殷小雪，杜慧慧*，陳煥，秦洪文，江鴻翎，劉行

重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院（重慶 404120）

檸檬[Citrus limon（L.）Burm.f.]屬于蕓香科柑橘屬常綠小喬木，喜溫耐陰不耐寒[1]。根據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，F(xiàn)AO）數(shù)據(jù)庫(kù)統(tǒng)計(jì)，2019年中國(guó)檸檬種植面積約16萬(wàn) hm2[2-3]。萬(wàn)州區(qū)位于長(zhǎng)江上游結(jié)合部，三峽庫(kù)區(qū)腹地，氣候冬暖夏涼，適合栽植檸檬。萬(wàn)州作為中國(guó)重要的檸檬三大產(chǎn)區(qū)之一，已有60年的種植歷史，2020年種植面積達(dá)0.67萬(wàn) hm2以上[4]。檸檬中不僅富含多種維生素，還含有大量檸檬酸，其果汁中維生素C含量達(dá)76 mg/100 mL。檸檬具有殺菌、美容、穩(wěn)定情緒、提神、化痰止咳、生津健胃、降低膽固醇、促進(jìn)牙齒生長(zhǎng)、防止牙齦出血、預(yù)防壞血病和心血管動(dòng)脈硬化等功效[5-7]。

由于感官評(píng)定易受評(píng)價(jià)人員的主觀影響，導(dǎo)致感官結(jié)果誤差大，故采用模糊數(shù)學(xué)法與感官評(píng)價(jià)相結(jié)合，使感官指標(biāo)數(shù)字化，保證結(jié)果的科學(xué)可靠[8-9]。另外，食品品質(zhì)影響因素眾多，可通過(guò)主成分分析法（PCA）對(duì)主要因素進(jìn)行分析，并建立數(shù)學(xué)模型，從而得到的產(chǎn)品綜合評(píng)價(jià)更加準(zhǔn)確[10-11]。

試驗(yàn)以三峽庫(kù)區(qū)尤力克檸檬為主要原料，應(yīng)用模糊數(shù)學(xué)感官評(píng)價(jià)法從色澤、香氣、滋味和風(fēng)格4個(gè)方面真實(shí)客觀評(píng)價(jià)檸檬發(fā)酵酒，對(duì)檸檬發(fā)酵酒模糊感官評(píng)分、酒精度、總糖含量、總酸含量等進(jìn)行主成分分析，建立綜合評(píng)價(jià)模型，并結(jié)合正交試驗(yàn)優(yōu)化檸檬酒釀造工藝流程，為檸檬的深加工利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

尤力克檸檬（重慶市萬(wàn)州區(qū)橫山村采摘）；安琪耐高溫釀酒高活性干酵母（食用級(jí)，安琪酵母股份有限公司）；白砂糖（永輝超市購(gòu)買）；玻璃層析柱（30 mm×500 mm，宸喬科技有限公司）。

1.2 試驗(yàn)試劑

β-環(huán)狀糊精（食品級(jí)，浙江一諾生物科技有限公司）；大孔弱堿性陰離子交換樹(shù)脂（D318、D301G、D301、D315）、弱堿性環(huán)氧系陰離子交換樹(shù)脂（330，鄭州和成新材料科技有限公司）；DNS試劑（化學(xué)純）、鄰苯二甲基氫鉀（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；氫氧化鈉、鹽酸（分析純，上海麥克林生化科技有限公司）。

1.3 儀器與設(shè)備

電子天平（瑞安市樂(lè)祺貿(mào)易有限公司）；pH-100型pH計(jì)（上海力辰邦西儀器科技有限公司）；HT-512ATC型糖度計(jì)（上海丙?？萍加邢薰荆?；果酒專用型酒精計(jì)（煙臺(tái)帝伯仕自釀機(jī)有限公司）；精密膜過(guò)濾器（煙臺(tái)帝伯仕自釀機(jī)有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；SP-756型可見(jiàn)光分光光度計(jì)（上海菁華科技儀器有限公司）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 工藝流程

檸檬鮮果→去皮、瓤、籽→滅菌→裝罐→配料、接種→主發(fā)酵→后發(fā)酵→陳釀→澄清→過(guò)濾→裝瓶

1.4.2 操作要點(diǎn)

選擇完全成熟、無(wú)蟲(chóng)害、無(wú)霉?fàn)€的檸檬鮮果，40℃流水沖洗，將附著在檸檬上的土壤、微生物以及殘留的農(nóng)藥清洗干凈。剝?nèi)ス?、果瓤和籽，得到檸檬果肉。調(diào)整糖度，按一定的料液比裝罐，裝至發(fā)酵罐容積的80%。接入活化后的酵母溶液，攪拌充分。在25 ℃密閉環(huán)境下發(fā)酵。待發(fā)酵醪液面上升，表示主發(fā)酵開(kāi)始，每日測(cè)定發(fā)酵罐中的各項(xiàng)理化指標(biāo)。直至可溶性固形物及pH無(wú)變化時(shí)，主發(fā)酵結(jié)束[12]。經(jīng)后發(fā)酵[13]，根據(jù)NY/T 1508—2017《綠色食品果酒》放置于干凈通風(fēng)的貯酒室進(jìn)行陳釀。隨后添加澄清劑使檸檬果酒中的雜質(zhì)沉淀，液體澄清；采用精密膜過(guò)濾器，去除細(xì)小雜質(zhì)[14]。

1.4.3 理化指標(biāo)測(cè)定

pH，參照GB 5009.237—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品pH的測(cè)定》；可溶性固形物，按手持糖度計(jì)法測(cè)定；總糖含量，按DNS試劑法測(cè)定；總酸含量，按酸堿滴定法測(cè)定；酒精度，按酒精計(jì)法測(cè)定，參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》。

1.4.4 模糊數(shù)學(xué)感官評(píng)價(jià)

設(shè)檸檬果酒的評(píng)價(jià)因素集合為U=（u1，u2，u3，u4），u1、u2、u3和u4分別代表檸檬果酒的色澤、香氣、滋味和風(fēng)格。建立評(píng)價(jià)評(píng)語(yǔ)集合。設(shè)檸檬果酒的評(píng)價(jià)評(píng)語(yǔ)集合為V=（v1，v2，v3，v4）=（90，80，70，60），v1、v2、v3和v4分別代表優(yōu)、良、中和差4個(gè)等級(jí)，每個(gè)等級(jí)分別對(duì)應(yīng)90，80，70和60分。通過(guò)采用強(qiáng)制決定法[15]確定檸檬果酒的權(quán)重集合W=（w1，w2，w3，w4）=（0.3，0.2，0.4，0.1），即色澤、香氣、滋味和風(fēng)格分別占比0.3，0.2，0.4和0.1。由10名評(píng)價(jià)人員按表1標(biāo)準(zhǔn)對(duì)檸檬果酒進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，假設(shè)檸檬果酒得分情況如表2所示。

表1 檸檬果酒感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

表2 檸檬果酒感官評(píng)價(jià)得分情況匯總表

1.4.5 矩陣變換及模糊感官綜合評(píng)價(jià)

通過(guò)將表中數(shù)據(jù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化即可得到檸檬果酒的模糊感官評(píng)價(jià)得分矩陣R。

令模糊感官的綜合評(píng)分集合為Y，根據(jù)模糊變換原理Y=W×R，即矩陣變化如式（2）所示。

檸檬果酒的模糊感官評(píng)分為綜合評(píng)分集合Y與評(píng)語(yǔ)集合V的乘積，即模糊感官評(píng)分T=Y×V[16]。

1.4.6 單因素試驗(yàn)

將檸檬果酒的基本條件設(shè)置為主發(fā)酵溫度25 ℃、糖度25%、酵母添加量0.12%、料液比1∶0 g/mL、發(fā)酵時(shí)間15 d。按照上述試驗(yàn)流程及操作要點(diǎn)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，分別研究糖度（17%，18%，19%，20%和21%）、酵母添加量（0.08%，0.10%，0.12%，0.14%和0.16%）、料液比（1∶0，1∶0.1，1∶0.2，1∶0.3和1∶0.4 g/mL）和發(fā)酵時(shí)間（11，13，15，17和19 d）對(duì)檸檬果酒模糊感官評(píng)分的影響。

1.4.7 正交試驗(yàn)

采取小組評(píng)分法，確定10名評(píng)定人員進(jìn)行模糊感官評(píng)定。以檸檬果酒的模糊感官評(píng)分作為評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，分析檸檬果酒的單因素試驗(yàn)結(jié)果，制定各因素正交試驗(yàn)水平（表3）。

表3 正交試驗(yàn)因素水平表

1.5 超高效液相色譜測(cè)定類黃酮含量分析

1.5.1 樣品預(yù)處理

檸檬果酒充分搖勻，吸取1 mL提取液，過(guò)0.22 μm親水性PTFE膜到2 mL進(jìn)樣小瓶，待測(cè)。

1.5.2 儀器條件

UPLC檢測(cè)主要參考趙梓燕[17]的方法。具體方法：使用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm，Waters，美國(guó)），以0.1%甲酸水溶液（A）和甲醇（B）作為流動(dòng)相，梯度洗脫，分離條件為0～0.6 min，10%～20% B；0.6～5.0 min，20%～70% B；5.0～7.0 min，70%～90% A；流速0.4 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣體積1 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)283 nm（黃烷酮）和330 nm（PMFs）。

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用軟件SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

糖度對(duì)檸檬酒模糊感官評(píng)分的影響如圖1（A）所示。糖度20%時(shí)，其模糊感官評(píng)分值最高，其色澤、香氣、滋味、風(fēng)格都達(dá)到最佳。

酵母添加量對(duì)檸檬酒模糊感官評(píng)分的影響如圖1（B）所示。酵母添加量0.14%時(shí)，其模糊感官評(píng)價(jià)分達(dá)到最高值。

檸檬果酒的模糊感官評(píng)分隨著料液比變大呈現(xiàn)先增加后減小趨勢(shì)，料液比1∶0.2 g/mL時(shí)，檸檬果酒模糊感官評(píng)分達(dá)到最大（圖1C）。料液比的增加會(huì)使檸檬果酒的透明度、色澤逐漸變好。

當(dāng)發(fā)酵時(shí)間小于15 d時(shí)，檸檬酒渾濁、無(wú)光，無(wú)明顯的酒香，滋味偏酸澀，酒體風(fēng)格不協(xié)調(diào)。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間大于15 d，檸檬酒色澤偏淡，滋味由于檸檬過(guò)度發(fā)酵而導(dǎo)致苦澀，檸檬果酒的模糊感官評(píng)分下降。由圖1（D）可知，最適發(fā)酵時(shí)間為15 d。

圖1 檸檬酒發(fā)酵中單因素結(jié)果

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表4可知，5號(hào)試驗(yàn)產(chǎn)品的模糊感官評(píng)分最高，對(duì)應(yīng)的試驗(yàn)組為A2B2C3D1，極差的結(jié)果顯示RB＞RA＞RD＞RC，表明酵母添加量對(duì)產(chǎn)品的影響最大，糖度和發(fā)酵時(shí)間的影響程度次之，料液比對(duì)檸檬果酒的模糊感官評(píng)價(jià)影響最小。通過(guò)k值的大小可得到其最優(yōu)比為A2B2C2D1。

表4 正交試驗(yàn)樣品模糊感官評(píng)分

2.3 正交試驗(yàn)樣品PCA綜合得分正交結(jié)果分析

由表5可知，極差分析結(jié)果顯示RB＞RA＞RD＞RC，結(jié)果表明各因素對(duì)檸檬果酒的PCA分析綜合得分的影響程度為酵母添加量＞糖度＞發(fā)酵時(shí)間＞料液比。檸檬果酒的最優(yōu)配方為A2B2C3D1，即糖度20%、酵母添加量0.13%、料液比1∶0.3 g/mL、發(fā)酵時(shí)間13 d。正交試驗(yàn)的最優(yōu)配方在正交試驗(yàn)組中，其PCA綜合得分為0.94。對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析（表6）得到糖度、酵母添加量、料液比對(duì)檸檬果酒的PCA綜合得分的影響極顯著（p＜0.05）。表7顯示不同發(fā)酵組的總酸、總糖和酒精度存在差異。

表5 PCA正交試驗(yàn)綜合得分

表6 方差分析表

表7 檸檬酒感官指標(biāo)和理化指標(biāo)結(jié)果

2.4 試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果分析

根據(jù)正交試驗(yàn)中k值的大小得到檸檬果酒的最優(yōu)比為A2B2C2D1，即糖度20%、酵母添加量0.13%、料液比1∶0.2 g/mL、發(fā)酵時(shí)間13 d，通過(guò)主成分分析正交試驗(yàn)樣品得到的檸檬果酒的綜合得分最佳比為A2B2C3D1，即糖度20%、酵母添加量0.13%、料液比1∶0.3 g/mL、發(fā)酵時(shí)間13 d，由于2組試驗(yàn)的基本條件不同，進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)每組做平行試驗(yàn)3次。經(jīng)過(guò)感官評(píng)定，A2B2C3D1果酒色澤呈橙黃色、澄清透明，有明顯的檸檬清香和酒香，香氣協(xié)調(diào)怡人，酸甜適口、醇厚純凈、無(wú)異味，酒體協(xié)調(diào)，典型極佳風(fēng)格良好，模糊數(shù)學(xué)感官評(píng)分82.63±0.09分，酒精度11.8%±0.2%vol；A2B2C2D1果酒色澤呈橙黃色、澄清透明，檸檬清香和酒香協(xié)調(diào)性一般，口感醇厚純凈，酒體協(xié)調(diào)，風(fēng)格良好，模糊數(shù)學(xué)感官評(píng)分80.12±0.12分，酒精度9.5%±0.1%vol。經(jīng)過(guò)驗(yàn)證性試驗(yàn)A2B2C3D1組從感官以及酒精度都優(yōu)于A2B2C2D1組。

2.5 有效成分含量測(cè)定

將最優(yōu)工藝發(fā)酵的檸檬果酒置于10 ℃條件下陳釀120 d，使用超高效液相色譜法測(cè)定發(fā)酵檸檬果酒中含有圣草次苷455.685 mg/L、蕓香苷4.566 mg/L、柚皮苷12.365 mg/L、橙皮苷6.483 mg/L、新橙皮苷42.411 mg/L、地奧司明11.077 mg/L和柚皮素2.882 mg/L。

3 結(jié)論

由主成分綜合評(píng)價(jià)模型和正交試驗(yàn)獲得最優(yōu)配方為糖度20%、酵母添加量0.13%、料液比1∶0.3 g/mL、發(fā)酵時(shí)間13 d，其感官和酒精度較好，顏色呈橙黃色，澄清透明，具有檸檬清香和酒香，酒精度為11.8%±0.2%vol，且含有圣草次苷455.685 mg/L、蕓香苷4.566 mg/L、柚皮苷12.365 mg/L、橙皮苷6.483 mg/L、新橙皮苷42.411 mg/L、地奧司明11.077 mg/L和柚皮素2.882 mg/L，具有較好的食用及保健價(jià)值。