劉雪凌，陳旭華，牛麗紅

1. 燕京理工學(xué)院（三河 065201）；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所（北京 100193）

在工業(yè)中，使用固定化復(fù)合酶提取磷脂酰膽堿比較少見。固定化酶技術(shù)的使用，不但可以提高酶的使用效率，而固定化酶還可以重復(fù)利用，減少資源消耗，降低磷脂酰膽堿的造價(jià)。此次試驗(yàn)根據(jù)之前研究結(jié)果及實(shí)驗(yàn)室條件，以殼聚糖為載體，戊二醛為交聯(lián)劑固定化復(fù)合酶，從粉碎過(guò)的革胡子鯰下腳料勻漿中提取磷脂酰膽堿，考察載體形狀、固定化復(fù)合酶加酶量、固定化酶酶解時(shí)間及酶解pH對(duì)磷脂酰膽堿提取率的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

革胡子鯰下腳料（主要為內(nèi)臟），山東榮信水產(chǎn)食品集團(tuán)股份有限公司提供；殼聚糖（分析純），山東豫之興生物科技有限公司；戊二醛（分析純），山東嘉穎化工有限公司；磷酸二氫鉀（分析純），天津市北辰方正試劑廠；鉬酸銨（分析純），上海埃彼化學(xué)試劑有限公司；對(duì)苯二酚（分析純），天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；乙酸鈉（分析純），天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；三羥甲基氨基甲烷（分析純），湖北鴻鑫瑞宇精細(xì)化工有限公司；無(wú)水乙醇（分析純），天津市恒興化學(xué)試劑有限公司；鹽酸（分析純），廊坊市金海化工有限公司；氫氧化鈉（分析純），天津成金化工銷售有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FA1004B電子分析天平（上海佑科儀器有限公司）；JJ-2組織搗碎機(jī)（金壇市萬(wàn)華實(shí)驗(yàn)儀器廠）；pH計(jì)（煙臺(tái)凱米斯儀器有限公司）；HH-6恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）；UV-1601紫外分光光度計(jì)[北京北分瑞利分析儀器（集團(tuán)）公司]。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)技術(shù)路線

魚下腳料3 g→固定化酶酶解→加入乙醇提取→過(guò)濾→提取液→鉬藍(lán)比色法測(cè)定

鉬藍(lán)比色法按GB/T5537—2008進(jìn)行。

復(fù)合酶固定方法：稱取0.2 g殼聚糖于燒杯中，然后加入1%冰醋酸攪拌均勻，分別制成球形、條狀、田字形，倒入固定液（95%乙醇與2 mol/L NaOH按照1∶4配成，V/V），固定化3 h，用去離子水沖洗干凈。將半成品載體在恒溫烘干機(jī)中50 ℃干燥1 h，之后加入到用Tris-HCl緩沖液配制的0.05%復(fù)合酶溶液中吸附2 h，最后倒入5 mL 50%戊二醛溶液交聯(lián)6 h，用去離子水水洗干凈，濾紙吸干[4]，即為固定化復(fù)合酶。復(fù)合酶為木瓜蛋白酶（添加量為0.04%）、中性蛋白酶（添加量0.03%）、胰蛋白酶（添加量為0.017 5%），另外需添加適量激活劑：標(biāo)準(zhǔn)氯化鈉溶液（添加量0.20%）[5]。

1.3.2 復(fù)合酶固定化技術(shù)提取工藝的研究

影響復(fù)合酶固定化技術(shù)提取革胡子鯰魚下腳料中磷脂酰膽堿的主要因素有載體形狀、固定化復(fù)合酶酶添加量、固定化復(fù)合酶酶解pH、固定化復(fù)合酶酶解時(shí)間。通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，確定最佳復(fù)合酶固定化技術(shù)提取磷脂酰膽堿的工藝。

2 結(jié)果與討論

2.1 影響固定化復(fù)合酶提取魚下腳料中磷脂酰膽堿的因素

2.1.1 載體形狀對(duì)磷脂酰膽堿提取的影響

取相同質(zhì)量的殼聚糖和相同體積的冰醋酸，分別制作球形、條狀、田字形三種形狀固定化復(fù)合酶進(jìn)行提取，并采用游離態(tài)的復(fù)合酶提取做對(duì)照試驗(yàn)。復(fù)合酶添加量均為0.05%。酶解時(shí)間為90 min，酶解pH為6，酶解溫度為45 ℃。其結(jié)果見圖1。

圖1 載體形狀對(duì)磷脂酰膽堿提取的影響

由圖1可知，在酶添加量0.05%，其他試驗(yàn)條件不變的情況下，田字形載體固定化酶提取率0.761%＞游離態(tài)酶提取率0.755%＞條形載體固定化酶提取率0.576%＞球形載體固定化酶提取率0.521%，田字形載體固定化酶的提取率最高?？紤]載體取出時(shí)的便捷程度與重復(fù)利用時(shí)方便轉(zhuǎn)移等因素，選擇田字形載體為最佳載體。

2.1.2 復(fù)合酶添加量對(duì)磷脂酰膽堿提取的影響

制作田字形載體，載體中固定酶的添加量按梯度分別選擇0.03%，0.04%，0.05%，0.06%和0.07%，酶解時(shí)間為90 min，酶解pH為6，酶解溫度為45 ℃，結(jié)果見圖2。

從圖2可以看出，酶添加量從0.03%到0.05%的過(guò)程中，提取率呈上升狀態(tài)，當(dāng)固定化復(fù)合酶添加量為0.05%時(shí)，提取率達(dá)到最高點(diǎn)1.200%，當(dāng)酶添加量從0.05%增加到0.07%時(shí)，提取率逐漸下降。原因可能是繼續(xù)增加酶添加量會(huì)使酶相互附著，降低載體上的固定化酶量，進(jìn)而降低提取率，故0.05%為最佳酶添加量，在接下來(lái)的單因素試驗(yàn)中統(tǒng)一使用。

圖2 復(fù)合酶添加量對(duì)磷脂酰膽堿提取的影響

2.1.3 固定化復(fù)合酶酶解時(shí)間對(duì)磷脂酰膽堿提取的影響

使用田字形載體，酶添加量0.05%，酶解pH6，酶解溫度45 ℃時(shí)，酶解時(shí)間按梯度分別選用30，60，90，120和150 min，對(duì)魚下腳料進(jìn)行提取，結(jié)果見圖3。

從圖3可以看出，當(dāng)酶解時(shí)間從30 min增加到120 min的過(guò)程中，提取率隨著酶解時(shí)間的增加而增大，在120 min時(shí)達(dá)到最高值0.849%，從120 min開始，提取率隨著酶解時(shí)間增加而減少。提取時(shí)間增加時(shí)，磷脂酰膽堿和酶均會(huì)因?yàn)檠趸冑|(zhì)，而且過(guò)長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間會(huì)使酶鈍化失活，導(dǎo)致提取率的下降。所以酶解時(shí)間取最優(yōu)值為120 min，并在接下來(lái)的單因素試驗(yàn)中統(tǒng)一使用。

圖3 固定化復(fù)合酶解時(shí)間對(duì)磷脂酰膽堿提取的影響

2.1.4 酶解pH對(duì)磷脂酰膽堿提取的影響

制作好田字形載體，統(tǒng)一使用0.05%的酶添加量和120 min酶解時(shí)間。酶解pH則按梯度分別調(diào)成4，5，6，7和8，其他提取過(guò)程均相同，結(jié)果見圖4。

圖4 酶解pH對(duì)磷脂酰膽堿提取的影響

從圖4可以得到，pH從4到5時(shí)提取率急速上升，當(dāng)pH為5時(shí)提取率達(dá)到最大值0.856%，而當(dāng)pH繼續(xù)增大時(shí)，一直對(duì)應(yīng)的提取率開始緩慢下降。復(fù)合酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，pH過(guò)高或過(guò)低均會(huì)使蛋白質(zhì)變性失活。故其最優(yōu)pH為5。

2.1.5 固定化酶的使用次數(shù)對(duì)磷脂酰膽堿提取的影響

準(zhǔn)備好田字形載體，試驗(yàn)條件設(shè)為酶添加0.05%量、酶解時(shí)間120 min、酶解pH 5，重復(fù)利用同一固定化復(fù)合酶多次，結(jié)果見圖5。

圖5 固定化酶使用次數(shù)對(duì)磷脂酰膽堿提取的影響

由圖5可知，第一次使用時(shí)提取率最高，以后每次重復(fù)使用時(shí)，提取率都比上一次使用時(shí)降低0.005%～ 0.007%，而重復(fù)使用到第8次的時(shí)候，提取率已經(jīng)不足第一次使用的一半。從成本和提取效率考慮，一份固定化酶使用4～5次為最佳。

2.2 用固定化復(fù)合酶提取革胡子鯰下腳料中磷脂酰膽堿的最佳工藝確定

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選用乙醇作為提取溶劑，載體為田字格形狀，提取溫度為45 ℃，對(duì)（A）固定化復(fù)合酶添加量（0.04%，0.050%和0.06%）、（B）固定化復(fù)合酶酶解pH（5，6和7）、（C）固定化復(fù)合酶酶解時(shí)間（60，90和120 min）3個(gè)因素在3個(gè)水平上進(jìn)行優(yōu)選，采用L9(33)進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果見表1。

由表1可知，從極差R值看，對(duì)提取率的影響大小次序?yàn)楣潭ɑ瘡?fù)合酶解pH（B）＞固定化復(fù)合酶解時(shí)間（C）＞固定化復(fù)合酶添加量（A），由此可見固定化復(fù)合酶解pH為提取魚下腳料中磷脂酰膽堿試驗(yàn)中最顯著的影響因素。由表1還可知，固定化復(fù)合酶提取魚下腳料中磷脂酰膽堿試驗(yàn)最佳組合條件為A2B1C2，即酶添加量為0.05%，酶解pH為5，酶解時(shí)間為90 min。

表1 正交試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)固定化復(fù)合酶解技術(shù)提取魚下腳料中的磷脂酰膽堿的研究，得出如下結(jié)論：

1) 載體的形狀對(duì)于固定化復(fù)合酶的提取效率有著顯著影響，從復(fù)合酶在載體上的吸附面積和固定化酶與原料的接觸面積、易于取出等幾個(gè)方面共同考慮，經(jīng)過(guò)試驗(yàn)，得出結(jié)論：在相同條件下，田字形載體固定化復(fù)合酶提取效率最高，更易于取出與重復(fù)使用。

2) 經(jīng)過(guò)單因素試驗(yàn)，分別從復(fù)合酶添加量、酶解pH、酶解時(shí)間三個(gè)方面研究固定化復(fù)合酶提取魚下腳料中的磷脂酰膽堿的影響因素，最終得出結(jié)論：固定化復(fù)合酶最適酶添加量為0.05%，最適pH為5，最佳酶解時(shí)間為120 min。

3) 通過(guò)三因素三水平的正交試驗(yàn)，可以得出結(jié)論：固定化復(fù)合酶的最適加酶量為0.05%，最適pH為5，最佳酶解時(shí)間為90 min。

4) 由載體重復(fù)利用試驗(yàn)可知，每個(gè)載體重復(fù)利用至第8次或第9次時(shí)，提取率才會(huì)降低至第一次使用時(shí)一半。

5) 經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的成本核算，一個(gè)酶添加量為0.05%的田字形固定化酶提取率約為相同質(zhì)量無(wú)載體酶的5～6倍，雖然成本是其4～5倍，但從試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，固定化酶技術(shù)比傳統(tǒng)的酶解法提取磷脂酰膽堿更加高效環(huán)保。

從試驗(yàn)來(lái)看，固定化復(fù)合酶技術(shù)在很多方面都優(yōu)于其他技術(shù)，未來(lái)必將有廣闊的市場(chǎng)前景。