倪魯波，唐雷鳴，陸羚子，戴意飛，劉婷，蔣玲波

舟山市食品藥品檢驗檢測研究院（舟山 316000）

黃曲霉毒素（aflatoxin，AF）[2]是自然界中最常見且毒素最強的真菌毒素，AF根據(jù)熒光顏色、結(jié)構(gòu)不同可分為B1、B2、G1、G2、M1、M2、P1、R1、GM等。其中，AFB1毒性最強，M1和G1次之[3]。AF能通過食物轉(zhuǎn)移到人類及動物體內(nèi)殘留且極難代謝，因此對人類生命安全頗具威脅。谷物及其制品糧油作物及加工產(chǎn)品、果蔬產(chǎn)品、乳及乳制品、魚禽肉制品、動植物飼料等都檢出AF，其中花生和玉米及其制品最容易受到污染[3]。AF結(jié)構(gòu)性質(zhì)穩(wěn)定，對光、熱和酸均穩(wěn)定，耐高溫，一般加熱溫度很難破壞其結(jié)構(gòu)，只有達到其熔點時才能使其分解[3]。在自然條件下能長時間存在，對人類危害較大。由于AF對人類的危害性非常大，世界各國都相應(yīng)出臺AF的限量標準值和檢測標準[4]。因此，需要用最精確及高效的檢測技術(shù)對AF進行測定確保其準確性[5]。

該方法簡便快捷，而且具有響應(yīng)值高、平行好、分離效果好、數(shù)據(jù)可靠等優(yōu)點。使用SMART柱全自動凈化分析系統(tǒng)直接串聯(lián)檢測器減少試驗前處理中人員操作，大幅降低人員操作中黃曲霉毒素帶來風(fēng)險，且提高試驗效率，減少試驗過程中待測物質(zhì)的損失。所以，試驗研究并建立乳制品中AFM1和AFM2提取凈化、上機分析一體化的檢測技術(shù)，創(chuàng)建一種簡捷高效、靈敏度高，重現(xiàn)性好的檢測方法，為AFM1、AFM2的檢測提供新的發(fā)展方向與思路。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

大容量落地高速冷凍離心機（AVANTIJ-E）；超純水機（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；多樣品渦旋混合器（廣州得泰儀器科技有限公司）；Waters高效液相色譜儀ACQUITY Arc（美國Waters公司）；SMART-柱全自動凈化分析聯(lián)機（德國LCTech公司）；免疫親和柱（北京振翔科技有限公司）。

黃曲霉毒素M1（AFM1）、黃曲霉毒素M2（AFM2）標準溶液：北京振翔科技有限公司；磷酸氫二鈉十二水（Na2HPO4·12H2O）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、氯化鈉（NaCl）、氯化鉀（KCl）：北京振翔科技有限公司；甲醇、乙腈（色譜純，國藥）。

1.2 試驗方法

1.2.1 色譜條件

Waters Bridge C18柱（4.6 mm×150 mm，2.5 μm）色譜柱；柱溫箱35 ℃；流速0.6 mL/min，進樣量50 μL；流動相為V水∶V甲醇∶V乙腈溶液=70∶15∶15；激發(fā)波長360 nm，發(fā)射波長430 nm。

1.2.2 標液和試劑的配制

1.2.2.1 標準溶液的配制

分別取0.1 mL AFM1、AFM2標液（10 mg/L）至10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度。配制成100 ng/mL的AFM1、AFM2混合標準儲備液。配制液密封于0～4 ℃環(huán)境下儲存。臨用時按實際需求加入初始流動相稀釋至所需濃度的標準曲線工作液，標準工作液現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.2.2 磷酸鹽緩沖溶液（PBS）的配制

稱取2.92 g Na2HPO4·12 H2O+8.0 g NaCl+0.2 g KH2PO4+0.2 g KCl后，加入900 mL水使固體溶解。用鹽酸調(diào)節(jié)至pH 7.4，加水定容至1 000 mL。

1.2.3 提取方法

準確稱取1.00 g樣品于50 mL離心管中，加入4 mL熱水溶解，混勻，加入10 mL（V甲醇∶V水=3∶1）振蕩提取10 min。在4 ℃，以6 000 r/min離心10 min，取10 mL上清液加入40 mL PBS稀釋，渦旋2 min使其充分混勻，上免疫親和柱凈化處理。

1.2.4 凈化洗脫方法

使用SMART免疫親和柱對稀釋后的提取液進行凈化洗脫處理[2]，將SMART免疫親和柱放在免疫親和柱架盤上。擰掉SMART免疫親和柱密封蓋和堵頭，柱子里面的緩沖溶液會緩慢排出，直到緩沖溶液液面達到柱床處。按需求取適量稀釋液上柱，并控制稀釋液過柱流速在1.0 mL/min左右，讓所有樣液都流過柱子[1]。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

選用Waters Bridge C18柱進行分析檢測，并對乙腈、甲醇、水等流動相的比例進行重新組合測試，考察AFM1、AFM2保留時間、靈敏度及峰形，分離度等因素，從而選取最優(yōu)的流動相體系。該法優(yōu)化流動相比例和流速，將流動相比例調(diào)整為V水∶V甲醇∶V乙腈溶液= 70∶15∶15、流速0.6 mL/min。從圖1標準圖譜可以看到，AFM1、AFM2和乳制品中的干擾物質(zhì)都能很好地分離，AFM1、AFM2峰形相對尖銳，靈敏度高。且在10 min內(nèi)就能完成檢測分析。因此，該方法通過優(yōu)化流動相比例和流速，不僅能使AFM1、AFM2分離良好，而且縮短檢測分析時間，大幅提高效率。

圖1 AFM1和M2標準色譜圖

2.2 提取試劑的優(yōu)化

考察不同比例的甲醇溶液作為提取試劑對AFM1、AFM2回收率的影響。以V甲醇∶V水=1∶1，2∶1，3∶1和4∶1作為提取溶劑，分別通過儀器檢測分析并比較回收率。由圖2可知，通過比較回收率后發(fā)現(xiàn)，在甲醇含量50%～75%時，隨著甲醇含量增加，目標物回收率逐步上升。但在甲醇含量75%～80%時，目標物回收率反而開始下降。由此得知，75%甲醇水溶液為最佳提取液。

圖2 不同比例甲醇溶液作為提取試劑對樣品中AFM1、AFM2回收率的影響

2.3 方法的線性關(guān)系、精密度及檢出限

AFM1、AFM2在0.05～5 ng/mL范圍內(nèi)標準曲線線性較好，相關(guān)系數(shù)大于0.999，陰性樣品做加標試驗，分別加入3個濃度且每個濃度做6組平行試驗，結(jié)果如表1所示。2種目標物回收率在83.2%～90.0%之間，SRSD為1.0%～2.7%，方法檢出限（≥儀器信噪比3倍）AFM1為0.02 μg/kg，AFM2為0.01 μg/kg。該方法簡捷效率，分離度好，響應(yīng)值高，重現(xiàn)性好。

表1 乳粉中AFM1、AFM2回收率和RSD結(jié)果（n=6）

3 結(jié)論

此次試驗主要通過改良提取試劑的比例、SMART柱在線凈化條件、流動相比例，建立SMART柱在線自動凈化-高效液相串聯(lián)熒光檢測法同時檢測黃曲霉毒素（AF）M1、M2的方法，使試驗中AFM1、AFM2分離度更好，出峰更快，響應(yīng)值更高，從而提高試驗回收率和試驗效率。其中，真菌凈化平臺直接串聯(lián)液相熒光檢測器的使用，直接大幅降低試驗前處理中的人員操作風(fēng)險并且大幅縮短前處理時間，為真菌毒素的試驗前景拓展新思路。