模式譜為標(biāo)準(zhǔn)，11種膠原蛋白肽產(chǎn)品中必需氨基酸占總氨基酸比例均低于推薦值，在全雞蛋模式下，只有ZP-2和ZP-3這2個(gè)樣品的賴氨酸的值高于參考值；以理想蛋白質(zhì)為標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)，11個(gè)產(chǎn)品都未達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)；氨基酸比值系數(shù)分評(píng)價(jià)，YP-2較為好。通過對(duì)氨基酸組成、E/T、E/NE、SRC等指標(biāo)分析及功能性氨基酸組分比較，市售的11種膠原蛋白肽產(chǎn)品氨基酸營養(yǎng)價(jià)值優(yōu)良程度差異不大，且與產(chǎn)地以及原料來源并無明顯關(guān)聯(lián)性。因此，單從氨基酸營養(yǎng)價(jià)值指標(biāo)去篩選一款優(yōu)質(zhì)膠原蛋白肽產(chǎn)品具有一定的局限性。

隨著GB 31645—2018《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 膠原蛋白肽》的實(shí)施，對(duì)整個(gè)行業(yè)的發(fā)展起到正向推進(jìn)作用，如何在國家標(biāo)準(zhǔn)之上篩選差異化的優(yōu)質(zhì)膠原蛋白肽原料，成為擺在終端企業(yè)面前的難題之一。對(duì)致力于開發(fā)終端產(chǎn)品企業(yè)而言，滿足國家標(biāo)準(zhǔn)要求僅是篩選的必要條件，而膠原蛋白肽產(chǎn)品的原料源頭安全把控（包括養(yǎng)殖、儲(chǔ)運(yùn)運(yùn)輸環(huán)境、預(yù)處理工藝等）、生產(chǎn)工藝控制（水解工藝、生產(chǎn)環(huán)境控制、干燥工藝等）、終產(chǎn)品肽分子量分布及明確的功能性將成為評(píng)判產(chǎn)品優(yōu)劣的關(guān)鍵要素。