梁瓊，張玉霞，趙曉野*，王婷

1. 海南省食品藥品檢驗所?？诜炙ê？?570311）；2. 海南省工商職業(yè)學(xué)院（?？?570203）

腹瀉性貝毒（diarrhetic shellfish poison，DSP）是由有毒甲藻類鰭藻屬（Dinophysis）和原甲藻屬（Prorocentrum）中部分藻種產(chǎn)生的一類熱穩(wěn)定的脂溶性多環(huán)醚類化合物，主要成分為軟海綿酸（oka-daic acid，OA）及其衍生物，因其分布廣泛、對人類致毒性強而成為備受關(guān)注的海洋生物毒素之一。貝類通過濾食有毒藻類而在體內(nèi)積累毒素，當(dāng)人們誤食染毒的貝類后就會造成中毒，癥狀主要表現(xiàn)為腹瀉，與一些普通腹瀉癥狀相似，所以往往被人們忽視。由于腹瀉性貝類中毒現(xiàn)象普遍存在，且分布較廣、致毒性強，故被列為世界食品衛(wèi)生學(xué)重要問題之一。DSP不僅能造成急性中毒，也能引起潛在的慢性中毒，而且DSP中主要成分OA是一種很強的腫瘤促進(jìn)劑，具有一定的促癌作用[1-2]，可誘發(fā)消化系統(tǒng)癌變。盡管致癌機理目前還不十分清楚，但應(yīng)當(dāng)引起人們對海產(chǎn)貝類食用安全的高度關(guān)注。已有研究報道，我國沿海大部分海域都存在DSP污染[3-5]。南海海域、廣東沿海、福建沿海、浙江海域、上海水產(chǎn)市場均發(fā)現(xiàn)DSP[6-11]，超標(biāo)率較高，個別海域超標(biāo)率竟達(dá)77%。

海南島是我國唯一的熱帶島嶼，有著豐富的海洋資源和得天獨厚的生態(tài)環(huán)境，為熱帶貝類養(yǎng)殖提供了有利條件，貝類養(yǎng)殖品種多樣化。隨著近年來該海域有毒赤潮的不斷發(fā)生，該海域養(yǎng)殖貝類的食用安全存在較大風(fēng)險，但關(guān)于海洋毒素在海南島貝類中染毒狀況的研究卻非常少見[12]，據(jù)僅有可查資料顯示，胡蓉等[13]研究發(fā)現(xiàn)海南島海域貝類DSP全年陽性檢出率和超標(biāo)率較高，污染狀況較為嚴(yán)重。楊美蘭等[14]研究發(fā)現(xiàn)2006年海南海區(qū)的榆林港水域和2007年海南海區(qū)的八所港等5個養(yǎng)殖水域牡蠣體中DSP呈陽性。吳施衛(wèi)等[3]研究發(fā)現(xiàn)海南主要的DSP染毒海域是陵水赤控區(qū)、?？凇ⅩL歌海、三亞及洋浦等地。

此次研究對海南島常見的貝類設(shè)了5個觀測點，進(jìn)行為期一年四季的檢測追蹤，調(diào)查腹瀉類貝毒污染狀況，為貝類食品安全性評價和毒素檢測分析提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)，為海南省提高和改善水產(chǎn)品的質(zhì)量及安全性提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2019年9月至2020年8月為期一年間，在海南省?？冢℉K）、文昌（WC）、瓊海（QH）、三亞（SY）、儋州（DZ）、東方（DF）6個站點進(jìn)行貝類樣品采集，共采集到17種貝類323個樣品，主要品種為菲律賓蛤仔、魁蚶、櫛江珧、波紋巴非蛤、華貴櫛孔扇貝、裂紋格特蛤、翡翠貽貝、鈍綴錦蛤、方斑東方螺、蟶子等，均為當(dāng)?shù)刂饕?jīng)濟(jì)養(yǎng)殖的貝類。樣品采集時了解確認(rèn)其產(chǎn)地信息，樣品采集后迅速送至實驗室，用自來水洗去貝類外殼附著物，用刀將貝類的軟組織與貝殼分離，并用去離子水沖洗附著內(nèi)部的殼屑，充分瀝干水分，勻漿機均質(zhì)，編號后置于樣品管中，貯存于-24 ℃低溫冰箱待測。

1.2 儀器和設(shè)備

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（配有電噴霧離子源，Agilent 6460）；PL602L天平（梅特勒）；B-400組織均質(zhì)器（瑞士步琪）；渦旋振蕩器（Heidolph Multi Reax）；3-18K離心機（德國西格瑪）；超聲波清洗器（昆山舒美KQ-400ES）；YGC-24D氮吹儀（雅源科技）。

1.3 檢測方法

試驗采用了在GB 5009.212—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)貝類中腹瀉性貝類毒素的測定》液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）基礎(chǔ)上，實驗室進(jìn)行優(yōu)化后的方法。取樣2 g于50 mL具塞離心管中，加入9 mL甲醇，渦旋混合1 min，超聲提取10 min，在8 000 r/min下離心5 min，移出上清液。殘渣中加入9 mL甲醇，重復(fù)提取1次，合并提取液。將上清液轉(zhuǎn)入分液漏斗中，用15%（體積分?jǐn)?shù)）二氯甲烷/正己烷溶液脫脂3次（每次15 mL），加5 mL水，再用50%（體積分?jǐn)?shù)）二氯甲烷/正己烷溶液萃取3次（每次15 mL），合并二氯甲烷層，用無水硫酸鈉脫水后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，然后用氮吹儀吹干，用甲醇定容至1 mL，置于螺紋口樣品瓶中，加入125 μL氫氧化鈉溶液（2.5 mol/L），混勻后用密封膜將瓶密封，在76 ℃條件下溫浴40 min，冷至室溫后，加入125 μL鹽酸溶液（2.5 mol/L）并混勻，所得水解液（1.25 mL相當(dāng)于2 g試樣）可直接過0.22 μm有機相微孔濾膜后，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

1.4 檢測條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C182.1×100 mm，1.7 μm；流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；流動相：A為甲酸銨溶液（2 mmol/L），B為乙腈+甲酸銨溶液（2 mmol/L）（95+5，V/V）；梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI）；負(fù)離子掃描模式；檢測方式：多反應(yīng)檢測（MRM）；電噴霧電壓：4 000 V；毛細(xì)管溫度：300 ℃；各組分監(jiān)測離子及對應(yīng)碰撞能量見表2。

表2 DSP監(jiān)測離子及碰撞能量

1.5 計算方法

OA、DTX-1和DTX-2根據(jù)對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)回歸方程進(jìn)行含量計算。試樣中腹瀉性貝類毒素總毒力按OAeq=×ri計算。式中：Xi為各種腹瀉性貝類毒素的含量；ri為毒性因子（rOA=1，rDTX-1=1，rDTX-2=0.6）。

2 結(jié)果與分析

2.1 DSP毒素質(zhì)譜圖

取空白試樣，按照與試樣相同的分析步驟處理，制成基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。

圖1 OA標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

圖2 DTX-1標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

OA、DTX-1，DTX-2的各自的質(zhì)譜圖如圖4所示。OA和DTX-2為同分異構(gòu)體，OA比DTX-2出峰時間早。

圖4 OA、DTX-1，DTX-2多反應(yīng)監(jiān)測離子色譜圖

圖3 DTX-2 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2 全年DSP污染情況

根據(jù)GB 5009.212—2016液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）方法規(guī)定，OA、DTX-1，DTX-2的檢出限均為10.0 μg/kg，定量限均為30.0 μg/kg，同時方法認(rèn)為任何腹瀉性貝類毒素含量大于16 μg/100 g的樣品即被認(rèn)為是有害的，對人類食用不安全。海南島近岸腹瀉性貝毒污染狀況調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，全年抽樣量共323個樣品，共有28個樣品檢出含量超過10.0 μg/kg，其中有6個樣品檢出含量超過30.0 μg/kg，1個樣品超16 μg/100 g。

表3 全年DSP檢測情況統(tǒng)計分析

2.3 不同季節(jié)貝類DSP毒素污染情況

海南島近岸貝類DSP含量存在一定的季節(jié)差異性。從表4可以看出：2019年冬季，檢驗貝類樣品共59份，DSP檢出有12份，檢出率為20.3%；2020年春季，檢驗貝類樣品共90份，DSP檢出有6份，檢出率為6.7%；2020年夏季，檢驗貝類樣品共89份，DSP檢出有0份，檢出率為0；2019年秋季，檢驗貝類樣品共85份，DSP檢出有10份，超標(biāo)1份，檢出率和超標(biāo)率分別為11.8%和1.2%。貝類DSP含量在冬季檢出率最高，秋季次之，染毒含量最高的樣品出現(xiàn)在秋季，春季較低，夏季樣品都未檢出。就檢出率而言，2019年冬季＞2019年秋季＞2020年春季＞2020年夏季。

表4 不同季節(jié)DSP檢測情況統(tǒng)計分析

2.4 不同海域貝類DSP毒素污染情況

?？诤Ｓ蚬膊杉瘶悠?4份，DSP檢出有7份，超標(biāo)1份，檢出率和超標(biāo)率分別為13.0%和1.9%；文昌海域共采集樣品52份，DSP檢出有9份，檢出率為17.3%；瓊海海域共采集樣品54份，DSP檢出有1份，檢出率為1.9%；三亞海域共采集樣品53份，DSP檢出有3份，檢出率為5.7%；儋州海域共采集樣品54份，DSP檢出有6份，檢出率為11.1%；東方海域共采集樣品55份，DSP檢出有2份，檢出率為3.6%。海南島近岸貝類都有受貝類DSP毒素污染的狀況發(fā)生，但總體上毒素含量不高。就檢出率而言，文昌＞?？冢举僦荩救齺啠緰|方＞瓊海。如表5所示。

表5 不同海域DSP檢測情況統(tǒng)計分析

2.5 不同貝類累積DSP毒素特征

此次調(diào)查檢測共采集到17種貝類323個樣品，主要品種為菲律賓蛤仔41份、魁蚶31份、櫛江珧12份、波紋巴非蛤31份、華貴櫛孔扇貝12份、裂紋格特蛤53、翡翠貽貝17份、鈍綴錦蛤47份、方斑東方螺9份，蟶子29份及其他41份。其他種類貝類均為3～5份，均未檢測出貝類DSP毒素。檢出率最高的是波紋巴非蛤、華貴櫛孔扇貝、翡翠貽貝，高達(dá)20%以上，最低是蟶子，檢出率從高到低依次為波紋巴非蛤＞華貴櫛孔扇貝＞翡翠貽貝＞方斑東方螺＞裂紋格特蛤＞櫛江珧＞魁蚶＞菲律賓蛤仔＞鈍綴錦蛤＞蟶子=其他。主要品種染毒情況如下表6所示。

表6 不同貝類品種DSP檢測情況統(tǒng)計分析

3 討論

目前貝類毒素檢測方法有小鼠生物測定（MBA）法、酶聯(lián)免疫吸附測定（ELASA）法、高效液相色譜-熒光法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）法等。雖然MBA法是腹瀉性貝類毒素最普遍的檢測方法，但該方法需大量使用小鼠，不符合“3R”的要求[15]，而且由于靈敏度低、準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性差、易出現(xiàn)假陽性、不具有特異性、無法確定毒素的成分、結(jié)構(gòu)和含量、浪費實驗材料等缺點，限制了此方法的推廣；ELASA試劑盒雖靈敏度高、操作簡單，但其試劑盒昂貴，有類似物干擾作用，會出現(xiàn)假陽性或?qū)Χ拘怨烙嫴粶?zhǔn)確的情況[16]，不適合日常監(jiān)測使用；高效液相色譜-熒光法是國內(nèi)外目前常用的貝類毒素檢測方法，分析過程中使用的柱衍生試劑如ADAM價格昂貴[17]，同時還須另配柱后衍生裝置，檢測所需的熒光試劑在室溫下不穩(wěn)定，背景干擾對試驗結(jié)果影響大，操作繁瑣，不易穩(wěn)定，重復(fù)性差，因此其應(yīng)用受到一定的限制；此次研究采用了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）法，該測定方法是近年興起的一種檢測技術(shù)，比其他方法重復(fù)性好，不會出現(xiàn)假陽性，是一種能夠準(zhǔn)確定性定量，并能夠提供準(zhǔn)確的分子結(jié)構(gòu)信息的新型分離技術(shù)[18]。在眾多的分析測試方法中，HPLC-MS/MS以其同時具備高特異性和高靈敏度的特點而被廣泛應(yīng)用于生物毒素研究領(lǐng)域。

在此次檢測的323個樣品中，共有28個樣品檢出含量超過10.0 μg/kg，檢出率為8.7%，最大的一個檢出含量為180 μg/kg。根據(jù)2001-10-01實施的國家標(biāo)準(zhǔn)GB 18406.4—2001《無公害食品水產(chǎn)品中有毒有害物質(zhì)限量》中規(guī)定水產(chǎn)品中DSP限量標(biāo)準(zhǔn)為60 μg/100 g可食部分，可判定該批次無陽性樣品。

導(dǎo)致DSP季節(jié)性差異的原因可能是季節(jié)不同，造成水體溫度、鹽度、光照等變化，進(jìn)而影響藻類種群、數(shù)量和貝類的生理狀態(tài)。海南島海域浮游生物調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該海域存在可能產(chǎn)生DSP的藻類有利瑪原甲藻和D.caudata等[19]，且浮游植物細(xì)胞密度的季節(jié)變化呈冬季初期最高、秋季次之、夏季最低的趨勢[20]。此次研究發(fā)現(xiàn)冬季檢出率最高、秋季次之、春季較低、夏季樣品都未檢出。海南島海域貝類中DSP的季節(jié)性變化與浮游植物的季節(jié)變化間可能存在一定聯(lián)系。而黃翔等[4]通過分析南海海域赤潮高發(fā)期，得出南海海域近岸貝類DSP毒素陽性檢出率和超標(biāo)率在春季較高。海南島東線海域?qū)儆谀虾：Ｓ?，而西線卻在北部灣海域，這也可能是造成與之不一樣的原因。根據(jù)胡蓉等[13]的調(diào)查研究，其對不同貝類品種的季節(jié)性差異的分析，可以得出不同的貝類品種季節(jié)性的染毒情況不一樣，這也可能是取樣不同品種數(shù)量的多少，導(dǎo)致貝類季節(jié)性差異不一樣的結(jié)果。

海南島不同海域，由于潮流和風(fēng)浪的作用，可能對形成赤潮的浮游生物有很大影響?；陲L(fēng)浪和潮流條件，海南島東南海域擴(kuò)散條件不如西北海域，同時一些海灣存在沿岸流，不僅輸送浮游生物所需的營養(yǎng)物質(zhì)，還可能攜帶形成赤潮的浮游生物，因此海南島東南部的浮游甲藻較多。在此次調(diào)查中，東線海岸比西線海岸檢出率高，含量最高的出現(xiàn)在?？诤Ｓ颍瑱z出率最高是文昌。在海南島貝類養(yǎng)殖中，文昌養(yǎng)殖面積最大，產(chǎn)生大量污染物流入近岸，海域營養(yǎng)化，促使產(chǎn)毒藻類富集，增加該海域貝類染毒概率。此外沿海城市經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，使大量污染物排放到周圍水體，造成海水營養(yǎng)化導(dǎo)致赤潮發(fā)生，因此經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)的省市污染狀況往往更嚴(yán)重，這可能是含量最高的出現(xiàn)在?？诤Ｓ虻脑?。

貝類的種類對DSP的積累存在差異性。貝類自身對DSP吸攝食率以及對毒素吸收和代謝能力，是影響貝類DSP積累的重要因素之一。Viviani[21]研究發(fā)現(xiàn)，貽貝積累DSP的能力最強、扇貝次之、牡蠣的能力最弱。徐志斌等[8]研究發(fā)現(xiàn)翡翠貽貝和牡蠣染毒比例大，而吳施衛(wèi)等[7]在檢測的樣品中發(fā)現(xiàn)波紋巴非蛤超標(biāo)情況最多。楊美蘭等[14]對南海海域牡蠣體中的DSP進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果表明牡蠣是較易積累DSP的。此次研究結(jié)果顯示波紋巴非蛤檢出率最高，華貴櫛孔扇貝和翡翠貽貝次之，因此波紋巴非蛤、華貴櫛孔扇貝和翡翠貽貝較易累積DSP。有研究發(fā)現(xiàn)：有的貝類在攝食有毒藻后，累積毒素而中毒死亡；有的種類會不同程度地關(guān)閉貝殼膜瓣，收縮水管，降低攝食率就減少毒素累積；而有的種類則未發(fā)生異常反應(yīng)。因此，導(dǎo)致貝類體內(nèi)所含毒素不同[8,21]，所以不同貝類積累DSP存在一定的差異性。

總之，從監(jiān)測結(jié)果上看，海南島近岸DSP的檢出率較低，污染狀況雖然不是很嚴(yán)重，但貝毒本身在環(huán)境中存在，食用安全的潛在風(fēng)險不容忽視，對人類的影響有待進(jìn)一步研究。為了更全面了解該地區(qū)貝類毒素的特征，需要在更大的海區(qū)范圍內(nèi)選取更多的貝類進(jìn)行監(jiān)測，以確保其質(zhì)量和安全性，保障人們的飲食和生命安全。